Summary
Vi presenterar ett effektivt och lätt-till-använda protokoll för att förbereda primära cellkulturer av zebrafisk embryon för transfection och levande cell imaging samt ett protokoll att förbereda primära celler från vuxna zebrafiskar hjärna.
Abstract
Zebrafiskar embryon är transparenta och utvecklas utanför mamman, vilket möjliggör utmärkta i vivo imaging av dynamiska biologiska processer i en intakt och utveckla ryggradsdjur. Den detaljerad avbildning av morfologier av olika celltyper och subcellulära strukturer är dock begränsad i hela fästen. Därför etablerade vi en effektiv och lätt-till-använda protokollet till kultur levande primära celler från zebrafisk embryon och adult vävnad.
I korthet är 2 dpf zebrafiskar embryon dechorionated, deyolked, steriliseras och dissocierade att enstaka celler med kollagenas. Efter en filtrering steg är primära celler pläterade på glas botten rätter och odlat i flera dagar. Färsk kulturer, som lång sikt differentierade sådana, kan användas för högupplösta confocal imaging studier. Kultur innehåller olika celltyper, med tvärstrimmig myocyter och nervceller att vara framträdande på poly-L-lysin beläggning. Specifikt etikett subcellulära strukturer av fluorescerande markör proteiner etablerat vi också en elektroporation protokoll som möjliggör transfection av plasmid DNA till olika celltyper, däribland nervceller. Således, i närvaro av operatören definierade stimuli, komplexa cell beteende och intracellulära dynamics av primära zebrafiskar celler kan bedömas med hög rumsliga och temporal upplösning. Dessutom, med hjälp av vuxen zebrafiskar hjärnan, visar vi att tekniken som beskrivs dissociation, liksom culturing grundförutsättningarna, också arbeta för vuxna zebrafiskar vävnad.
Introduction
Zebrafiskar (Danio rerio, D. rerio) är en populär modell ryggradsdjur för många fält av grundläggande och biomedicinsk forskning1. Zebrafiskar embryon utvecklas snabbt ex utero, är transparent, och passar i Mikroskop, vilket ger utmärkta förutsättningar för att studera ryggradsdjur utveckling i en levande organism. På grund av den genetiska tractability zebrafiskar2, har många stabila transgena reporter rader med cell typspecifika uttryck för olika fluorescerande markörer fastställts möjliggör observation av specifika cellpopulationer. Zebrafiskar gemenskapen erbjuder ett brett utbud av så kallade Gal4-driver-linjer som bär en transgene som uttrycker den syntetiska Kal4TA4 (eller den KalTA3-motsvarande GalFF) genen med Gal4-DNA-bindande domänen för jästen smält till viral transkriptionell aktiveringen domäner under kontroll av cell typspecifika smakförstärkare. Dessa förare linjer korsas till effektor linjer som bär transgener som består av en definierad uppströms aktiverande sekvens (UAS) smält till en reporter gen. Kal4TA4 proteinet binder till elementet UAS, alltså aktivera cellen typ-selektiv uttrycket av reporter gen3,4. Detta tillvägagångssätt möjliggör mycket skiftande kombinatoriska studier av nästan alla tillgängliga enhancer och reporter element i dubbel-transgena djur.
Djupgående levande imaging med fokus på enskilda celler eller subcellulär innehållet begränsas dock i ett hela och ständigt föränderliga embryo. För att lösa specifika cellen biologiska frågor med högsta upplösning, är användningen av cellkulturer ofta att föredra. Vissa cellinjer av zebrafisk finns, men de är ansedda som kraftigt markerade5,6,7 och deras förökning är ofta tidskrävande. Dessutom cellinjerna alla de tillgängliga fibroblast härrör, begränsa experiment med cellkultur till en typ av celler. Därför etablerat vi både ett effektivt och lätt-till-använda protokoll för att förbereda primära celler direkt från zebrafisk embryon och vuxen zebrafiskar hjärnan, tillsammans med metoder att öka livslängden på kulturen och att bredda mångfalden av odlade celltyper. Dessutom presenterar vi ett förfarande för att transfect embryonala primära celler med uttrycket konstruktioner för fluorescerande organell markörer. Således, cellulära morfologier och subcellulära strukturer kan analyseras med hög rumsliga och temporal upplösning i olika celltyper som behåller sin viktiga funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbete beskrivs här är i enlighet med rättsliga bestämmelser (EU-direktiv 2010/63). Underhåll och hantering av fisk har godkänts av lokala myndigheter och djurens välbefinnande representant Braunschweig tekniska högskolan och lägre Sachsen statligt kontor för konsumentskydd och livsmedelssäkerhet (LAVES, Oldenburg, Tyskland; AZ. §4 (02.05) TSchB TU BS).
1. beredning av primära celler från embryon som zebrafisk
- Beredning av 2 dagar efter befruktning (dpf) zebrafiskar embryon
- Dag 1: Ställa in flera korsningar zebrafiskar stam av val och enligt specifikationerna i din zebrafiskar facility manager8.
- Dag 2: Mate fisk och samla ägg8 direkt efter leken i en 10 cm petriskål (plast). Ta bort döda eller kontaminerade ägg med en Pasteur-pipett (plast). Tvätta ägg 1 x med Danieau 30% (5,8 mM natriumklorid, 0,07 mM kaliumklorid, 0,04 mM magnesiumsulfat, 0,06 mM kalciumnitrat, 5 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syra, pH 7,2)8 med 0,0001% (w/v) metylenblått. Utbyta medellång till Danieau 30% utan metylenblått, eftersom metylenblått kan orsaka autofluorescens, och inkubera ägg över natten vid 28 ° C.
Obs: Börja med minst 100 ägg per fisk rad för att få en tillräcklig mängd celler. Höj inte mer än 150 embryon i en petriskål. - Dag 3: Ta bort döda eller kontaminerade embryon och utbyta medellång till Danieau 30%. Bestämma antalet embryon genom att räkna. Inkubera embryon över natten vid 28 ° C.
Obs: När du använder en transgena linje som uttrycker en fluorescerande reporter, screening vid 1 dpf eller 2 dpf kan vara nödvändigt.
Obs: För större mängder embryon, det rekommenderas att ta en svartvit bild av respektive petriskål (figur 1A) och kvantifiera antalet embryon med ett bildprogram. - Dag 4: Embryon är nu 2 dpf. Ta bort chorions, tillsätt 1 mL pronase med en koncentration av 1 mg/mL till 10 mL Danieau 30%8 och inkubera embryon på en shaker i rumstemperatur tills alla chorions är fristående (20 – 40 min beroende på omgivningstemperatur). Tvätta med Danieau 30% ta bort både pronase och chorions och förvara embryon i rumstemperatur tills vidare användning.
- Beredning av återanvändbara poly-L-lysin belagt glas botten rätter
Obs: Kommersiellt tillgängliga glas botten rätter är avsedda för engångsbruk och är dyra. Följande procedur beskriver hur du förbereder återanvändbara self-made glas botten rätter från standard lab material.- Borra ett hål med en diameter på 10 mm i botten av standard cell kultur rätter (diameter 6 cm, plast), (figur 1B). Tvätta skålen bottnar noggrant med kranvatten för att ta bort borrning damm.
- Sprida silikonfett runt hålet på undersidan av skålen bottnar och bifoga ett täckglas som använder fettet som lim. Kontrollera att fettet förseglar klyftan mellan skålen botten och täckglas.
Kontrollera att tjockleken på den begagnade coverslips är lämplig för den senare bildprogram. - Diska self-made glas botten grundligt, men försiktigt, med kallt kranvatten och tvål. Skölj glas botten rätter tre gånger med avjoniserat vatten för att avlägsna tvål. Lufttorka maträtt lock och skålen bottnar och förvara dem i en ren låda tills vidare användning.
- På kultur förberedelsedagen (dag 4, se 1.1.4): Fukta insidan av både skålen lock och skålen bottnar med 70% (v/v) etanol. Placera skålen lock och skålen bottnar inför den inre sidan i en steril arbetsbänk med laminärt flöde och UV-ljus. Lufttorka tills etanolen är avdunstat, applicera UV-ljus för 20 min sedan. Efter denna behandling, rätter monteras och betraktas som sterilt.
- För beläggning, Pipettera 200 µL av poly-L-lysin (0,1 mg/mL) i mitten av varje glas botten maträtt och sprida vätskan på täckglaset genom att bryta ytspänningen med en pipettspetsen. Låt torka i 60 min och sedan tvätta 1 x med steril 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Avlägsna vätskan. Hålla rätter under bänken tills vidare användning.
Obs: Andra beläggningar kan provas beroende på syftet med experimentet. Vi hittade poly-L-lysin tillräckligt för att stödja tillväxten av nervceller, medan behandlade plast utan någon ytterligare beläggning föreföll vara gynnsamma för tillväxten av fibroblast-liknande celler (figur 1E, F).
Obs: Self-made glas botten rätter kan användas många gånger. För att utbyta täckglaset, tvätta med varmt kranvatten, försiktigt lossa täckglaset och avlägsna återstående fett med 70% (v/v) etanol och tvål.
- Förberedelse och plätering av primära celler
- På kultur förberedelsedagen (dag 4, se 1.1.4): överföra embryon till en steril cell kultur maträtt (diameter 6 cm) med hjälp av en färsk plast Pasteur-pipett. Avlägsna vätskan överläggsgrafer tills alla embryon är samlade i en stor droppe med en diameter på ca 2 cm eller mindre.
- Placera skålen med embryon i den sterila arbetsbänk och tillsätt CO2-oberoende medium (kompletteras med 10% (v/v) filtermediat bovint serum, 1 x glutamin och 1,2% (v/v) 10.000 U Penicillin-Streptomycin; medium med alla tillskott är i följande kallad ”cellodlingsmedium”) tills skålen är halvfylld.
Obs: Alternativ till CO2-oberoende medium kan testas beroende på syftet med experimentet, som till exempel neurobasal medium, DMEM medium eller Leibovitzs l-15 medium. CO2-oberoende medium och Leibovitzs l-15 medium har fördelen av att inte kräva en CO2 inkubator. - Ta bort äggulan, pipett embryon upp och ner med en 200 µL-pipettspetsen. Framgångsrika deyolking kan kännas igen av grumling av mediet.
- Fylla en cell kultur skålen med 70% (v/v) etanol och en annan cell kultur skålen med färska cellodlingsmedium. Använd en cut-off 1000 µL-pipettspetsen vill överföra embryon till en steril cell SIL med handtag (40 µm; Figur 1 c). Ta silen i handtaget och doppa det i skålen med etanol så att alla embryon är nedsänkt för 5 s. omedelbart efteråt doppa silen med embryon i skålen med färska cellodlingsmedium.
Obs: Cell silar kan återanvändas flera gånger. Rengör med en mjuk borste under rinnande kranvatten, lagra dem i 70% etanol och torr och UV-behandla dem under sterila arbete bänk direkt före användning (se även 1.2.4). - Överföra embryon till sterila 1,5 mL reaktionsrören (cirka 100 embryon i en tub). Lägg till kollagenas (typ 2) utspätt i cellodlingsmedium till en slutlig koncentration på 4 mg/mL i en total volym om 1 mL. Inkubera rören med embryon på ett vertikalt rör rotator med 30 varv per min för 45 min i rumstemperatur.
- Separera återstående cell klumpar av pipettering embryo-kollagenas blandningen upp och ner med en 1000 µL-pipettspetsen. Filtrera sedan cellsuspensionen genom en steril cell SIL med avluftning slot (40 µm; Figur 1 d) i en 50 mL konisk tub. Skölj silen med ca 10 mL av färska cellodlingsmedium.
- Pellet celler genom centrifugering för 3 min på 180 x g. Pelleten kan vara nästan osynlig. Försiktigt avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 200 µL färska cellodlingsmedium per 30 ursprungligen använda embryon.
Obs: För att få en synlig pellet, det rekommenderas att starta med ett minimum av 100 embryon. - Tillsätt 200 µL cellsuspension erhölls i steg 1.3.7 direkt på området glas i en self-made poly-L-lysin-belagda glas botten maträtt (se 1.2). Inkubera i 60 min i rumstemperatur under den sterila arbetsbänk. Tillsätt 6 mL färsk cellodlingsmedium och inkubera primära celler vid 28 ° C.
- Utföra den önskade bildprogram som använder ett inverterat Mikroskop vid 28 ° C. Utbyta cellodlingsmedium dagligen. Kulturer kan användas för avbildning för flera dagar efter plätering (dap).
Figur 1: primära cellkulturer av zebrafisk embryon. (A) svartvit bild 1 dap embryon, som kan bearbetas av en programvaruverktyg för att analysera antalet embryon. (B) Cell kultur rätter (diameter 6 cm) med ett borrat hål (diameter 10 mm) används för att förbereda återanvändbara self-made glas botten rätter. (C) Cell silar (40 µm) med ett enkelt handtag används som ”håvar” att doppa deyolked embryon i etanol och överföra dem snabbt till färska cellodlingsmedium. (D) Cell silar (40 µm) med avluftning slots används för att filtrera celler efter kollagenas-medierad dissociation. (E) efter 5 dap, primärceller seedade på glas belagd med poly-L-lysin primärt bilda nervceller med uttalad filändelser. Skalstapeln = 100 µm. (F) efter 5 dap på behandlade plast utan beläggning, fibroblast-liknande celler växa över kulturen. Skalstapeln = 100 µm. (E) och (F) förvärvades av en epifluorescerande mikroskopet. (G) överförda ljus bild av primära celler härstammar från vildtyp zebrafiskar 1 dap. Tvärstrimmig myocyter och kluster av nervceller att utvidga tunn processer kan observeras lätt. Skalstapeln = 50 µm. (H) odlade celler av transgena linjen Tg (ptf1a: andra) jh1, som uttrycker andra i neuronala föräldraparets av mestadels GABAergic nervceller i hindbrain och en delmängd av retinal cell populationer29, 30 , 31. skalstapeln = 50 µm. (G) och (H) förvärvades av en confocal laser skanning Mikroskop använder glas botten rätter som illustreras i (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. transfection av primära celler med Plasmid DNA
- Återsuspendera filtermediat och pelleterat celler som erhålls i steg 1.3.7 i 1 x PBS istället för cellodlingsmedium. Färga en alikvot av cellsuspensionen med Trypan blå att bestämma antalet cell i en räknande kammare9.
- Blanda 0,5 miljoner celler med 10 µg ultrarent plasmid DNA i en 1,5 mL reaktionsröret och justera den totala volymen till 100 µL med 1 x PBS.
Obs: För våra experiment, vi främst används uttrycket konstruktioner baserat på plasmid pCS2 +10. Uttryck för öppen läsning ramar klonade in flera kloning platsen för pCS2 + drivs av den allestädes närvarande främjare av den human cytomegalovirus (CMV arrangören). Andra uttryck konstruktioner och initiativtagare kan testas (se även representativt resultat och figur 2 och figur 3). - Överföring cell-DNA mix omedelbart till en elektroporation kyvetten (0,4 cm), placera kyvetten i en elektroporation enhet och electroporate med följande inställningar: enstaka puls, exponentiell förruttnelse, 280 V, 950 µF.
- Direkt efter elektroporation, överföra cell-DNA mixen i en 1,5 mL reaktionsröret med 300 µL av färska cellodlingsmedium.
- Plåt 200 µL cellsuspension som beskrivs i 1.3.8 och fortsätt enligt beskrivningen i 1.3.9 beroende på den använda uttryck bygga, uttryck av fluorescerande proteiner kan upptäckas efter några timmar eller till nästa dag.
3. färgning av fasta primära celler
Obs: Subcellulära strukturer kan också visualiseras genom klassiska immunfärgning istället för att använda fluorescerande fusion protein reportrar. För zebrafiskar primära celler använder vi följande standardprotokoll exemplariskt fläcken nucleus, F-aktin och acetylerade tubulin med fluorescerande markörer.
- Platta celler på poly-L-lysin belagda täckglas placeras i en cell kultur maträtt eller multiwell plate som beskrivits ovan (se 1.3.8).
- För fixering, ta bort mediet och täcka cellerna med 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS. Inkubera cellerna under 10 minuter vid 4 ° C i en shaker. Tvätta cellerna 3 x 5 min varje med 1 x PBS i rumstemperatur. Kontrollera att 1 x PBS täcker cellerna helt och utför tvätt steg på en shaker.
- Blockera och permeabilize fast cellerna, täcka cellerna med 1 x PBS som innehåller 5% skummjölk och 0,3% Triton x-100. Placera cellerna i 10 min i rumstemperatur på en shaker. Tvätta cellerna som beskrivs i 3.2.
- Etikettera acetylerade tubulin, som är en markör för axoner11, späd den primär antikropp 1:2,000 i 1 x PBS med 1% skummjölk. Täcka cellerna med den här lösningen och inkubera dem över natten vid 4 ° C i en shaker. På den nästa dagen, tvätta cellerna som beskrivs i 3.2.
- Späd den sekundär antikropp konjugerat med den gröna fluorochrom fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) 1: 100 i 1 x PBS med 1% skummjölk och inkubera cellerna med denna lösning för 1 h i rumstemperatur i mörkret (täcka den maträtt t.ex. med en låda eller aluminiumfolie) på en shaker. Tvätta cellerna som beskrivs i 3.2.
- För att samtidigt färga den aktin cytoskelettet och atomkärnor, inkubera cellerna i 1 x PBS kompletteras med Phalloidin12 konjugerad med en röd fluorokrom (1:50) och 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI)13 (100 ng/mL) i 10 min på rummet temperaturen i mörkret på en shaker. Tvätta cellerna som beskrivs i 3.2.
- För att förbereda celler imaging, satte ett glas objekt transportör (objektglas) på en ren yta och placera på droppe monteringsmedium på den. Ta ett täckglas med fasta och färgade celler ur en maträtt med pincett och placera den på droppa med celler inför objekt transportören. Kontrollera att monteringsmedium sprider sig över hela området av täckglaset. Låt torka i mörker.
- Store fast och monterade cellerna i mörker vid 4 ° C tills den önskade bildprogram utförs.
Figur 2: Transfection yttrandefrihet konstruktioner av elektroporation. (A) Putative neuron transfekterade med datorer-andra på 1 dap. (B) tvärstrimmig myocyt (2 dap) uttrycker det endoplasmatiska retiklet riktade protein ss-RFP-KDEL. (C) två nervceller inom ett neuronala kluster transfekterade med St-MitoTag-YFP på 2 dap. (D) Cell (2 dap) trippel-transfekterade med St-DCX-tdTomato, St-MitoTag-YFP och datorer-H2B-mseCFP. (E) pSK-UAS:mCherry electroporated in i primära celler (1 dap) härrör från dubbel-transgena embryon bär transgener Tg (atoh1a: Gal4TA4) hzm222 och Tg (4xUAS:KGFPGI) hzm332 vilket resulterar i GFP uttryck i neuronala föräldraparets av bakhjärnan. Skala barer = 10 µm. (A-E) förvärvades av en confocal laserscanning mikroskopi använda glas botten rätter som illustreras i figur 1B. (F) fluorescerande färgning av fasta zebrafiskar primära nervceller på 5 dap. Blå: DAPI (kärna); Röd: Phalloidin (F-aktin); Grön: Acetylerade tubulin (nervceller). Skalstapeln = 10 µm. (G) Neuron-liknande cell transfekterade med St-mClover. På 2 dap, ingen förlängning är synlig. På 5 dap, en neurite-liknande struktur har bildat. Skalstapeln = 25 µm. (H) Neuron från samma förberedelse som cellen (F), omgiven av fibroblaster-liknande celler. Skalstapeln = 10 µm. (jag) Neuron härrör från ett transgena embryo bär transgenens Tg (XITubb: DsRed) zf14828 transfekterade med St-mClover. Mellan 12 och 15 dap, neuriter genomgå massiva degeneration. Skalstapeln = 100 µm. celler som visas i (F-jag) var seedad på poly-L-lysin belagt glas ( H,F) eller plast (G, jag), odlas i l-15 medium i närvaro av 10% filtermediat bovint serum och neuronala tillägg B-27 (utspädd 1:50) och avbildas med en epifluorescerande Mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. beredning av primära celler från vuxna zebrafiskar hjärnan
-
Hjärnan utvinning
- Välj en vuxen fisk minst 90 dagar av ålder. Om arbetar med en viss celltyp krävs, välja en transgena linje där cell-specifika fluorescerande reporter uttryck gör det möjligt för att visualisera de önska cellerna.
- Placera fisken i en bägare fylld med 200 mL av bedövningsmedel Tricaine8 (0,2%) i Danieau 30%. Vänta tills fisken stannar. Fördjupa den sövda fisken i en bägare fylld med 200 mL isvatten för 15 min till eutanasi det.
- Fyll en petriskål (diameter 6 cm) med 70% (v/v) etanol. Håll svansen fisken med en pincett och doppa den i etanolen. Se till att fisken är helt nedsänkt i etanol för 5 s.
- Extrahera hjärnan enligt protokollet av Gupta och Mullins14 med de följande anpassningar: Använd endast autoklaveras eller steril-packade verktyg och dissekera huvudet i sterila 1 x PBS.
- Direkt efter extraktion, placera hjärnan i en petriskål (diameter 3 cm) fylld med steril 1 x PBS och flytta skålen under en steril arbetsbänk för cellodling.
-
Hjärnan dissociation och plätering av primära celler
- Plats två uppsättningar av steril pincett (Ånghärdad), en steril petriskål (diameter 6 cm) fylld med 70% (v/v) etanol, en steril petriskål (diameter 10 cm) fylld med Leibovitzs l-15 medium kompletteras med 10% (v/v) filtermediat bovint serum, B-27 (1:50) och 1,2% (v / v) 10.000 U Penicillin-Streptomycin och en steril cell SIL med handtag (40 µm; Figur 1 c) under ren bänken.
- Plats cell silen i petriskål fylld med etanol och kontrollera vätskenivån på minst 5 mm högre än botten av Silen.
- Använder den första uppsättningen av pincett, överför hjärnan till silen redan placerats i etanol och se till att det är helt täckt av vätska. Efter 1 s, överföring silen med hjärnan i Petri skålen som innehåller Leibovitzs l-15-medium med ovanstående beskrivs kosttillskott.
- Använder den andra uppsättningen pincett, beskrivs överföring hjärnan i en steril 1,5 mL reaktionsröret fylld med 500 µL Leibovitzs l-15-medium med ovanstående kosttillskott. Lägg till kollagenas (typ 2) till en slutlig koncentration på 4 mg/mL i en total volym om 1 mL.
- Inkubera röret på en vertikalt rör rotator med 30 varv per min för 35 min i rumstemperatur. Mekaniskt separera kvarvarande vävnad klumpar av pipettering upp och ner med en 1000 µL pipettspetsen stöd dissociation processen.
- Stoppa dissociation när inga synliga partiklar kvar i lösningen. Filtrera cellsuspensionen genom en steril cell SIL med avluftning slot (40 µm; Figur 1 d) i en 50 mL konisk tub. Skölj silen med ca 10 mL av färska cellodlingsmedium.
Obs: När enda cellsuspension uppnås, steget filtrering är inte lika nödvändigt som fallet med embryon dissociation. Hjärnan är en mjuk vävnad och som sådan det är mer benägna att särskiljas homogeneously in enda cellsuspension. - Pellet celler genom centrifugering för 5 min på 180 x g och resuspendera cellpelleten i 1 mL färsk Leibovitzs l-15-medium med de ovan beskrivna kosttillskott.
- Pipettera 500 µL cellsuspension (50% av de erhållna cellerna) på en self-made poly-L-lysin belagt glas botten maträtt (se 1.2) eller i en väl 24-bra platta. Undre vid mindre ytor (dvs. 125 µL lösning för en brunn av en plattan med 96 brunnar). Inkubera i 60 min i rumstemperatur under den sterila arbetsbänk. Sedan lägga till volymen som behövs av färskt medium att fylla behållaren specifika och inkubera primära celler vid 28 ° C.
- Utföra den önskade bildprogram som använder ett inverterat Mikroskop vid 28 ° C. Kulturer kan användas för avbildning för flera dagar efter bordläggningen. Byt ut 50% av medlet på en daglig basis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 g visar en överförda ljus bild av en typisk kultur från vildtyp embryon med tvärstrimmig myocyter och kluster av neuron-liknande celler är mest förekommande. För att lättare identifiera vissa celltyper, en transgena linje med cell typspecifika uttryck av en fluorescerande protein kan vara används (figur 1 H).
Transfection en pCS2 +-baserat plasmid11 kodning förbättrade grönt fluorescerande protein (andra)15 till primära celler av vildtyp embryon resulterar i en stark fluorescerande signal på 1 dap (figur 2A). Av transfecting pCS2 +-baserat plasmider kodning fluorescerande organell markörer såsom endoplasmatiska retiklet riktade röd fluorescerande protein (ss-RFP-KDEL)16 eller mitokondrierna-riktade gul fluorescerande protein (MitoTag-YFP)17, 18, subcellulära strukturer kan visualiseras i detalj (figur 2B, C). Samtidig transfection av upp till tre plasmider möjliggör samtidig analys av subcellulär lokalisering av flera fluorescerande fusionsproteinerna i samma cell19 såsom MitoTag-YFP tillsammans med mikrotubuli markören mänskliga Doublecortin (DCX) 20 smält till den röda fluorescerande protein tdTomato21 och den nukleära markör Histon H2B smält till en cyan fluorescerande protein (H2B-mseCFP)22,23 (figur 2D). Subcellulära strukturer kan också avbildas med hög temporal och spatial upplösning, som for example förflyttning av blåsor positivt för den membran markör vesikler-associerade membranprotein 1 (VAMP1) smält till fluorescerande protein mCitrine24 , 25 (figur 3). Morfologiska förändringar över tid kan lätt följas av märkning hela cellen av uttrycket av en ljusa fluorescerande protein såsom mClover26 (figur 2 g, jag). Dock lyckas transfection av en plasmid baserat på pBluescriptSK-ryggraden kodning den röda fluorescerande protein mCherry27 smält till ett UAS-element till primära celler härstammar från dubbel-transgena embryon som har både en Gal4 drivrutin konstruera och en UAS effektor konstruktion visar att protokollet elektroporation är också lämplig för kombinatoriska genetik (figur 2E). Dessutom kan fast primära celler färgas enkelt med hjälp av immunofluorescens och organell-specifika fluorescerande färgämnen (figur 2F, H).
Figur 3: Time lapse imaging subcellulära strukturer. Vildtyp cell (1 dap) transfekterade med St-VAMP1-mCitrine. Markerade bildrutor i en time lapse inspelning (1 bildruta togs varje 1,68 s) visas. Pilen huvuden och spår i enligt färger belysa subcellulär dynamiken i tre distinkta VAMP1-positiv blåsor. Skalstapeln = 10 µm. Tidsfördröjning spelades in med hjälp av en confocal laser skanning Mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dissociation tekniken och de grundläggande odlingsbetingelserna kan också tillämpas på vävnaden i vuxen zebrafiskar. Här, testade vi vuxna hjärnvävnad från vildtyp zebrafiskar. Figur 4A -D visar en gradvis utveckling av en initialt skräp-belagd kultur till ett komplext neuronala-liknande nätverk. Med hjälp av vuxna hjärnan från en transgen fisk som transporterar transgenens Tg (XITubb: DsRed) zf14828, fullt differentierade DsRed-uttryckande nervceller kan undersökas i nära detalj (figur 4E).
Figur 4: primär cellkultur för vuxna zebrafiskar hjärnan. Ljusa fält bilder av primära celler härstammar från vuxna zebrafiskar hjärnan på (A) 1 dap, (B) 3 dap, (C) 5 dap och (D), 8 dap. Från 1 till 3 dap, döda celler och vävnad skräp försvinner medan enskild eller grupperad neuronala celler blir mer och mer uppenbart. På 3 dap, neuronala celler börjar att bilda den första kort neuriter. Från 5 dap framåt, är det möjligt att observera bildandet av ett nätverk med hundratals väl långsträckt neuriter. Skala barer = 50 µm. celler odlades i en poly-L-lysin-coated plattan med 96 brunnar. (E) odlade celler på 7 dap från den vuxna hjärnan av en transgen fisk som uttrycker transgenens Tg (XITubb: DsRed) zf148. DsRed uttrycks i differentierade nervceller28. Skalstapeln = 100 µm. celler odlades i en poly-L-lysin-coated 24-bra platta. Alla bilder förvärvades av en epifluorescerande mikroskopet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi två olika protokoll till kultur primära celler från antingen 2 dpf zebrafiskar embryon eller vuxen zebrafiskar hjärnan.
Beredning av primära cellkulturer från 2 dpf zebrafiskar är relativt lätt att utföra för alla med erfarenhet av grundläggande cell kultur tekniker. Men för att få bra och reproducerbara resultat, ett tillräckligt antal embryon som utgångsmaterial är avgörande (100 är minst). Under anskaffandet av embryon, måste alla möjliga källor till kontaminering undvikas för att hålla mängden bakterier och parasiter så låg som möjligt. Mest kritisk är inkubering av embryon i etanol — detta steg måste vara tillräckligt lång för att säkerställa noggrann sterilisering, men inte för långt heller eftersom etanol är ett organiskt lösningsmedel som skadar celler och vävnader.
Timing är också viktigt under enzymatisk dissociationen av hjärnvävnad eller 2 dpf zebrafiskar embryon. Inkubationstiden inte skall överskridas och enzym-innehållande medium skall avlägsnas snabbt när fullständig dissociation enda cell scenen sker. Dock typ 2 kollagenas skadar inte cellmembranet och det är inte så starkt hämmas av FBS, som trypsin33. Tack vare dessa egenskaper kunde vi utföra dissociation i närvaro av FBS som ett viktigt komplement stödja cellernas viabilitet och minskar cellskador, vilket resulterar i högre avkastning och lönsamhet av delikat celltyper.
Som framgår av våra representativa resultat, kan olika celltyper vara antingen identifieras av morfologi eller av uttrycket av cell typspecifika transgener kodning för fluorescerande reportrar. Den senare är mycket praktiskt när du utför levande cell avbildning av viss cell populationer19. Vi rekommenderar dock för att verifiera uttrycksmönstret av den respektiva förstärkare i 2 dpf embryon genom fluorescensmikroskopi att säkerställa konsekventa resultat.
För att möjliggöra visualisering av subcellulära strukturer i embryonala zebrafiskar primära celler har etablerat vi ett elektroporation protokoll för att transfect plasmid DNA-kodning för ett urval av fluorescerande organell markörer. Graden av celler transfekterade med denna metod är relativt låg men pålitlig och ger tillräcklig cell nummer för levande cell imaging19. För en framgångsrik transfection är ett avgörande steg korrekt bestämning av antalet celler i suspension. I genomsnitt 106 celler kan erhållas från ca 90 2 dpf embryon, men korrekt cell räkna tidigare elektroporation är obligatoriska19. Jämfört med vanliga däggdjursceller linjer såsom Cos-7 eller HeLa, primära celler från 2 dpf zebrafiskar embryon är mycket varierande i storlek, men ganska små i genomsnitt (särskilt nervceller), vilket kan göra räknar i en Neubauer kammare relativt svårt. Samma sak gäller för efterföljande bildhanteringsprogram. För att på ett tillfredsställande sätt visualisera subcellulära strukturer i dessa små zebrafiskar celler, krävs en avancerad fluorescens Mikroskop med hög upplösning helst en confocal laser skanning Mikroskop.
Beredning av primära celler från vuxna zebrafiskar hjärna är mer avancerad eftersom det kräver utbildning i dissekera djuret och extrahera hjärnans vävnad14. Dessutom behöver sterila förhållanden underhållas redan utanför det sterila Workbench för att inte förorena extraherade hjärnan. Men de efterföljande stegen om dissociation och plätering är jämförbara med det första protokollet och får också tillämpas på andra vävnader av vuxen fisk såsom muskel eller levern.
För båda protokollen är den största begränsningen svårt att odla celltyper i kultur, som nervceller begränsad bärkraft. Efter 3 dap använder standardvillkor, förminskas starkt tätheten av embryonala zebrafiskar primära celler begränsar alltså tidsintervall för imaging experiment19. Mestadels fiboblast-liknande celler överleva i avsaknad av särskilt skräddarsydda utvägar.
För att förbättra överlevnaden av kulturen i dess komplexitet celltyper, testat vi framgångsrikt Leibovitzs l-15 medium. Vidare har vi kompletterat det med de neuron-främja additiv B-27 för neuronal viss kultur. Neuronala celler har observerats att skilja i cellkultur och att överleva i flera dagar, när från hela embryon (figur 2F-jag) as well as från vuxna hjärnan (figur 4E). Dessutom förbättrar plätering av primära celler vid höga tätheter (t.ex. 0,25 x 106 celler per 100 mm2) cellernas viabilitet i motsats till låga tätheter (G. Russo, preliminära resultat).
Bredvid användningen av specifika kultur media och kosttillskott rapporterade vi hur användningen av olika substrat har en direkt inverkan på olika celltyper som utgör den slutliga kulturen och kan användas som selektiv parameter för att främja tillväxten av en delmängd av cell typer. Vävnadsodling-behandlade plast jämfört med poly-L-lysin beläggning verkar starkt underlätta fibroblast-liknande celladhesion och spridning (figur 1E, F). Samtidigt, många celltyper som beror på stöder celler och specifika adhesionsmolekyler (som nervceller) inte följer korrekt, växa, eller skilja på behandlade plast, men föredrar särskilt självhäftande stöd. Vi rekommenderar därför, när den inte är avsedd att få en fibroblast - eller epitelial-liknande kultur33, för att använda poly-L-lysin eller andra cell-specifika substrat för beläggning cell kultur rätter.
Vi anser våra protokoll utgångspunkt för användning av primära cellkulturer som ett komplement till zebrafiskar i vivo studier, vilket kan vara ytterligare utvecklas och anpassas till odling av specifika celltyper och används för många olika tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar T. Fritsch, A. Wolf-Asseburg, I. Linde och S.-M. Tokarski för utmärkt djurvård och teknisk support. Vi är tacksamma för alla medlemmar i Köster labbet för intensiv och bra diskussioner. Vi erkänner tacksamt finansiering genom den Deutsche Forschungsgemeinschafts (KO 1949/5-1) och delstaten Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish lines | |||
| AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ||
| Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | ||
| Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | |
| ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | |
| confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63X objective | |
| epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40X objective | |
| Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device |
| Horizontal shaker | GFL | model 3011 | |
| incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | |
| incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | |
| light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | |
| micro pipettes | Gilson | ||
| sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | |
| tweezers | Dumont | Style 5, Inox | |
| vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | |
| ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | |
| LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) |
| pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene |
| Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic and glass ware | |||
| BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium |
| 1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | |
| EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation |
| electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | |
| glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | |
| Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | |
| Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | |
| Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos |
| pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | |
| sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | |
| sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and Reagents | |||
| sodium chloride | Roth | 0601.1 | |
| 4 % paraformaldehyde in 1x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | |
| goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes |
| magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | |
| methylene blue | Serva | 29198.01 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | |
| Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | |
| poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | |
| potasssion chloride | Merck | 104938 | |
| Skim milk | Roth | 68514-61-4 | |
| Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | |
| Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C |
| pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium and solutions for cell culture | |||
| 1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | |
| glutamine 100x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
| PenStrep (10,000 U/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends in Cell Biology. 23, 584-586 (2013).
- Sassen, W. A., Köster, R. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. , 151 (2015).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80, 153-158 (1999).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233, 329-346 (2001).
- Driever, W., Rangini, Z. Characterization of a cell line derived from zebrafish (Brachydanio rerio) embryos. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 29A, 749-754 (1993).
- Badakov, R., Jaźwińska, A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).
- Senghaas, N., Köster, R. W. Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon. Eugene. (2007).
- JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes & Development. 8, 1311-1323 (1994).
- Piperno, G., Fuller, M. T. Monoclonal antibodies specific for an acetylated form of alpha-tubulin recognize the antigen in cilia and flagella from a variety of organisms. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2085-2094 (1985).
- Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin. European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. 37, E1717 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Stornaiuolo, M. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).
- Lithgow, T. Targeting of proteins to mitochondria. FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).
- Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).
- Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).
- Horesh, D., et al. Doublecortin, a stabilizer of microtubules. Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).
- Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein. Nature Methods. 5, 339-345 (2008).
- Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2. Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).
- Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10, 407-409 (2013).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133, 916-927 (2008).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, 5069-5079 (2005).
- Jusuf, P. R., Harris, W. A. Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina. Neural Development. 4, 34 (2009).
- Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).
- Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors. Zebrafish. 10, 316-332 (2013).
