Vi presenterar ett effektivt och lätt-till-använda protokoll för att förbereda primära cellkulturer av zebrafisk embryon för transfection och levande cell imaging samt ett protokoll att förbereda primära celler från vuxna zebrafiskar hjärna.
Zebrafiskar embryon är transparenta och utvecklas utanför mamman, vilket möjliggör utmärkta i vivo imaging av dynamiska biologiska processer i en intakt och utveckla ryggradsdjur. Den detaljerad avbildning av morfologier av olika celltyper och subcellulära strukturer är dock begränsad i hela fästen. Därför etablerade vi en effektiv och lätt-till-använda protokollet till kultur levande primära celler från zebrafisk embryon och adult vävnad.
I korthet är 2 dpf zebrafiskar embryon dechorionated, deyolked, steriliseras och dissocierade att enstaka celler med kollagenas. Efter en filtrering steg är primära celler pläterade på glas botten rätter och odlat i flera dagar. Färsk kulturer, som lång sikt differentierade sådana, kan användas för högupplösta confocal imaging studier. Kultur innehåller olika celltyper, med tvärstrimmig myocyter och nervceller att vara framträdande på poly-L-lysin beläggning. Specifikt etikett subcellulära strukturer av fluorescerande markör proteiner etablerat vi också en elektroporation protokoll som möjliggör transfection av plasmid DNA till olika celltyper, däribland nervceller. Således, i närvaro av operatören definierade stimuli, komplexa cell beteende och intracellulära dynamics av primära zebrafiskar celler kan bedömas med hög rumsliga och temporal upplösning. Dessutom, med hjälp av vuxen zebrafiskar hjärnan, visar vi att tekniken som beskrivs dissociation, liksom culturing grundförutsättningarna, också arbeta för vuxna zebrafiskar vävnad.
Zebrafiskar (Danio rerio, D. rerio) är en populär modell ryggradsdjur för många fält av grundläggande och biomedicinsk forskning1. Zebrafiskar embryon utvecklas snabbt ex utero, är transparent, och passar i Mikroskop, vilket ger utmärkta förutsättningar för att studera ryggradsdjur utveckling i en levande organism. På grund av den genetiska tractability zebrafiskar2, har många stabila transgena reporter rader med cell typspecifika uttryck för olika fluorescerande markörer fastställts möjliggör observation av specifika cellpopulationer. Zebrafiskar gemenskapen erbjuder ett brett utbud av så kallade Gal4-driver-linjer som bär en transgene som uttrycker den syntetiska Kal4TA4 (eller den KalTA3-motsvarande GalFF) genen med Gal4-DNA-bindande domänen för jästen smält till viral transkriptionell aktiveringen domäner under kontroll av cell typspecifika smakförstärkare. Dessa förare linjer korsas till effektor linjer som bär transgener som består av en definierad uppströms aktiverande sekvens (UAS) smält till en reporter gen. Kal4TA4 proteinet binder till elementet UAS, alltså aktivera cellen typ-selektiv uttrycket av reporter gen3,4. Detta tillvägagångssätt möjliggör mycket skiftande kombinatoriska studier av nästan alla tillgängliga enhancer och reporter element i dubbel-transgena djur.
Djupgående levande imaging med fokus på enskilda celler eller subcellulär innehållet begränsas dock i ett hela och ständigt föränderliga embryo. För att lösa specifika cellen biologiska frågor med högsta upplösning, är användningen av cellkulturer ofta att föredra. Vissa cellinjer av zebrafisk finns, men de är ansedda som kraftigt markerade5,6,7 och deras förökning är ofta tidskrävande. Dessutom cellinjerna alla de tillgängliga fibroblast härrör, begränsa experiment med cellkultur till en typ av celler. Därför etablerat vi både ett effektivt och lätt-till-använda protokoll för att förbereda primära celler direkt från zebrafisk embryon och vuxen zebrafiskar hjärnan, tillsammans med metoder att öka livslängden på kulturen och att bredda mångfalden av odlade celltyper. Dessutom presenterar vi ett förfarande för att transfect embryonala primära celler med uttrycket konstruktioner för fluorescerande organell markörer. Således, cellulära morfologier och subcellulära strukturer kan analyseras med hög rumsliga och temporal upplösning i olika celltyper som behåller sin viktiga funktioner.
Här presenterar vi två olika protokoll till kultur primära celler från antingen 2 dpf zebrafiskar embryon eller vuxen zebrafiskar hjärnan.
Beredning av primära cellkulturer från 2 dpf zebrafiskar är relativt lätt att utföra för alla med erfarenhet av grundläggande cell kultur tekniker. Men för att få bra och reproducerbara resultat, ett tillräckligt antal embryon som utgångsmaterial är avgörande (100 är minst). Under anskaffandet av embryon, måste alla möjliga källor till…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar T. Fritsch, A. Wolf-Asseburg, I. Linde och S.-M. Tokarski för utmärkt djurvård och teknisk support. Vi är tacksamma för alla medlemmar i Köster labbet för intensiv och bra diskussioner. Vi erkänner tacksamt finansiering genom den Deutsche Forschungsgemeinschafts (KO 1949/5-1) och delstaten Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Fish lines | ||||||
AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | |||||
Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | |||||
Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | |||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Equipment | ||||||
centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | ||||
ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | ||||
confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective | ||||
epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective | ||||
Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device | |||
Horizontal shaker | GFL | model 3011 | ||||
incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | ||||
incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | ||||
light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | ||||
micro pipettes | Gilson | |||||
sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | ||||
tweezers | Dumont | Style 5, Inox | ||||
vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Software | ||||||
Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | ||||
ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | ||||
LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Plasmids | ||||||
pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene | |||
Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | ||||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Plastic and glass ware | ||||||
BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium | |||
1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | ||||
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | ||||
50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | ||||
96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | ||||
EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation | |||
electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | ||||
glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | ||||
Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | ||||
Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | ||||
Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | ||||
Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos | |||
pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | ||||
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | ||||
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | ||||
sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Chemicals and Reagents | ||||||
sodium chloride | Roth | 0601.1 | ||||
4 % paraformaldehyde in 1 x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | ||||
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | ||||
calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | ||||
ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | ||||
goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | ||||
HEPES | Roth | 9105.4 | ||||
high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes | |||
magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | ||||
methylene blue | Serva | 29198.01 | ||||
Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | ||||
Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | ||||
poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | ||||
potasssion chloride | Merck | 104938 | ||||
Skim milk | Roth | 68514-61-4 | ||||
Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | ||||
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | |||
Triton X-100 | BioRad | 1610407 | ||||
Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Enzymes | ||||||
collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C | |||
pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Medium and solutions for cell culture | ||||||
1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | ||||
glutamine 100 x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
PenStrep (10,000 units/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |