Vi presenterer en effektiv og enkel å bruke protokoll for å forberede primært cellekulturer av sebrafisk embryo for transfection og levende celle bildebehandling samt en protokoll for å forberede primære celler fra voksen sebrafisk hjernen.
Sebrafisk embryoer er gjennomsiktig og utvikle raskt utenfor mor, dermed gir for utmerket i vivo avbilding av dynamisk biologiske prosesser i en intakt og utvikle virveldyr. Men er detaljert avbilding av morphologies av forskjellige celletyper og subcellular strukturer begrenset i hele mounts. Derfor etablert vi en effektiv og enkel å bruke protokoll til kultur lever primære celler fra sebrafisk embryoer og voksen vev.
I korthet, er 2 dpf sebrafisk embryoer dechorionated, deyolked, sterilisert og avstand til enkeltceller med collagenase. Etter filtrering trinn, er primær celler belagt på glass bunn retter og dyrket i flere dager. Frisk kulturer, som lang sikt differenciated seg, kan brukes for høy oppløsning AC confocal imaging studier. Kulturen inneholder ulike celletyper, med striated myocytter og neurons blir fremtredende på poly-L-lysine belegg. Spesielt etiketten subcellular strukturer av fluorescerende markør proteiner etablert vi også en electroporation protokoll som tillater transfection av plasmider DNA i ulike celletyper, inkludert nerveceller. Således, i nærvær av operatør definerte stimuli, komplekse celle atferd og intracellulær dynamikken i primære sebrafisk celler kan vurderes med høy romlig og tidsmessige oppløsning. I tillegg bruker voksen sebrafisk hjernen, viser vi at teknikken beskrevet dissosiasjon, i tillegg til de grunnleggende culturing forholdene, også arbeide for voksen sebrafisk vev.
Sebrafisk (Danio rerio, D. rerio) er en populær modell virveldyr for mange felt av grunnleggende og biomedisinsk forskning1. Sebrafisk embryo utvikle raskt ex utero, gjennomsiktig og passe under et mikroskop, noe som gir gode forutsetninger for å studere virveldyrenes utvikling i en levende organisme. På grunn av genetisk tractability sebrafisk2, har mange stabil transgene reporter linjer med celle type-spesifikk uttrykk for ulike fluorescerende etablert tillater for observasjon av bestemt celle populasjoner. Sebrafisk samfunnet tilbyr et bredt spekter av såkalte Gal4-driver linjer som bærer en transgene uttrykke den syntetiske Kal4TA4 (eller KalTA3 tilsvarende GalFF) genet med Gal4-DNA-bindende domene gjær del viral transcriptional aktivisering domener kontrollert av celle type-spesifikk enhancers. Disse driveren linjene er krysset effektor linjene som bærer effekter av transgener som består av en definert oppstrøms aktivering sekvens (UAS) smeltet til et reporter gen. Kal4TA4 protein binder UAS-elementet, og dermed aktivere celle type-selektiv uttrykk for reporter genet3,4. Denne tilnærmingen gir svært variert kombinasjon studier av nesten alle tilgjengelige enhancer og reporter elementer i dobbel-transgene dyr.
Men er grundig live bildebehandling med fokus på enkeltceller eller subcellular innhold begrenset i en hel og stadig skiftende embryo. For å håndtere bestemt celle biologiske spørsmål med høyeste oppløsningen, er bruk av cellekulturer ofte å foretrekke. Noen linjer av sebrafisk finnes, men de anses som svært valgte5,6,7 og deres forplantning er ofte tidkrevende. Videre er alle tilgjengelige celle linjene fibroblast stammer, begrense eksperimenter ved hjelp av cellekultur til én type celler. Derfor opprettet vi både en effektiv og enkel å bruke protokoll for å forberede primære celler direkte fra sebrafisk embryoer og voksen sebrafisk hjernen, sammen med tilnærminger til å øke levetiden til kultur og å utvide mangfoldet av dyrket celletyper. I tillegg presenterer vi en prosedyre for å transfect embryonale primære celler med uttrykket konstruksjoner for fluorescerende organelle markører. Dermed kan mobilnettet morphologies og subcellular strukturer analyseres med høy romlig og tidsmessige oppløsning i forskjellige celletyper som beholde sine viktige funksjoner.
Her presenterer vi to forskjellige protokoller kultur primære celler fra 2 dpf sebrafisk embryo eller voksen sebrafisk hjernen.
Utarbeidelse av primært cellekulturer fra 2 dpf sebrafisk er relativt lett å utføre for noen med erfaring i grunnleggende celle kultur teknikker. Men for å oppnå god og reproduserbar resultat, et tilstrekkelig antall embryo som starter materiale er avgjørende (100 er minimum). Under hevingen av embryoene, må alle mulige kilder til forurensning unngås for å h…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker T. Fritsch, A. Wolf-Asseburg, I. Linde og S.-M. Tokarski for utmerket dyr omsorg og kundestøtte. Vi er takknemlige for alle medlemmer av Köster lab for intens og nyttig diskusjoner. Vi erkjenner takknemlig støtte av Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) og Federal delstaten Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Fish lines | ||||||
AB (wild-type) | established by Streisinger and colleagues, available from the Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | |||||
Tg(ptf1a:eGFP)jh1 | stable transgenic line in which the enhancer of the zebrafish gene ptf1a drives expression of the fluorescent protein EGFP (Parsons et al., 2007) | |||||
Tg(XITubb:DsRed)zf148 | stable transgenic line in which the Xenopus neural-specific beta tubulin promoter drives expression of the fluorescent protein DsRed (Peri and Nüsslein-Volhard, 2008) | |||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Equipment | ||||||
centrifuge | Eppendorf | model 5804 R | ||||
ChemiDoc MP imaging system | BioRad | model XRS+, used to acquire black-and-white images of Petri dishes containing 1 da embryos | ||||
confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | model SP8, equipped with 28 °C temperature box and a 63 x objective | ||||
epifluorescent microscope | Leica microsystems | model DM5500B, equipped with 28 °C temperature box and a 40 x objective | ||||
Gene Pulser Xcell with capacitance extender | BioRad | 1652661 | electroporation device | |||
Horizontal shaker | GFL | model 3011 | ||||
incubator for cell culture (28 °C) | Memmert | model incubator I | ||||
incubator for embryos (28 °C) | Heraeus | type B6120 | ||||
light microscope | Zeiss | model TELAVAL 31 | ||||
micro pipettes | Gilson | |||||
sterile work bench | Bio Base | with laminar flow and UV light | ||||
tweezers | Dumont | Style 5, Inox | ||||
vertical tube rotator | Labinco B.V. | model LD-79 | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Software | ||||||
Image Lab Software | BioRad | for the ChemiDoc MP imaging system from BioRad | ||||
ImageJ | National Institutes of Health | used for counting 1 dpf embryos by applying the Count particles-tool to the respective black-and-white images; Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016). | ||||
LAS X | Leica Microsystems | for both confocal and epifluorescent microscopes from Leica Microsystems | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Plasmids | ||||||
pCS-DCX-tdTomato | Köster Lab | # 1599 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-eGFP | Köster Lab | # 7 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-H2B-mseCFP | Köster Lab | # 2379 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-mClover | Köster Lab | # 3865 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-MitoTag-YFP | Köster Lab | # 2199 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-ss-RFP-KDEL | Köster Lab | # 4330 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pCS-VAMP1-mCitrine | Köster Lab | # 2291 | based on the backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994) | |||
pSK-UAS:mCherry | Köster Lab | # 1062 | based on the pBluescript-backbone of Stratagene | |||
Plasmid numbers refer to the database entries of the Köster lab. Plasmids are available upon request. | ||||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Plastic and glass ware | ||||||
BD Falcon Cell Strainer (40 µm) | FALCON | REF 352340 | distributed by BD Bioscience, used as “landing net” to dip deyolked embryos into ethanol and to transfer them quickly to fresh cell culture medium | |||
1.5 mL reaction tubes | Sarstedt | 72690550 | ||||
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | ||||
50 mL falconic tube | Sarstedt | 62.547.004 | ||||
96-well plate | Sarstedt | 83.3924.005 | ||||
EasyStrainer (40 µm) | Greiner Bio-One | 542 040 | with venting slots; used to filter cells after collagenase-mediated dissociation | |||
electroporation cuvette (0.4 cm) | Kisker | 4905022 | ||||
glass coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051201 | ||||
Microscope slides | Thermo Fisher Scientific (Menzel Gläser) | 631-0845 | ||||
Neubauer chamber | Henneberg-Sander GmbH | 9020-01 | ||||
Pasteur pipettes (plastic; 3 mL) | A. Hartenstein | PP05 | ||||
Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 821473 | for zebrafish embryos | |||
pipette tips | Sarstedt | Blue (1000 µl): 70762; Yellow (200 µl): 70760002; White (10 µL): 701116 | ||||
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 3 cm) | TPP Techno Plastic Products AG | 93040 | ||||
sterile cell culture dishes (plastic; diameter 6 cm) | Sarstedt | 72690550 | ||||
sterile Petri dishes (plastic; diameter 10 cm) | Sarstedt | 83.3902 | for brain dissection | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Chemicals and Reagents | ||||||
sodium chloride | Roth | 0601.1 | ||||
4 % paraformaldehyde in 1 x PBS | Sigma-Aldrich | 16005 | ||||
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | ||||
calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | C1396 | ||||
ethanol p.a. 100% | Sigma-Aldrich | 46139 | ||||
goat α-mouse IgG (Fc specific) FITC conjugated | Thermo Fisher Scientific | 31547 | ||||
HEPES | Roth | 9105.4 | ||||
high vacuum grease | DOW CORNING | 3826-50 | silicon grease used for self-made glass bottom dishes | |||
magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | ||||
methylene blue | Serva | 29198.01 | ||||
Monoclonal Anti-Tubulin, Acetylated antibody | Sigma-Aldrich | T6793 | ||||
Aqua-Poly/Mount (mounting medium) | Polyscience | 18606 | ||||
poly-L-lysine | Biochrom | L 7240 | ||||
potasssion chloride | Merck | 104938 | ||||
Skim milk | Roth | 68514-61-4 | ||||
Texas Red-X Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | T7471 | ||||
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Synonym: Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | |||
Triton X-100 | BioRad | 1610407 | ||||
Trypan Blue | Gibco by Life Technologies | 15250061 | ||||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Enzymes | ||||||
collagenase (Type 2) | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | dissolve powder in cell culture medium (8 mg/mL) and sterile-filter the solution, store aliquots at -20 °C | |||
pronase (from Streptomyces griseus) | Roche | 11459643001 | distributed by Sigma-Aldrich, dissolve in 30% Danieau (10 mg/mL) and store aliquots at -20 °C | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |||
Medium and solutions for cell culture | ||||||
1 x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco by Life Technologies | 14190-169 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
CO2-independent medium | Gibco by Life Technologies | 18045054 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
filtrated bovine serum (FBS) | PAN-Biotech | individual batch | ||||
glutamine 100 x | Gibco by Life Technologies | 25030081 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
Leibovitz's L-15 medium | Gibco by Life Technologies | 11415049 | distributed by Thermo Fisher Scientific | |||
PenStrep (10,000 units/mL) | Gibco by Life Technologies | 15140148 | distributed by Thermo Fisher Scientific |