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In Vitro Allevamento di api solitarie: uno strumento per valutare i fattori di rischio larvale

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57876
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1,5
1Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias, 5USDA-ARS, Vegetable Crop Research Unit

Summary

Spray di fungicida per le piante di fioritura può esporre API solitarie ad alte concentrazioni di residui a carico di polline fungicida. Utilizzando esperimenti di laboratorio che coinvolgono in vitro-larve di ape allevati, questo studio indaga gli effetti interattivi di consumo fungicida-trattati polline derivato da piante ospite e non host.

Abstract

Anche se le api solitarie forniscono servizi di impollinazione cruciale per le colture selvagge e gestite, questo gruppo di specie-ricco è stato ampiamente trascurato negli studi di regolamento dei pesticidi. Il rischio di esposizione ai residui di fungicidi rischia di essere particolarmente elevato se lo spray si verifica su o in prossimità di piante ospiti mentre le api stanno raccogliendo polline per predisporre i loro nidi. Per specie di Osmia che consumano il polline da un selezionato gruppo di piante (oligolecty), l'impossibilità di utilizzare il polline di piante non host possa aumentare il loro fattore di rischio per la tossicità correlata al fungicida. Questo manoscritto descrive protocolli utilizzati per la posteriore con successo oligolectic mason API, lato di sensu di Osmia ribifloris , dall'uovo alla fase di prepupa all'interno di piastre per colture cellulari in condizioni di laboratorio standardizzati. Lo in vitro-api allevate sono successivamente utilizzate per studiare gli effetti della fonte di esposizione e polline di fungicida su fitness ape. Basato su un disegno fattoriale 2 × 2 completamente attraversato, l'esperimento esamina gli effetti principali e interattivi della fonte di esposizione e polline di fungicida su fitness larvale, quantificata dalla biomassa prepupa, tempo dello sviluppo larvale e sopravvivenza. Dei principali vantaggi di questa tecnica è che utilizzando in vitro-api allevate riduce la variabilità del fondo naturale e consente la modifica simultanea di più parametri sperimentali. Il protocollo descritto presenta uno strumento versatile per ipotesi test che coinvolgono la suite di fattori che incidono sulla salute delle API. Per gli sforzi di conservazione essere accolti con successo significativo, duraturo, tali intuizioni la complessa interazione di fattori fisiologici ed ambientali ape declini di guida si rivelerà per essere critici.

Introduction

Dato il loro ruolo come gruppo dominante degli insetti impollinatori1, la perdita globale delle popolazioni di API rappresenta una minaccia per la sicurezza alimentare ed ecosistema stabilità2,3,4,5,6 ,7. Le tendenze in declino in entrambe le popolazioni di API gestite e selvatici sono state attribuite a diversi fattori di rischio condivisi tra cui frammentazione degli habitat, emergendo parassiti e agenti patogeni, perdita di diversità genetica e l'introduzione di specie invasive3 ,4,7,8,9,10,11,12. In particolare, l'aumento drammatico nell'uso di pesticidi, (ad es., neonicotinoidi) è stato collegato direttamente agli effetti nocivi tra API13,14,15. Parecchi studi hanno indicato che il sinergismo tra neonicotinoidi e d'inibizione biosintesi dell'ergosterolo fungicidi (EBI) può condurre ad alta mortalità attraverso multiple ape specie16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. Tuttavia, fungicidi, a lungo considerati essere 'bee-safe', continuano a essere spruzzato sulle colture in fiore senza molto controllo23. Api bottinatrici sono state documentate per riportare ordinariamente carichi di polline contaminati con fungicida residui24,25,26. Il consumo di tali fungicida-ladenpollen può causare elevata mortalità larvale API27,28,29,30e una suite di effetti sub-letali tra API adulte16 , 31 , 32 , 33 , 34. uno studio recente suggerisce che i fungicidi possono causare perdite di API alterando la comunità microbica all'interno alveare-memorizzati polline, quindi interrompere i critici simbiosi tra API e polline-sopportate microbi35.

Sebbene le api solitarie sono vitali per l'impollinazione di varie piante selvatiche e agricoli36,37,38, questo gruppo eterogeneo di impollinatori ha ricevuto molta meno attenzione a studi di monitoraggio dei pesticidi. Il nido di una femmina adulta solitaria contiene 5-10 camere coulors stagne, ciascuno fornito di una massa finita di maternamente raccolti di polline e nettare e un singolo uovo39. Dopo la schiusa, le larve si affidano la fornitura di polline allocata e il microbiota associato a carico di polline per ottenere un'adeguata nutrizione40,41. Perché mancano i vantaggi di uno stile di vita sociale, le api solitarie possono essere più vulnerabili a pesticidi esposizione42. Per esempio, mentre i deficit sociali delle API seguendo uno spray possono essere compensati per estendere alcune dai lavoratori ed emergenti Covata, la morte di una donna solitaria adulta sola termina tutte le attività riproduttiva43. Tali differenze nella suscettibilità evidenziano la necessità di incorporare taxa diversi ape in studi ecotossicologici per garantire una protezione adeguata per le API gestite e selvagge allo stesso modo. Tuttavia, a parte una manciata di studi, indagini sugli effetti dell'esposizione di fungicida ha focalizzato il sociale API18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.

Le api solitarie, appartenenti al genere Osmia (Figura 1) sono state utilizzate in tutto il mondo come impollinatori efficienti di diversi importanti frutta e dado colture39,50,51,53, 53. come con altri impollinatori gestito gruppi24,54,55,56,57,58, api adulte Osmia sono ordinariamente esposti ai fungicidi spruzzati sulle colture in fiore44. Le femmine adulte foraggiamento sulle colture recentemente spruzzati possono raccogliere e stock loro nidiata chambers con fungicida-carichi di polline, che più tardi forma la dieta esclusiva per lo sviluppo larve. Consumando le disposizioni di polline contaminati possa esporre successivamente alle larve di fungicida residui42. Il rischio di esposizione può essere maggiore tra oligolectic specie che si nutrono solo a pochi host strettamente correlate piante59,60,61. Alcuni megachilid API, ad esempio, sembrano preferenzialmente foraggio per polline Asteraceae di bassa qualità, come un mezzo per ridurre il parassitismo62. Tuttavia, nella misura in cui fungicidi impatto larvale fitness tra api solitarie oligolectic empiricamente non è stata quantificata. L'obiettivo di questo studio è di sviluppare un protocollo per testare i principali e gli effetti interattivi della fonte di esposizione e polline di fungicida sull'idoneità in vitro allevati api solitarie. Per studiare, uova di lato di sensu di o. ribifloris (s.l.) possono essere ottenute in commercio (tabella materiali). Questa popolazione è ideale per la sua importanza come un impollinatore nativo e la sua forte predilezione per i ricchi di nettare Mahonia aquifolium (Oregon grape) trovati all'interno della regione53,63,64 (Figura 2).

Figure 1
Figura 1. Una foto ad alta risoluzione di un adulto Osmia ribifloris. Foto credit Dr. Jim Cane, ricerca entomologo, USDA-ARS Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Nidificazione di canne di Osmia ribifloris (s.l.) con una femmina di nidificazione in primo piano. Phragmite Camera partizioni e terminali di chiusura per le ance sono costruiti da masticated foglie. Foto di credito signor Kimball Clark, NativeBees.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il primo obiettivo di questo studio è di valutare l'effetto del consumo di polline fungicida-trattati sulla forma larvale (misurata in termini di tempi di sviluppo e prepupa biomassa). Mentre l'esposizione per il propiconazolo fungicida comunemente applicata è stato collegato alla mortalità aumentata tra API adulte attraverso diverse specie 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,66,67, l'impatto sulle API larvale è minore noto. Il secondo obiettivo di questo studio è di valutare gli effetti del consumo di polline non host su fitness larvale. Gli studi precedenti indicano che le larve delle API oligolectic non riescono a svilupparsi quando costretti a consumare polline non host68. Tali risultati possono essere attribuiti alle variazioni di ape fisiologia69, polline biochimica70e il microbioma beneficio associati con polline naturale disposizioni71. Il terzo obiettivo di questo studio è di valutare gli effetti interattivi di trattamento fungicida e polline dietetico su fitness larvale.

Numerosi tratti biologici tra cui dimensione corporea materna, provisioning di tasso, strategia di foraggiamento e polline quantità72,73,74,75 sono noti per influenzare larvale fitness tra le api solitarie. Questi fattori possono introdurre variabilità significativa tra canneti, che pone una sfida nello sviluppo di disegni sperimentali difendibile nel valutare salute larvale. Inoltre, dato che lo sviluppo larvale si verifica all'interno di ance nidificazione sigillati, gli effetti di tale variabilità sulla progenie sono difficili da visualizzare e quantificati senza l'utilizzo di tecniche non letali (Figura 3). Per superare questa sfida, tutte le ipotesi all'interno di questo studio sono testate utilizzando larve allevate di fuori della loro nidificazione ance. Il disegno sperimentale rappresenta un completamente attraversato 2 × 2 fattoriale set-up, con ciascun fattore composto da 2 livelli; Fattore 1: Esposizione fungicida (fungicida; Nessun fungicida); Fattore 2: Fonte di polline (Host polline, polline Non-host). Le API vengono generate dall'uovo alla fase di prepupa all'interno di piastre per colture cellulari del multiwell sterile sotto condizioni di laboratorio controllate. Ognuno ben individualmente è fornito con una quantità standardizzata di fornitura di polline e un singolo uovo. Dopo la schiusa, la larva si nutre di polline allocato all'interno del pozzo, completa lo sviluppo larvale e avvia impupamento. Studi precedenti hanno mostrato che la mortalità non spiegata è più bassa tra le API generate all'interno di questo ambiente di allevamento artificiale rispetto a quello rilevato nel selvaggio49,76. L'uso di in vitro-api allevate presenta parecchi vantaggi sopra gli studi sul campo: 1) riduce al minimo gli effetti confondenti di variabilità naturale e incontrollati fattori connessi tipicamente con gli studi sul campo; 2) permette più livelli di manipolazione per ogni fattore di interesse per essere testate contemporaneamente tra gruppi di trattamento; 3) il numero delle ripetizioni può essere predeterminato, e fattori sperimentali per ogni replica possono essere manipolati individualmente; 4) variabili di risposta larvale possono essere facilmente visualizzate e registrate in modo indipendente senza inquietante larve adiacenti; 5) il protocollo può essere modificato per ospitare disegni sperimentali più complessi che coinvolgono molteplici fattori e variabili di risposta.

Figure 3
Figura 3. Contenuto all'interno di una canna di nidificazione naturale di Osmia ribifloris (s.l.). Chiuda in su (A) una canna dissecata mostrando singole camere, disposizioni di polline e partizioni e (B) appena raccolto polline disposizioni e le uova associate (indicate con un cerchio nero). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

1. preparare le soluzioni di propiconazolo per esperimenti di esposizione fungicida

  1. Preparate 0,1 x soluzione fungicida sciogliendo volumi appropriati di propiconazolo commercialmente acquistati 14,3% in acqua sterile il giorno dell'esperimento. Assicurarsi che la unica soluzione fungicida preparata al momento è utilizzato per tutti i trattamenti.
  2. 23 µ l di 0.1 x soluzione fungicida per grammo di disposizione di polline per ottenere la massima concentrazione di propiconazolo precedentemente segnalato da polline dell'ape-raccolto24 (0,361 PPM o µ g di principio attivo g-1 di polline).

2. raccogliere uova e disposizioni di polline di Host da Osmia ance

  1. Usando un bisturi sterilizzato, sezionare appena collegato nidificazione ance di Osmia, dividerlo in due parti lungo la lunghezza della canna per esporre le singole camere.
    Nota: Ogni nido può contenere da 8 a 14 camere e un singolo uovo all'interno di una camera.
  2. Ispezionare le canne visivamente per identificare le camere contenenti uova maschile basate su linee guida precedentemente pubblicati77. Uso un ago sterilizzato piegato per rimuovere ogni disposizione di polline insieme con l'uovo associato dalla nidificazione reed e posto in un ambiente pulito pesare barca.
  3. Delicatamente separare l'uovo dalla fornitura utilizzando un pennello pulito bene e registrare il peso fresco della disposizione polline ed uovo usando una bilancia di laboratorio standard. Calcolare il peso medio delle disposizioni polline maschile.
  4. Eseguire i passaggi successivi con un ritardo minimo per ridurre le probabilità di danni all'uovo dall'esposizione alla temperatura in eccesso e disidratazione.

3. preparare Host pianta polline disposizioni

  1. Ispezionare visivamente il polline della pianta ospite maternamente raccolti scavato dalle camere di nidificazione per garantire che nessun parassita è presenti78. Al fine di ridurre eventuali potenziali bias materna, combinare le disposizioni di polline in una massa unica in una capsula di Petri sterile e mescolare bene con un ago sterilizzato.
  2. Dividere la massa combinata in nuove disposizioni di polline, assicurando che il peso di ogni disposizione ricostituito è approssimativamente uguale al peso medio di una disposizione maschio naturalmente allocato (media ± SE, 0.35 ± 0,01 g, N = 42).
    Nota: Poiché la Osmia sp. alloca più piccole disposizioni di polline per i figli maschi, ciò si traduce in minore peso corporei delle larve maschile rispetto a quella delle femmine77. Per evitare qualsiasi tali pregiudizi derivanti da differenze sesso-specifiche, utilizzare solo uova maschile negli esperimenti.

4. preparare Non Host pianta polline fornitura

  1. Polverizzare acquistato in commercio miele ape-raccolto polline polvere finissima utilizzando un laminatoio di sfera standard del laboratorio.
  2. Base al contenuto di umidità di disposizioni di polline raccolto maternamente ospitante (~ 20%), idratare la polvere di polline con volumi appropriati di zucchero 40% sterilizzato soluzione79 e mescolare accuratamente per formare una pasta-come consistenza.
  3. Dividere in masse polliniche individuali, ciascuna del peso di circa lo stesso come il peso medio di una disposizione maschio naturalmente allocato.
    Nota: Contenuto di umidità di polline maternamente raccolti host disposizioni possono essere standardizzate in prima confrontando il peso fresco e asciutto delle disposizioni di polline da chambers maschio selezionato casualmente 3080. Per ottenere il peso secco, polline disposizioni dovrebbero essere liofilizzati in un liofilizzatori (1,5 Pa per 72 h).

5. preparare piastre per colture cellulari del Multiwell

  1. Linea singoli pozzetti della piastra di coltura sterile 48 pozzetti con coppe di latta autoclavati (5 × 9 cm). Utilizzando pinze sterili, flair delicatamente fuori il bordo superiore della capsula in modo che può ospitare la fornitura di polline.
  2. Posizionare una massa singola di disposizione di polline non host o host all'interno della tazza di latta utilizzando strumenti sterili basate al gruppo di trattamento.
    Nota: Per evitare la contaminazione incrociata, utilizzare piastre separate per trattamento e gruppi di controllo.

6. aggiungere fungicidi

  1. Rendere una depressione centrale all'interno della massa di polline utilizzando un bastone di legno sterile. Utilizzare un bastone nuovo per ogni fornitura di polline.
  2. Aggiungere volumi appropriati di soluzione fungicida (per trattamento), o di acqua sterile (per controlli) nella depressione. Pizzicare l'apertura della depressione utilizzando pinze sterili per ridurre al minimo la superficie di contatto fra il fungicida / sterile acqua e l'uovo.
  3. Accertarsi che il set-up fattoriale del disegno sperimentale si allinei con quello raffigurato nella rappresentazione schematica (Figura 4).

Figure 4
Figura 4. Rappresentazione schematica del setup sperimentale. L'esperimento rappresenta un completamente attraversato 2 × 2 fattoriale Setup. Fattore 1 rappresenta l'esposizione fungicida e si compone di 2 livelli: (i) nessun fungicida (N = 10) e (ii) fungicida (N = 10). Fattore 2 rappresenta la fonte di polline e si compone di 2 livelli: polline di Host (i) (N = 8) e (ii) Non-host polline (N = 8). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. posteriore e osservare le larve

  1. Posto un uovo maschio selezionato casualmente sulla superficie superiore della disposizione polline utilizzando un pennello pulito bene. Una volta che le uova sono state poste su tutte le disposizioni, sostituire il coperchio della piastra di coltura cellulare, fissandola con etichettatura nastro sugli angoli.
  2. Posizionare le piastre bene su un vassoio pulito e coprire con un panno scuro per ostacolare il contatto con luce diretta. Posto un pozzo 6 piastra contenente 30 mL di acqua sterile all'interno del vassoio per evitare il disseccamento. Lasciare riposare all'interno di un'incubatrice vassoi di incubazione a temperatura ambiente.
  3. Osservare bene piatti ogni giorno sotto un microscopio per dissezione senza rimuovere il coperchio delle piastre bene. Assicurare che le larve sono vive controllando per il movimento. Se viene rilevato alcun movimento, scartare la tazza di latta contenenti le larve morte e la fornitura di polline rimanenti. Consentire tutte le larve sopravvissute a sviluppare indisturbati all'interno i piatti ben fino a raggiungere la fase di prepupa.
  4. Rimuovere la larva dalla tazza di latta, una volta che raggiunge il palco prepupa41. Usare una spazzola per pulire qualsiasi defecare dal bozzolo di seta. Accuratamente tagliare attraverso il bozzolo di seta utilizzando un microscopio per dissezione ed estrarre la prepupa con il forcipe di gomma.
  5. Gestire la prepupa delicatamente per garantire che gli strumenti non perforare il corpo molle. Registrare il peso fresco di prepupa (prepupa biomassa) e il tempo dello sviluppo dall'uovo alla fase prepupa (ora dello sviluppo larvale).
    Nota: Qualsiasi larva morta deve essere eliminata immediatamente per evitare un indesiderato accrescimento microbica sul cadavere e la fornitura di polline avanzi. Questo riduce il rischio di infezione per le larve di sane rimanenti.

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Representative Results

Larvale fitness è stato quantificato utilizzando tre metriche tempo inerente allo sviluppo (i) larvale, biomassa (ii) prepupa e (iii) percentuale sopravvivenza. Un ANOVA a due vie è stata condotta utilizzando l'esposizione fungicida (due livelli: nessun fungicida, fungicida) e fonte di polline (due livelli: Host polline, polline Non-host) come variabili indipendenti e dello sviluppo larvale ora come la variabile dipendente. L'effetto principale per l'esposizione di fungicida (F1,28 = 1,24, P = 0.28) era non significativo tra il fungicida-trattati (media ± SE) (28.14 ±1.98 s, N = 14) e non trattati (25.39 ± 1,65 d, N = 18) gruppi. L'effetto principale per fonte di polline, tuttavia, hanno indicato una differenza significativa tra tempo inerente allo sviluppo per larve sollevato il polline di host (20.00 ± 0,50 d, N = 16) e non host polline (33.19 ±0.81 s, N = 16) (F1,28 = 179.83, P < 0.001). Bonferroni corretto i confronti Post-hoc indicato che tempo inerente allo sviluppo larvale non variano significativamente tra fungicida-trattati e non trattati gruppi generati sull'host (P = 0,57) e non host (P = 0.32) polline. Tuttavia, tempo dello sviluppo larvale era significativamente più breve per le larve sollevate il polline host rispetto al polline non host per entrambi fungicida-trattati (P < 0,001) e non trattati (P < 0,001) polline. L'effetto di interazione (fonte di polline del × di esposizione di fungicida) non era significativa (F1,28 = 0,09, P = 0,77). L'analisi è stata ripetuta utilizzando biomassa prepupa come la variabile dipendente. L'effetto principale per l'esposizione di fungicida indicato una differenza significativa (F1,28 = 4,66, P = 0,04) tra il fungicida-trattati (0,123 ± 0,01 g, N = 14) e non trattati (0.149 ± 0,01 g, N = 18) gruppi. L'effetto principale per fonte di polline (F1,28 = 56.30, P < 0,001) indicato una differenza significativa tra le larve sollevato il polline di host (0,170 ± 0,01 g, N = 16) e non host polline (0,105 ± 0,01 g, N = 16) . Bonferroni corretto i confronti Post-hoc ha indicato che la biomassa prepupa non variano significativamente tra fungicida-trattati e non trattati gruppi generati sull'host (P = 0,22) e non host (P = 0,08) polline. Tuttavia, prepupa biomassa era significativamente più alta tra larve sollevate il polline host rispetto al polline non host per entrambi fungicida-trattati (P < 0,001) e non trattati (P < 0,001) polline. L'effetto di interazione (fonte di polline del × di esposizione di fungicida) non era significativa (F1,28 = 0.132, P = 0,72). Figura 5 e Figura 6 sono rappresentazioni grafiche dei risultati emersi dall'analisi di cui sopra. Campioni indipendenti t-test ha indicato un effetto significativo dell'origine di polline sulla sopravvivenza larvale (N = 18, t9 =-2.45, P =0,04).

Figure 5
Figura 5. Grafico a barre metriche per larvale fitness basato su tempo inerente allo sviluppo larvale e biomassa prepupa. Metriche di fitness larvale sono cluster basato su (A) e (B) fonte di polline; e l'esposizione (C) e (D) fungicida. (Media ± 1 SE). P < 0,001 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Nella figura 6. Trama di interazione per le metriche di fitness larvale. Gli effetti interattivi di esposizione fungicida e fonte di polline al tempo inerente allo sviluppo larvale (A) e (B) prepupa biomassa. (Media ± 1 SE). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Pearsons correlazione è stata utilizzata per esplorare il rapporto tra il tempo dello sviluppo larvale e prepupa biomassa (Figura 7). Una correlazione negativa significativa è stata notata in tutti i gruppi di trattamento (r =-0.83, P < 0,001, N = 32) e attraverso trattamenti fungicidi (nessun fungicida: r = -0,76, P < 0,001, N = 18; Fungicida: r =-0.92, P < 0,001, N = 14). Mentre c'era una correlazione negativa significativa per le larve sollevato il polline non host (r =-0.64, P < 0.01, N = 16), nessun tale relazione è stata osservata per larve generate sull'host-polline (r = -0,01, P = 0.98, N = 16).

Figure 7
Figura 7. Relazione tra tempo inerente allo sviluppo larvale e biomassa prepupa. Correlazione di Pearson tra tempo inerente allo sviluppo e prepupa biomassa attraverso (A) tutti i gruppi di trattamento (P < 0,001) fonte di polline (B) (ospitare polline: P = 0.98, polline Non-ospite: P < 0.01); Esposizione di fungicida (C) (nessun fungicida: P < 0,001, fungicida: P < 0,001). Per pannelli (B) e (C), le linee di tendenza sono in tinta con i simboli della legenda della figura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1
Animato nella figura 1. Quinto instar larvale fase di o. ribifloris all'interno di un singolo pozzo di una piastra multipozzetto. La larva è noto per avere iniziato un bozzolo silken in preparazione per impupamento di filatura. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

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Discussion

Allevamento di API fuori loro canne nidificazione naturale, in condizioni di laboratorio, permette il testing di molteplici ipotesi relative al fitness larvale. Nella misura in cui non identificati fattori continuano a causare mortalità delle API, studi di valutazione del rischio utilizzando in vitro esperimenti possono aiutare identificare potenziali minacce e informare le pratiche di gestione per questo gruppo di specie-ricco degli impollinatori selvatici 12 ,38,49,76,81,82.

In generale, tempi di sviluppo più brevi e maggiore biomassa prepupa è associata con maggiore fitness larvale. Attraverso tutti i trattamenti, la durata dello sviluppo larvale è stato correlato negativamente con biomassa prepupa. Tuttavia, c'erano differenze significative fra la durata dello sviluppo larvale e prepupa biomassa attraverso quattro gruppi. Le larve che non hanno ricevuto alcun fungicidi e sono stata autorizzate a consumare polline host ha avuto il minor tempo di sviluppo larvale e più alto prepupa biomassa. Al contrario, quelli larve che consumate fungicida-trattati non host polline, preso il più lungo a completo sviluppo larvale e aveva la biomassa più basso prepupa. Tuttavia, le tendenze per la sopravvivenza larvale erano meno chiare, con mortalità essendo noto solo per il gruppo trattato con fungicida sollevato il polline di host. Decostruire gli effetti principali e interazione dell'esposizione di fungicida e fonte di polline ha rivelato che: (i) l'effetto principale del consumo di polline fungicida-trattati ha avuto un impatto negativo significativo sulla biomassa prepupa, ma la durata dello sviluppo larvale non. Mentre uno studio precedente ha dimostrato tossicità orale acuta in adulti Osmia alle più alte concentrazioni di, questi risultati suggeriscono che esposizione orale a propiconazolo a ben più basso di concentrazione può interessare fitness riducendo prepupa biomassa23 . (ii) l'effetto principale del consumo di polline non host ha un effetto negativo sulla forma larvale. Questi risultati sono coerenti con gli studi precedentemente pubblicati che suggeriscono qualità di polline (cioè, la presenza di tossine, composti protettivi, carenza di nutrienti essenziali), e differenze nella fisiologia dell'ape possono limitare le API dall'utilizzazione non host polline68 . È anche probabile che l'assenza del microbiota benefico in genere acquisito da host-polline e/o ape raccolto può esacerbare questo effetto. (iii) non c'era nessuna interazione significativa tra esposizione fungicida e fonte di polline in fitness larvale. Tra gruppi di fungicida-trattati e non trattati, larve consumano non host polline avevano significativamente più basso prepupa biomassa e larvale inerente allo sviluppo più lungo rispetto alle larve sollevate il polline di host. Indipendentemente dalla fonte di polline, larve consumano fungicida-trattati disposizioni avevano biomassa prepupa significativamente più basso rispetto alle larve sollevate il polline non trattati. A parte i principali effetti significativi, l'effetto interattivo di entrambi i fattori conformato al modello additivo, cioè, gli effetti negativi dell'esposizione e polline tipo di fungicida su fitness larvale non erano sinergici. Le incertezze derivanti dalla interazione di vari fattori determinanti della salute delle API (come dettagliato qui), vincolare l'efficacia delle strategie di gestione di impollinatore. Aiutando a prevedere gli effetti interattivi di fattori di rischio multipli, risultati dagli esperimenti simili basati su laboratorio possono aiutare gli sforzi di conservazione dell'ape di aggirare questa sfida di vecchia data.

Ci sono diversi passaggi critici all'interno di questo protocollo che possono influenzare il risultato dell'esperimento. Quando possibile, si consiglia di usare il polline biologico che è privo di residui di antiparassitari. L'utilizzo di polline provenienti da fonti sconosciute aumenta il rischio di contaminazione con prodotti agrochimici diversi, che possono confondere i risultati sperimentali. È importante ottenere appena collegato Osmia nidificazione ance affinché solo unhatched le uova o larve molto giovani sono utilizzate nello studio. Questo assicura che le larve sono allevate quasi interamente sul tipo di trattamento previsto polline. La nidificazione reed dovrebbe essere dissecata usando un'incisione superficiale, in mancanza della quale le disposizioni di polline e uova possono essere danneggiate durante la raccolta. Una volta che le uova sono state rimosse devono essere trattati delicatamente per evitare danni e mantenuti nelle barche di pesare in un ambiente igienico scuro fresco (ad es., di biosicurezza) finche ' non vengono trasferiti. Questo tempo di attesa dovrebbe essere ridotto al minimo (< 30 min) per garantire che la qualità dell'uovo non è compromessa. Tutte le procedure devono essere eseguite in una cappa di biosicurezza per garantire un pulito ambiente di lavoro e ridurre le probabilità di contaminazione. Per garantire la loro efficacia, utilizzare solo soluzioni preparate fungicida per i trattamenti. Dato che il polline è idrofobo, la soluzione fungicida / acqua sterile deve essere introdotto nella depressione effettuata nell'ambito di disposizioni di polline. Questo massimizza il volume di liquido che permea attraverso la fornitura. Tuttavia, è importante che la depressione non perforare tutta la profondità della disposizione, come si tradurrebbe nella perdita di volume dalla soluzione aderente al pavimento capsula. I controlli e trattamenti individuali devono svolgersi in piastre a pozzetti separati per ridurre le possibilità di contaminazione da composti volatili e/o a carico di polline microbiota. Pezzi di nastro piegato devono essere collegati ai bordi della piastra per permettere sufficiente spazio d'aria una volta che i coperchi sono in atto. Durante osservazioni quotidiane, le piastre devono essere maneggiate delicatamente per ridurre al minimo le larve. Osservazioni al microscopio con minima intensità luminosa, e i coperchi non dovrebbero essere rimosso a meno che per eliminare le larve morte. In caso di imprevisti diffusa mortalità, sia larve e dalle relative disposizioni di polline devono essere ispezionati visivamente per verificare eventuali segni di infezione e infestazione. Le piastre a pozzetti contenenti la replica di compromessa dovrebbero essere immediatamente scartato, disinfettato l'area di lavoro e strumenti sterilizzati per prevenire la diffusione dell'infezione.

Nonostante la vasta applicazione, esistono alcune limitazioni a questo metodo. Per esempio, mentre è consigliabile utilizzare organici polline ogni volta che è disponibile, aumentare le piante all'interno di un ambiente serra per produrre una quantità sufficiente di pura incontaminata polline è logisticamente proibitivo. In tali casi, polline raccolto selvaggio può essere utilizzati, purché si è sottoposti a screening per la presenza di residui di antiparassitari. Un'altra strategia per ridurre il rischio di contaminazione, quando si utilizza il polline raccolto selvaggio è quello di ottenere il polline da una fonte che è meno probabile essere stato spruzzato (ad es., incontaminate zone indisturbate situati lontano dalle fattorie agricole). Il polline di host utilizzato in questo studio è stato ottenuto da nidificazione ance che sono stati collocati in boschi naturali e praterie circostanti ai piedi delle Wasatch Range vicino Kaysville, Utah. Dato che questa regione è dominata da foreste naturali selvaggi, non gestiti lontano da qualsiasi commerciale zone agricole e che queste API non volano per quanto riguarda le API il miele quando foraggiamento83,84,85, è estremamente improbabile che il polline hanno raccolto sarebbe stato spruzzato. Così, residui di pesticidi nel polline raccolto qui rischiano di essere banale. Foraggiamento in tali paesaggi selvaggi, la femmina adulta è meno probabile incontrare polline contaminati, riducendo il rischio di esposizione tra le larve. Il polline dell'ape mellifica acquistato in commercio utilizzato in questo studio è raccolti da zone boschive naturali nel nord del Wisconsin e nel Michigan. Commercializzati per il consumo umano, informazioni pubblicamente disponibili e personali di comunicazione con il fornitore indica che l'orticaria non è trattati chimicamente, e il polline viene venduto nella sua forma naturale, cruda senza eventuali modifiche86. Pertanto, è ragionevole supporre che il carico inquinante nel polline dell'ape mellifica acquistato in commercio sarebbe minimo. Per gli studi che non ottenere il polline da non gestiti aree con vegetazione naturale selvaggia, è consigliabile avere evidenza empirica diretta da analisi chimica del polline per garantire che il polline utilizzato nelle analisi di rischio è contaminante libero. Un'altra limitazione comporta l'espediente introdotto dall'ambiente di allevamento artificiale. Nonostante i migliori sforzi, non è logisticamente possibile replicare il microambiente esatto all'interno di una canna di nidificazione naturale (ad es., umidità, concentrazione di ossigeno, la struttura tridimensionale delle singole camere), che possano avere impatto larvale fitness a gradi sconosciuti. Per modo difendibile simulare le caratteristiche della dieta naturale, dati preliminari da canne di nidificazione devono essere ottenuti prima in vitro studi di manipolazione di dieta. Anche se il polline non host utilizzato in questo studio è ottenuto dalle zone dove l'uva di Oregon è assenti o rari87, ci possono essere tracce di polline di host miscelati nel polline acquistato in commercio, potrebbero compromettere i risultati. Un altro svantaggio di questa tecnica è che la gestione dello stress durante il periodo sperimentale può provocare effetti negativi sulle API. Infine, mentre è comune incontrare unhatched le uova in natura63, in condizioni di laboratorio è difficile da accertare se il guasto a covare era a causa di stress, trattamento sperimentale o un risultato di cause naturali. Poiché questi fattori possono introdurre gradi sconosciuti di bias in studio, si deve usare cautela durante l'interpretazione dei risultati ottenuti.

Controllando per i fattori che possono in modo dimostrabile bias risultato sperimentale (ad es., materna foraggiamento efficienza75, sesso-specifiche variazioni77e polline dietetico68,72), il protocollo descritto fornisce miglioramenti sostanziali oltre precedentemente pubblicato tecniche76e offre un quadro più rigoroso per test di ipotesi. Per esempio, usando in vitro-api allevate permette indagini su sesso-specifiche risposte al trattamento xenobiotici, che altrimenti sarebbe difficile per studiare tra popolazioni selvatiche di cavità di nidificazione API49,88. Il potenziale per il maneggiamento e test multipli fattori interagenti (ad es., dieta qualità e quantità, associato a dieta microbiota, l'esposizione ai pesticidi sinergici), in grado di fornire preziose informazioni determinanti della fitness ape. La flessibilità del protocollo prontamente permette modifiche (ad esempio, utilizzando diverse dimensioni piastre a pozzetti per ospitare le larve di diverse dimensioni, cambiare il tipo e la quantità della dieta), che lo rende favorevole per l'utilizzo con numerose altre specie di api solitarie e vespe 76. durante questa studio valutato fitness basata sullo sviluppo e la sopravvivenza nella fase di alimentazione, gli insetti possono essere incubati fino ad emergere per ottenere ulteriori dati sul tasso di emersione, la conversione di cibo-a-corpo e longevità di postemergenza 49. queste informazioni possono aiutare a valutare gli effetti sub-letali di trattamenti nei saggi di tossicità. Con crescente interesse nella funzione del polline-microbiome, studi basati su laboratorio possono identificare sensibili contro specie di ape resistente basato il loro polline microbiota71. Differenze nella suscettibilità di fungicida tra gruppi di ape possono essere esplorate sequenziando il microbiota all'interno polline alveare-memorizzati. Questo può aiutare a verificare il ruolo del microbioma polline nel conferire diversi gradi di resistenza ai fattori di sforzo xenobiotici. Gli studi futuri possono anche aiutare a identificare le differenze tra il microbiota naturale di polline host e non host, che può servire come un fattore di fondo guida oligolectic comportamento all'interno di specie di API select.

L'in vitro allevamento di api solitarie larvale può aiutare a controllo per la variabilità naturale sperimentata in natura, quindi delineare il ruolo dei fattori individuali e interagenti nel colpire fitness ape. Questa tecnica accessibile e poco costoso si espande toolkit degli entomologi consentendo per la manipolazione di diversi parametri, che possono essere facilmente modificati per obiettivi specifici di ricerca indirizzo. Se la prova dagli esperimenti in vitro può aiutare a identificare le popolazioni a rischio, l'impatto sulle strategie di conservazione ape sarà sostanza.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Kimball Clark e Tim Krogh per fornire Osmia nidificazione ance, Meredith Nesbitt e Molly Bidwell per assistenza in laboratorio, d. ssa Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter e tre utenti anonimi per loro osservazioni utili che il manoscritto è migliorato. Questo lavoro è stato sostenuto USDA-Agricultural Research Service appropriato (attuale ricerca Information System #3655-21220-001), Wisconsin Dipartimento dell'agricoltura, commercio e tutela dei consumatori (#197199), National Science Foundation (sotto Grant No. DEB-1442148), il DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (ufficio DOE di scienza BER DE-FC02-07ER64494).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reeds Nativebees.com NA Freshly plugged reeds
Dissection set VWR 89259-964 Sterilize before use
Long Nose Pliers Husky 1006
6 well culture plates VWR 10062-892 Sterile sealed
48 well culture plates VWR 10062-898 Sterile sealed
Petri dishes VWR 25373100 Sterile sealed
Square Weighing Boats VWR 10770-448
Camel Hair Brush Bioquip 1153A
Tin capsules EA Consumables D1021 Sterilize before use
Sucrose VWR 470302-808
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Honey bee pollen Bee energised 897098001244 Untreated, natural, raw pollen
Microbalance VWR 10204-990
Pulverisette LAB SYNERGY INC. 30334913
Wooden sticks VWR 470146908 Sterilize before use
Sealing tape VWR 89097-912
Microscope VWR 89403-384
Planting tray VWR 470150-632
Ethanol VWR BDH1158-4LP
Centrifuge tube VWR 21008936
Microsyringe Cole-Palmer UX-07940-07
Rubber tweezer Amazon B0135HWPN4
Syringe needles VWR 89219-334
Freeze drier Labcono LFZ-1L
Statistical software SPSS Version 21.0

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References

  1. Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. P Roy Soc Lond B Bio. 274 (1608), 303-313 (2007).
  2. Biesmeijer, J. C. J., et al. Parallel declines in pollinators and insect-pollinated plants in Britain and the Netherlands. Science. 313 (5785), 351-354 (2006).
  3. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evol. 25 (6), 345-353 (2010).
  4. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. P Natl Acad Sci USA. 108 (2), 662-667 (2011).
  5. Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. Economic valuation of the vunerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ. 68 (3), 810-821 (2009).
  6. Fontaine, C., Dajoz, I., Meriguet, J., Loreau, M. Functional diversity of plant-pollinator interaction webs enhances the persistence of plant communities. Plos Biol. 4 (1), 0129-0135 (2006).
  7. Kluser, S., Peduzzi, P. Global pollinator decline: a literature review. , UNEP/GRID Europe. (2007).
  8. Brown, M. J. F., Paxton, R. J. The conservation of bees: a global perspective. Apidologie. 40 (3), (2009).
  9. Lebuhn, G., et al. Detecting insect pollinator declines on regional and global scales. Conserv Biol. 27 (1), (2013).
  10. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. , Suppl 103. S80-S95 (2010).
  11. Pettis, J. S., Delaplane, K. S. Coordinated responses to honey bee decline in the USA. Apidologie. 41 (3), 256-263 (2010).
  12. Sandrock, C., Tanadini, L. G., Pettis, J. S., Biesmeijer, J. C., Potts, S. G., Neumann, P. Sublethal neonicotinoid insecticide exposure reduces solitary bee reproductive success. Agr Forest Entomol. 16 (2), (2014).
  13. Van der Sluijs, J. P., Simon-Delso, N., Goulson, D., Maxim, L., Bonmatin, J. M., Belzunces, L. P. Neonicotinoids, bee disorders and the sustainability of pollinator services. Curr Opin Env Sust. 5 (3), (2013).
  14. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), (2015).
  15. Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity - USA. Apidologie. 41 (3), (2010).
  16. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23 (5), 371-378 (2004).
  17. Glavan, G., Bozic, J. The synergy of xenobiotics in honey bee Apis mellifera: mechanisms and effects. Acta Biol. Slov. 56, 11-27 (2013).
  18. Biddinger, D. J., et al. Comparative toxicities and synergism of apple orchard pesticides to Apis mellifera (L.) and Osmia cornifrons (Radoszkowski). PLoS ONE. 8 (9), e72587 (2013).
  19. Thompson, H. M., Fryday, S. L., Harkin, S., Milner, S. Potential impacts of synergism in honeybees (Apis mellifera) of exposure to neonicotinoids and sprayed fungicides in crops. Apidologie. 45 (5), 545-553 (2014).
  20. Jansen, J. -P., Lauvaux, S., Gruntowy, J., Denayer, J. Possible synergistic effects of fungicide-insecticide mixtures on beneficial arthropods. IOBC-WPRS Bulletin. 125, 28-35 (2017).
  21. Robinson, A., Hesketh, H., et al. Comparing bee species responses to chemical mixtures: Common response patterns? PLoS ONE. 12 (6), (2017).
  22. Sgolastra, F., Medrzycki, P., et al. Synergistic mortality between a neonicotinoid insecticide and an ergosterol-biosynthesis-inhibiting fungicide in three bee species. Pest Management Science. 73 (6), 1236-1243 (2017).
  23. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  24. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PloS one. 5 (3), e9754 (2010).
  25. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PloS one. 8 (7), e70182 (2013).
  26. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  27. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PloS one. 9 (1), e77547 (2014).
  28. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  29. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. P Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1809), 20150299-20150299 (2015).
  30. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  31. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J Exp Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  32. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), e0135688 (2015).
  33. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pestic Biochem Phys. 51 (1), 1-11 (1995).
  34. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of pyrethroid insecticide toxicity to honey bees (Hymenoptera: Apidae) by cytochrome P450 monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (4), 1046-1050 (2006).
  35. Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L. A., Currie, C. R., Zalapa, J. E., Hittinger, C. T. Empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health. JoVE. (128), e54631 (2017).
  36. Batra, S. W. T. Solitary bees. Sci Am. 250 (2), 120-127 (1984).
  37. Linsley, E. G. The ecology of solitary bees. Hilgardia. 27 (19), 543-599 (1958).
  38. Garibaldi, L. A., et al. Wild Pollinators Enhance Fruit Set of Crops Regardless of Honey Bee Abundance. Science. 339 (6127), 1608-1611 (2013).
  39. Bosch, J., Kemp, W. P. How to manage the blue orchard bee. , Sustainable Agriculture Network. Washington, DC. (2001).
  40. Keller, A., Grimmer, G., Steffan-Dewenter, I. Diverse microbiota identified in whole intact nest chambers of the red mason bee Osmia bicornis (Linnaeus 1758). PLoS ONE. 8 (10), e78296 (2013).
  41. Bosch, J., Kemp, W. P. Development and Emergence of the Orchard Pollinator Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae). Environmental Entomology. 29 (1), 8-13 (2000).
  42. Brittain, C., Potts, S. G. The potential impacts of insecticides on the life-history traits of bees and the consequences for pollination. Basic and Applied Ecology. 12 (4), 321-331 (2011).
  43. Arena, M., Sgolastra, F. A meta-analysis comparing the sensitivity of bees to pesticides. Ecotoxicology. 23 (3), 324-334 (2014).
  44. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Foraging and nesting behavior of Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae) in the presence of fungicides: cage studies. J Econ Entomol. 101 (3), 647-653 (2008).
  45. Huntzinger, A. C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide tests on adult alfalfa leafcutting bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  46. Tsvetkov, N., et al. Chronic exposure to neonicotinoids reduces honey bee health near corn crops. Science. 356 (6345), 1395-1397 (2017).
  47. Mao, W., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Disruption of quercetin metabolism by fungicide affects energy production in honey bees (Apis mellifera). P Natl Acad Sci. 114 (10), 2538-2543 (2017).
  48. Blacquière, T., Smagghe, G., Van Gestel, C. A. M., Mommaerts, V. Neonicotinoids in bees: A review on concentrations, side-effects and risk assessment. Ecotoxicology. 21 (4), 973-992 (2012).
  49. Sgolastra, F., Tosi, S., Medrzycki, P., Porrini, C., Burgio, G. Toxicity of spirotetramat on solitary bee larvae, Osmia cornuta (Hymenoptera: Megachilidae), in laboratory conditions. Journal of Apicultural Science. 59 (2), 73-83 (2015).
  50. Mader, E., Spivak, M., Evans, E. Managing Alternative Pollinators. , Sustainable Agriculture Research and Education (SARE), US Dept. of Agriculture. (2010).
  51. Bosch, J., Kemp, W. P. Developing and establishing bee species as crop pollinators: the example of Osmia spp.(Hymenoptera: Megachilidae) and fruit trees. B Entomol Res. 92 (1), 3-16 (2002).
  52. Sampson, B. J., Rinehart, T. A., Kirker, G. T., Stringer, S. J., Werle, C. T. Phenotypic variation in fitness traits of a managed solitary bee, Osmia ribifloris (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 108 (6), 2589-2598 (2015).
  53. Sampson, B. J., Cane, J. H., Kirker, G. T., Stringer, S. J., Spiers, J. M. Biology and management potential for three orchard bee species (Hymenoptera: Megachilidae): Osmia ribifloris Cockerell, O. lignaria (Say) and O.chalybea Smith with emphasis on the former. Acta Hort. 810, 549-555 (2009).
  54. Hladik, M. L., Vandever, M., Smalling, K. L. Exposure of native bees foraging in an agricultural landscape to current-use pesticides. Sci Total Environ. 542, 469-477 (2016).
  55. Long, E. Y., Krupke, C. H. Non-cultivated plants present a season-long route of pesticide exposure for honey bees. Nat Commun. 7, (2016).
  56. Krupke, C. H., Hunt, G. J., Eitzer, B. D., Andino, G., Given, K. Multiple routes of pesticide exposure for honey bees living near agricultural fields. PLoS ONE. 7 (1), e29268 (2012).
  57. Stoner, K. A., Eitzer, B. D. Using a hazard quotient to evaluate pesticide residues detected in pollen trapped from honey bees (Apis mellifera) in Connecticut. PLoS ONE. 8 (10), e77550 (2013).
  58. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  59. Steffan-Dewenter, I., Klein, A. -M., Gaebele, V., Alfert, T., Tscharntke, T. Bee diversity and plant-pollinator interactions in fragmented landscapes. Specialization and generalization in plant-pollinator interactions. , 387-410 (2006).
  60. Kremen, C., Ricketts, T. Global perspectives on pollination disruptions. Conserv Biol. 14 (5), 1226-1228 (2000).
  61. Memmott, J., Waser, N. M., Price, M. V. Tolerance of pollination networks to species extinctions. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1557), 2605-2611 (2004).
  62. Spear, D. M., Silverman, S., Forrest, J. R. K. Asteraceae pollen provisions protect Osmia mason bees (Hymenoptera: Megachilidae) from brood parasitism. The American Naturalist. 187 (6), 797-803 (2016).
  63. Rust, R. W. Biology of Osmia (Osmia) ribifloris Cockerell (Hymenoptera: Megachilidae). J Kansas Entomol Soc. 59, 89-94 (1986).
  64. Torchio, P. F. Osmia ribifloris, a native bee species developed as a commercially managed pollinator of highbush blueberry (Hymenoptera: Megachilidae). J Kansas Entomol Soc. 63 (633), 427-436 (1990).
  65. Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees - A risk assessment. PLoS ONE. 9 (4), e94482 (2014).
  66. Kasiotis, K. M., Anagnostopoulos, C., Anastasiadou, P., Machera, K. Pesticide residues in honeybees, honey and bee pollen by LC-MS/MS screening: Reported death incidents in honeybees. Sci Total Environ. 485 (1), 633-642 (2014).
  67. Stanley, J., Sah, K., Jain, S. K., Bhatt, J. C., Sushil, S. N. Evaluation of pesticide toxicity at their field recommended doses to honeybees, Apis cerana and A. mellifera through laboratory, semi-field and field studies. Chemosphere. 119, 668-674 (2015).
  68. Praz, C. J., Müller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen? Ecology. 89 (3), 795-804 (2008).
  69. Sedivy, C., Müller, A., Dorn, S. Closely related pollen generalist bees differ in their ability to develop on the same pollen diet: Evidence for physiological adaptations to digest pollen. Funct Ecol. 25 (3), 718-725 (2011).
  70. Williams, N. M. Use of novel pollen species by specialist and generalist solitary bees (Hymenoptera: Megachilidae). Oecologia. 134, (2003).
  71. Graystock, P., Rehan, S. M., McFrederick, Q. S. Hunting for healthy microbiomes: determining the core microbiomes of Ceratina, Megalopta, and Apis bees and how they associate with microbes in bee collected pollen. Conserv Genet. 18 (3), 1-11 (2017).
  72. Bosch, J., Vicens, N. Relationship between body size, provisioning rate, longevity and reproductive success in females of the solitary bee Osmia cornuta. Behav Ecol Sociobiol. 60 (1), 26-33 (2006).
  73. Bosch, J., Vicens, N. Body size as an estimator of production costs in a solitary bee. Ecol Entomol. 27 (2), 129-137 (2002).
  74. Radmacher, S., Strohm, E. Factors affecting offspring body size in the solitary bee Osmia bicornis (Hymenoptera, Megachilidae). Apidologie. 41 (2), 169-177 (2010).
  75. Seidelmann, K. Open-cell parasitism shapes maternal investment patterns in the Red Mason bee Osmia rufa. Behav Ecol. 17 (5), (2006).
  76. Becker, M. C., Keller, A. Laboratory rearing of solitary bees and wasps. Insect Science. 23 (6), 918-923 (2016).
  77. Bosch, J. The nesting behaviour of the mason bee Osmia cornuta (Latr) with special reference to its pollinating potential (Hymenoptera, Megachilidae). Apidologie. 25, 84-93 (1994).
  78. Krunić, M., Stanisavljević, L., Pinzauti, M., Felicioli, A. The accompanying fauna of Osmia cornuta and Osmia rufa and effective measures of protection. B Insectol. 58 (2), 141-152 (2005).
  79. Elliott, S. E., Irwin, R. E., Adler, L. S., Williams, N. M. The nectar alkaloid, gelsemine, does not affect offspring performance of a native solitary bee, Osmia lignaria (Megachilidae). Ecol Entomol. 33 (2), 298-304 (2008).
  80. Toby Mordkoff, J. The Assumption(s) of Normality. , Available from: http://www2.psychology.uiowa.edu/faculty/mordkoff/GradStats/part 1/I.07 normal.pdf (2016).
  81. Hendriksma, H. P., Härtel, S., Steffan-Dewenter, I. Honey bee risk assessment: New approaches for in vitro larvae rearing and data analyses. Methods Ecol and Evol. 2 (5), 509-517 (2011).
  82. Aupinel, P., et al. Improvement of artificial feeding in a standard in vitro method for rearing Apis mellifera larvae. B Insectol. 58 (2), 107-111 (2005).
  83. Beekman, M., Ratnieks, F. L. W. Long-range foraging by the honey-bee, Apis mellifera L. Funct Ecol. 14 (4), 490-496 (2000).
  84. Gathmann, A., Tscharntke, T. Foraging ranges of solitary bees. J Anim Ecol. 71 (5), 757-764 (2002).
  85. Greenleaf, S. S., Williams, N. M., Winfree, R., Kremen, C. Bee foraging ranges and their relationship to body size. Oecologia. 153 (3), 589-596 (2007).
  86. Bee Pollen Supplement - Bee Rescued. , Available from: https://beerescued.com/product/bee-rescued-bee-pollen-supplement/ (2018).
  87. Holly-Leaf Oregon-Grape (Mahonia aquifolium) Species Details and Allergy Info, Teton county, Wyoming. , Available from: http://www.pollenlibrary.com/Local/Specie/Mahonia+aquifolium/in/Teton County/WY/ (2018).
  88. Cane, J. H., Griswold, T., Parker, F. D. Substrates and Materials Used for Nesting by North American Osmia Bees (Hymenoptera: Apiformes: Megachilidae). Annals of the Entomological Society of America. 100 (3), 350-358 (2007).

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Dharampal, P. S., Carlson, C. M.,… More

Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).

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