Summary
꽃 식물에 균 스프레이 고독한 꿀벌 꽃가루 부담 균 잔류물의 높은 농도에 노출 될 수 있습니다. 실험실 기반 실험 체 외에관련 된을 사용 하 여-reared 꿀벌 애벌레,이 연구 균 처리 꽃가루 호스트와 호스트 비 식물에서 파생 된 소모의 대화형 효과 조사.
Abstract
고독한 꿀벌 와일드 하 고 관리 되는 작물에 대 한 중요 일 분의 서비스를 제공 하는 있지만이 종 부유한 그룹 크게 간과 되어 농약 규제 연구. 살 균 제 잔류물에 노출의 모험 경우 스프레이 또는 호스트 식물 근처에, 꿀벌은 그들의 둥지를 구축 하는 꽃가루를 수집 하는 동안 특히 높을 것입니다. 꽃가루 식물 (oligolecty)의 선택 그룹에서 사용 하는 Osmia 의 종, 비 호스트 식물에서 꽃가루를 사용 하는 무 능력 살 균 제 관련 독성에 대 한 그들의 위험 요소를 높일 수 있습니다. 이 원고는 성공적으로 oligolectic 메이슨 꿀벌, 표준화 된 실험실 조건에서 세포 배양 배지 내에서 prepupal 단계를 달걀에서 Osmia ribifloris sensu lato 후면에 사용 되는 프로토콜을 설명 합니다. 생체 외에서-reared 꿀벌 이후 벌 체력에 살 균 제 노출 및 꽃가루 소스의 효과 조사 하기 위해 사용 됩니다. 2 × 2 완전히 넘어 계승 디자인에 따라 실험 prepupal 바이오 매스, 애벌레 발달 시간 및 survivorship 계량 애벌레 피트 니스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 근원의 주요 및 대화형 효과 검사 합니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 외에서사용 하 여-reared 꿀벌 자연 배경 가변성을 감소 시킨다 고 여러 실험적인 매개 변수의 동시 조작 있습니다. 설명된 프로토콜 가설 꿀벌 건강에 영향을 미치는 요인의 제품군과 관련 된 테스트에 대 한 다양 한 도구를 제공 합니다. 중요 한, 지속적인 성공을 충족 되어야 보존 노력에 대 한 꿀벌 감소를 촉진 하는 생리와 환경 요인의 복잡 한 상호 작용으로 이러한 통찰력 중요할 증명할 것 이다.
Introduction
곤충 가루1의 지배적인 그룹으로 서의 역할을 감안할 때, 꿀벌 인구에 있는 글로벌 손실 위협이 식량 안보 및 생태계 안정성2,3,,45,6 ,7. 모두와 야생 꿀벌 인구에 있는 감소 추세 있다 서식 지 파편, 신흥 기생충 및 병원 균, 유전적 다양성의 손실 및 침입 종3의 도입을 포함 한 여러 공유 위험 요인에 기인 ,4,7,8,9,10,,1112. 특히, 증가 (예를 들어, neonicotinoids), 농약의 사용은 꿀벌13,,1415간의 해로운 효과에 직접 연결 되었다. 여러 연구 neonicotinoids 사이의 ergosterol 생 합성 억제 (비) 살 균 제 성분 여러 벌 종16,,1718 에서 높은 사망으로 이어질 수 있습니다. , 19 , 20 , 21 , 22. 그럼에도 불구 하 고, 살 균 제, 긴 ' 비 안전 '으로 간주 많은 감시23없이 꽃에서 작물에 살포 될 계속. 채집 자 벌 려 정기적으로 살 균 제 잔류물24,,2526으로 오염 하는 꽃가루 중 문서화 되었습니다. 같은 살 균 제 ladenpollen의 소비 애벌레 꿀벌27,,2829,30및 성인 꿀벌16 중 하위 치명적인 효과의 제품군 중 높은 사망을 일으킬 수 있습니다. , 31 , 32 , 33 , 34. 최근 연구 제안 fungicides 꿀벌 꽃가루 부담 미생물35사이 중요 한 공생을 방해 함으로써 하이브 저장 꽃가루 내 미생물 커뮤니티를 변경 하 여 비 손실을 발생할 수 있습니다.
고독한 꿀벌은 여러 야생 및 농업 식물36,37,의 수 분에 대 한 중요 한38, 가루의이 다양 한 그룹 연구를 모니터링 하는 농약에 훨씬 덜 관심을 받고 있다. 성인 고독한 여성의 둥지 5-10 봉인된 브루 드 챔버, 각 임산부 수집 꽃가루와 꿀, 그리고 단일 계란39의 유한 질량 갖춰져 있습니다. 후에 부 화, 애벌레 할당 된 꽃가루 규정 그리고 적절 한 영양40,41관련된 꽃가루 부담 microbiota에 의존 합니다. 사회 생활의 혜택, 부족 하기 때문에 고독한 꿀벌 농약 노출42에 더 취약 있을 수 있습니다. 예를 들어, 다음 스프레이 사회 꿀벌에 적자 동안 보상 수도를 일부 노동자에 의해 확장 하 고 새로 가만히 신흥, 단일 성인 고독한 여자의 죽음 끝 모든 생식 활동43. 민감성에 이러한 차이 ecotoxicological 연구와 야생 꿀벌 모두에 대 한 적절 한 보호를 보장 하기 위해 다양 한 비 taxa를 통합할 필요가 강조 표시 합니다. 그러나, 연구의 한 줌, 외 균 노출의 효과에 대 한 조사는 주로에 초점을 맞춘 사회적 꿀벌18,23,32,44,45 ,,4647,,4849.
고독한 꿀벌 속 Osmia (그림 1)에 속하는 몇 가지 중요 한 과일 및 견과 작물39,50,,5153, 의 효율적인 가루로 사용 되었습니다. 53. 다른 관리 pollinator 그룹24,54,,5556,,5758성인 Osmia 꿀벌은 정기적으로 44-꽃 작물 살포 하는 균에 노출. 최근 스프레이 작물에 식량 약탈을 배워 성인 여성 수집 하 고 재고 나중 발전 애벌레에 대 한 유일한 다이어트를 형성 하는 균 라덴 꽃가루와 그들의 브루 드 실 수 있습니다. 오염된 꽃가루 규정 사용 후 살 균 제 잔류물42애벌레를 노출할 수 있습니다. 노출의 위험 몇 가지 밀접 하 게 관련된 호스트 식물59,,6061에 사료 oligolectic 종 가운데 더 높은 수 있습니다. 예를 들어 특정 megachilid 꿀벌 우선적으로 기생62를 줄이는 수단으로 고품질 국화과 꽃가루에 대 한 마 초 나타납니다. 그러나,는 균 중 oligolectic 고독한 꿀벌 애벌레 피트 니스 영향 정도 하지 되었습니다 실험적으로 측정할. 이 연구의 목표 주요 테스트 프로토콜을 개발 하는 것 이며 생체 외에서 의 피트 니스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 소스의 대화형 효과 reared 고독한 꿀벌. 조사, O. ribifloris sensu lato (s.l.)의 계란 얻어질 수 있다 상업적으로 (자료 테이블). 이 인구는 네이티브 pollinator는 지역53,63,64 내 과즙이 풍부한 Mahonia aquifolium (오 레 곤 포도)에 대 한 그것의 강한 취향이로 그것의 중요성 때문에 이상적인 (그림 2).
그림 1입니다. 성인 Osmia ribifloris의 고해상도 사진. 사진 박사 짐 지팡이, 연구 곤충학자, 미국 농 무부-ARS 신용 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 중첩 중첩 여성 전경. 에 Osmia ribifloris (s.l.) 의 갈 대 Phragmite 챔버 파티션 및 갈 대에 대 한 터미널 플러그 masticated 잎에서 건설 한다. 사진 제공 씨 킴 볼 클락, NativeBees.com 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 연구의 첫 번째 목적은 애벌레 피트 니스 (개발 시간 및 prepupal 생물 측정)에 살 균 제 처리 꽃가루를 사용의 효과 평가 하는 것입니다. 일반적인 적용된 살 균 제 propiconazole에 노출은 여러 종 23,,2432,44,45, 전체 성인 꿀벌 중 사망률 증가에 연결 되었다 하는 동안 은 54,55,56,,5758,65,66,67, 애벌레 꿀벌에 미치는 영향 알려진. 이 연구의 두 번째 목적은 비 호스트 꽃가루 애벌레 체력에 소모의 효과 평가 하는 것입니다. 이전 연구 oligolectic 꿀벌의 애벌레 아닌 호스트 꽃가루68소비 하도록 개발 실패를 나타냅니다. 이러한 결과 변화 비 생리학69, 꽃가루 생화학70, 그리고 자연 꽃가루 규정71와 관련 된 유익한 미생물에 표시 될 수 있습니다. 이 연구의 세 번째 목적은 애벌레 체력에 균 치료와 식이 꽃가루의 대화형 효과 평가 하는 것입니다.
모성 신체 크기를 포함 하 여 수많은 생물 학적 특성, 속도, 프로비저닝 구하고 전략과 꽃가루 수량72,,7374,75 알려져 있습니다 고독한 꿀벌 중 애벌레 적합성에 영향을 미칠. 이러한 요소는 애벌레 건강을 평가할 때 방어할 수 있는 실험적인 디자인을 개발에 도전 포즈 갈 대 사이 뜻깊은 가변성을 발생할 수 있습니다. 또한, 애벌레의 개발 된 중첩 갈 대 내부에서 발생, 그 자손에 이러한 가변성의 효과 시각화 하기가 어렵습니다과 계량 없이 치명적이 지 않은 기법 (그림 3). 이 문제를 해결 하려면 모든 가설이이 연구에서 그들의 중첩 갈 대 외부 reared 애벌레를 사용 하 여 테스트 합니다. 실험 설계는 완전히 교차 2 × 2 계승 설정, 각 인자 2 수준; 구성 된 대표 요인 1: 살 균 제 노출 (살 균 제; 아니 살 균 제); 팩터 2: 꽃가루 소스 (호스트 꽃가루, 비-호스트 꽃가루). 꿀벌 계란에서 통제 된 실험실 조건에서 살 균 multiwell 세포 배양 배지 내에서 prepupal 단계를 발생 합니다. 각 잘는 개별적으로 각종 꽃가루 제공 및 단일 계란 표준화 된 양의 있습니다. 해칭, 후 유 충 우물 내에서 할당 된 꽃가루에 피드를 애벌레의 개발을 완료 고 pupation 시작. 과거의 연구 원인 불명된 사망은 야생49,76에서 발생 보다이 인공 양육 환경 내에서 발생 하는 꿀벌 가운데 낮은 나타났습니다. 생체 외에서의 사용-reared 꿀벌 필드 기반 연구를 통해 몇 가지 이점이 있다: 1) 그것은 자연적인 가변성 및 필드 기반 연구;와 일반적으로 관련 된 통제 요인의 혼동 영향을 최소화 2) 그것은 조작 각 factor(s)에 대 한 관심을 동시에 치료 그룹; 테스트의 여러 레벨을 허용 한다 3) 복제의 수를 미리 결정 된, 수 및 각 복제에 대 한 실험적인 요소를 개별적으로 조작할 수 있습니다. 4) 애벌레 응답 변수를 쉽게 시각화 하 고 방해 인접 한 애벌레; 없이 독립적으로 기록 된 수 있다 5) 프로토콜 여러 요인과 반응 변수 관련 된 더 복잡 한 실험 설계에 맞게 수정할 수 있습니다.
그림 3입니다. 자연 중첩 리드의 내용을 Osmia ribifloris (s.l.). (A) 개별 챔버, 꽃가루 규정 및 파티션, 및 (B)를 갓 보여주는 해 부 리드 수확 꽃가루 규정과 관련 된 계란 (검은 원 표시) 닫습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Protocol
1. 살 균 제 노출 실험을 위한 Propiconazole 솔루션 준비
- 실험의 하루 살 균 물에 상업적으로 구입한 propiconazole 14.3%의 적절 한 볼륨을 용 해 하 여 균 솔루션 x 0.1을 준비 합니다. 모든 치료에 대 한 유일한 갓된 균 솔루션 사용은 확인 합니다.
- 꿀벌 수집 꽃가루24 (0.361 PPM 또는 꽃가루의 활성 성분 g-1 의 µ g)에서 이전에 보고 된 propiconazole의 최대 농도를 꽃가루의 그램 당 균 솔루션 x 0.1의 23 µ L를 추가 합니다.
2. 계란과 호스트 Osmia 갈 대에서 꽃가루 규정을 수확
- 멸 균된 메스를 사용 하 여, 갓 갈 대 Osmia의 중첩, 개별 실 노출 리드의 길이 따라 두 부분으로 분할 연결 해 부.
참고: 각 둥지는 8 ~ 14 챔버와 챔버 내에서 단일 계란 사이 포함할 수 있습니다. - 이전에 게시 지침77에 따라 남성 계란을 포함 하는 실을 식별 하는 시각적으로 갈 대를 검사 합니다. 중첩 리드에서 관련된 달걀 함께 각 꽃가루 규정을 제거 하 고 깨끗 한 장소 소독된 구부러진된 바늘을 사용 하 여 보트 무게.
- 부드럽게 깨끗 한 벌금 페인트 브러시를 사용 하 여 제공에서 계란을 분리 하 고 꽃가루 조항의 신선한 무게 기록 표준 실험실 균형을 사용 하 여 계란. 남성 꽃가루 규정의 평균 중량을 계산 합니다.
- 초과 온도 탈수에 노출에서 계란에 손상의 기회를 줄이기 위해 최소 지연으로 다음 단계를 수행 합니다.
3. 준비 호스트 식물 꽃가루 규정
- 없는 기생충 현재78되도록 중첩 챔버에서 발굴 임산부 수집된 호스트-식물 꽃가루를 않았는지 살펴보십시오. 어떤 잠재적인 모성 편견을 줄이기 위해 멸 균 페 트리 접시에 단일 대량으로 꽃가루 규정을 결합 하 고 멸 균된 바늘을 사용 하 여 잘 혼합 합니다.
- 새로운 꽃가루 규정, 각 재구성의 무게는 자연스럽 게 할당 된 남성 규정의 평균 무게에 거의 같은 보장에 결합 된 질량을 분할 (의미 ± SE, 0.35 ± 0.01 g, N = 42).
참고: 때문에 Osmia sp. 작은 꽃가루 규정 남성 자손, 여성77에 비해 남성 애벌레의 낮은 몸 무게에이 결과에 할당 합니다. 어떤에 게 섹스의 차이점에서 발생 하는 이러한 바이어스를 방지 하려면 실험에서 남성 계란만 사용 합니다.
4. 비 호스트 식물 꽃가루 제공 준비
- 표준 실험실 볼 밀을 사용 하 여 정밀한 분말에 상업적으로 구입한 꿀 꿀벌 수집 꽃가루 격파
- 임산부 수집 호스트 꽃가루 규정 (~ 20%)의 함량에 따라 달라 집니다, 꽃가루 가루 반죽 같은 일관성을 형성 하기 위하여 철저 하 게 소독 40% 설탕 솔루션79 및 혼합의 적절 한 볼륨을 사용 하 여 하이드 레이트.
- 개별 꽃가루 질량으로 분할 자연스럽 게 할당 된 남성 규정의 평균 무게와 같은 무게 약 각.
참고: 규정 30 무작위로 선택 된 남성 챔버80에서 꽃가루 규정의 신선 하 고 건조 중량을 비교 하 여 사전에 표준화 될 수 있다 임산부 수집된 호스트 꽃가루 수 분 콘텐츠입니다. 건조 중량을 얻으려면, 꽃가루 규정 한 lyophilizer에서 동결 해야 (1.5 72 h에 대 한 펜 실바 니 아).
5. 준비 Multiwell 세포 배양 배지
- 압력가 주석 컵 (5 × 9 cm)와 살 균 48-잘 문화 판의 개별 웰 스 라인. 꽃가루 조항을 수용할 수 있도록 살 균 겸 부드럽게 캡슐의 위쪽 테두리 밖으로 감각을 사용 합니다.
- 호스트 또는 호스트 비 꽃가루의 단일 대량 치료 그룹에 따라 살 균 도구를 사용 하 여 주석 컵 안에 배치 합니다.
참고: 교차 오염을 피하기 위해, 치료 및 제어 그룹에 대 한 별도 접시를 사용 합니다.
6. Fungicides를 추가
- 메 마른 나무 막대기를 사용 하 여 꽃가루 질량 내의 중앙 배치 우울증을 확인 합니다. 새로운 막대기를 사용 하 여 각 꽃가루 조항에 대 한.
- 우울증에 (치료)에 대 한 살 균 제 솔루션 또는 살 균 물 (컨트롤)에 대 한 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 핀치는 살 균 제 사이의 표면 접촉을 최소화 하기 위해 살 균 집게를 사용 하 여 우울증의 열기 / 살 균 물과 계란.
- 실험적인 디자인의 계승 설정 그 일치 해야 도식 표현 (그림 4)에 묘사 된.
그림 4입니다. 실험적인 체제의 도식 대표. 실험을 완전히 넘어 2 × 2 계승 설정을 나타냅니다. 1 살 균 제 노출 나타냅니다 비율과 2 레벨의 구성: (i) 균 (N = 10), 그리고 (ii) 균 (N = 10). 2 꽃가루 소스 나타냅니다 비율과 2 레벨의 구성: (i) 호스트 꽃가루 (N = 8), 그리고 (ii) 비-호스트 꽃가루 (N = 8). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
7. 후방 고 애벌레 관찰
- 장소 깨끗 한 벌금 페인트 브러시를 사용 하 여 꽃가루 규정의 위쪽 표면에 임의로 선택 된 남성 계란. 일단 계란 모든 규정에 배치 되었습니다, 그리고 라벨 모서리에 테이프와 보호 셀 문화 접시의 뚜껑을 대체.
- 깨끗 한 쟁반에 잘 접시를 놓고 직접 빛과의 접촉을 방해 어두운 천으로 커버. 장소 6 잘 플레이트의 건조를 방지 하기 위해 트레이 내의 살 균 물 포함 30 mL. 실 온에서 부 화 쟁반 인큐베이터 안에 그대로 둡니다.
- 잘 접시의 뚜껑을 제거 하지 않고 해 현미경 매일 잘 접시를 관찰 합니다. 애벌레는 살아 움직임을 확인 하 여 확인 합니다. 아무 움직임을 감지할 경우 죽은 애벌레와 나머지 꽃가루 규정을 포함 하는 주석 컵 폐기. 모든 살아남은 애벌레 prepupal 단계를 도달할 때까지 그대로 잘 플레이트 내에서 개발 하는 것을 허용 한다.
- Prepupal 단계41에 도달 하면 주석 컵에서 유 충을 제거 합니다. 어떤 청소 브러쉬를 사용 하 여 실크 누에고치에서 똥. 신중 하 게 해 현미경을 사용 하 여 실크 누에고치를 극복 하 고 고무 집게와는 prepupa를 추출 합니다.
- Prepupa 도구 소프트 바디 피어스 하지 할 수 있도록 부드럽게 처리 합니다. Prepupa (prepupal 바이오 매스)의 prepupal 단계 (애벌레 발달 시간)에 계란에서 개발 시간 신선한 무게를 기록 합니다.
참고: 모든 죽은 유 충 시신에 남은 꽃가루 조항 원치 않는 미생물 성장을 방지 하기 위해 즉시 삭제 됩니다 해야 합니다. 이 나머지 건강 한 애벌레를 감염의 위험을 줄여줍니다.
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Representative Results
애벌레 피트 니스 3 통계 (i) 애벌레 발달 시간, (ii) prepupal 바이오 매스, 그리고 (iii) %survivorship 사용 하 여 정량 했다. 양방향 ANOVA 균 노출을 사용 하 여 실시 되었다 (2 레벨: 아니 살 균 제, 살 균 제) 및 꽃가루 소스 (2 레벨: 호스트 꽃가루, 비-호스트 꽃가루) 독립 변수와 종속 변수 애벌레 발달 시간으로. 살 균 제 노출에 대 한 주요 효과 (F1,28 = 1.24, P = 0.28)는 살 균 처리 (평균 ± SE) 사이 중요 한 비 (28.14 ±1.98 d, N = 14), 및 치료 (25.39 ± 1.65 d, N = 18) 그룹. 그러나 꽃가루 소스에 대 한 주요 효과, 애벌레 호스트 꽃가루에 대 한 개발 시간 사이 상당한 차이가 표시 (20.00 ± 0.50 d, N = 16) 및 비-호스트 꽃가루 (33.19 ±0.81 d, N = 16) (F1,28 179.83, = P < 0.001). 수정된 포스트 hoc 비교 표시 애벌레 발달 시간 사이 크게 변화 하지 않았다 Bonferroni 균 취급 하 고 호스트에서 발생 하는 그룹 치료 (P = 0.57) 및 비-호스트 (P = 0.32) 꽃가루. 그러나, 애벌레 발달 시간은 크게 균 처리 둘 다를 위해 비 호스트 꽃가루에 비해 호스트 꽃가루에 애벌레에 대 한 짧은 (P < 0.001) 및 치료 (P 0.001 <) 꽃가루. 상호 작용 효과 (살 균 제 노출 × 꽃가루 소스)는 중요 한 (F1,28 0.09, P = 0.77 =). 분석은 종속 변수와 prepupal 바이오 매스를 사용 하 여 반복 했다. 살 균 제 노출에 대 한 주요 효과 상당한 차이 표시 (F1,28 = 4.66, P = 0.04) 균 치료 사이 (0.123 ± 0.01 g, N = 14), 및 치료 (0.149 ± 0.01 g, N = 18) 그룹. 꽃가루 소스에 대 한 주요 효과 (F1,28 56.30, P = 0.001 <) 호스트 꽃가루에 애벌레 상당한 차이 표시 (0.170 ± 0.01 g, N = 16) 및 비-호스트 꽃가루 (0.105 0.01 g, N = 16) . 수정된 포스트 hoc 비교 표시는 prepupal 바이오 매스 사이 크게 달라 지지 않았다 Bonferroni 균 취급 하 고 호스트에서 발생 하는 그룹 치료 (P = 0.22) 및 비-호스트 (P = 0.08) 꽃가루. 그러나, 애벌레 모두 균 치료 비 호스트 꽃가루에 비해 호스트 꽃가루에 제기 중 prepupal 바이오 매스 크게 높았다 (P < 0.001) 및 치료 (P 0.001 <) 꽃가루. 상호 작용 효과 (살 균 제 노출 × 꽃가루 소스)는 중요 한 (F1,28 0.132, P = = 0.72). 그림 5 와 그림 6 은 상기 분석에서 얻은 결과의 그래픽 표현입니다. 독립 샘플 t-테스트 표시 애벌레 survivorship에 꽃가루 근원의 중요 한 효과 (N = 18, t9 =-2.45, P =0.04).
그림 5입니다. 애벌레 발달 시간과 prepupal 바이오 매스를 기반으로 애벌레 피트 니스에 대 한 통계를 보여주는 막대 그래프. 애벌레 피트 니스 통계 (A) 와 (B) 꽃가루 소스;에 따라 클러스터 그리고 (C) 와 (D) 살 균 제 노출. (평균 ± 1 SE). P < 0.001 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6입니다. 상호 작용 애벌레 피트 니스 통계에 대 한 줄거리입니다. (A) 애벌레 발달, 그리고 (B) prepupal 바이오 매스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 소스의 대화형 효과. (평균 ± 1 SE). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Pearsons 상관 관계 애벌레 발달 시간과 prepupal 바이오 매스 (그림 7) 사이의 관계를 탐구 하 사용 되었다. 중요 한 부정적인 상관 관계 모든 치료 그룹에 걸쳐 지적 했다 (r =-0.83, P < 0.001, N = 32), 그리고 균 치료에 걸쳐 (아무 균: r =-0.76, P < 0.001, N = 18; 살 균 제: r =-0.92, P < 0.001, N = 14). 동안 비 호스트 꽃가루에 애벌레에 대 한 중요 한 부정적인 상관 관계 (r =-0.64, P < 0.01, N = 16), 이러한 관계는 애벌레 호스트-꽃가루에 대 한 관찰 되었다 (r -0.01, P = = 0.98, N = 16).
그림 7입니다. 애벌레 발달 시간 및 prepupal 생물 사이의 관계. 피어슨 상관 관계 개발 시간 및 (A) 에 걸쳐 prepupal 생물 사이의 모든 치료 그룹 (P < 0.001) (B) 꽃가루 소스 (꽃가루를 호스트: P = 0.98, 비-호스트 꽃가루: P < 0.01); (C) 살 균 제 노출 (아무 균: P < 0.001, 살 균 제: P < 0.001). 패널 (B) 와 (C), 추세선 그림 범례에 기호 색상 일치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
애니메이션 그림 1. 다섯 번째 무대 애벌레 탈피 O. ribifloris 의 단일 multiwell 격판덮개의 우물에서. 유 충은 pupation 준비에서 명주 고치 회전 시작 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
그들의 자연적인 중첩 갈 대, 실험실 조건 하에서 외부 꿀벌을 양육 애벌레 피트 니스에 관한 여러 가설의 테스트 수 있습니다. 수 정체 불명된 요인 계속 비 사망 원인, 위험 평가 연구 생체 외에서 사용 하 여 실험 수 잠재적인 위협을 식별 하 고 야생 가루 12의이 종 부유한 그룹에 대 한 관리 사례를 알려 ,38,49,76,,8182.
일반적으로 짧은 개발 시간 및 높은 prepupal 바이오 매스 높은 애벌레 피트 니스와 연결 됩니다. 모든 치료에서 애벌레의 개발의 기간 부정적인 prepupal 바이오 매스와 상관 했다. 그러나, 4 개의 그룹 애벌레의 개발 기간 및 prepupal 생물 사이 큰 차이가 있었다. 어떤 균에는 영향을 받지 않은 호스트 꽃가루를 소비 하는 것이 허용 되었다 애벌레 애벌레 발달 조업 단축, 그리고 가장 높은 prepupal 바이오 매스를 했다. 반면, 균 치료 비 호스트 꽃가루, 소비 그 애벌레 긴 했다 완전 한 애벌레의 개발, 그리고 낮은 prepupal 바이오 매스를 했다. 그러나, 애벌레 survivorship 동향 호스트 꽃가루에 발생 하는 균 치료 그룹에 대해서만 언급 되 고 사망률과 보다 적게 명확 했다. 밝혀 deconstructing 균 노출 및 꽃가루 소스의 메인 및 상호 작용 효과: (i) 살 균 처리 꽃가루를 사용의 주요 효과 prepupal 바이오 매스 뿐만 아니라 애벌레 발달 기간에 상당한 부정적인 영향을 미쳤다. 이전 연구는 성인 Osmia , 높은 농도에서 급성 경구 독성 설명 했다 하는 동안 이러한 결과 훨씬 낮은 농도에서 propiconazole에 경구 노출 영향을 미칠 수 피트 니스 prepupal 바이오 매스23 줄임으로써 제안 . (ii) 소모 비 호스트 꽃가루의 주요 효과 애벌레 체력에 불리 한 효과가 있다. 이러한 결과 꽃가루 품질 (즉, 독 소, 보호 화합물, 필수 영양소의 부족의 존재), 제안 이전에 게시 연구와 일치 하 고 꿀벌 생리학에 차이가 아닌 호스트 꽃가루68 활용에서 꿀벌을 제한할 수 있습니다. . 그것은 또한 일반적으로 호스트 화분 및 꿀벌 작물에서 얻은 유익한 microbiota의 부재가이 효과 악화 수 있습니다 가능성이입니다. (3) 살 균 제 노출 및 애벌레 체력에 꽃가루 소스 사이 아무 중요 한 상호 작용이 했다. 균 치료 및 치료 그룹, 비 호스트 꽃가루를 소모 하는 애벌레 상당히 낮은 prepupal 바이오 매스와 애벌레 호스트 꽃가루에 비해 더 이상 애벌레 발달 시간 했다. 꽃가루 소스에 살 균 제 처리 규정을 소모 하는 애벌레 애벌레 치료 꽃가루에 제기에 비해 상당히 낮은 prepupal 바이오 매스를 했다. 중요 한 주요 효과 이외에도 두 요인의 대화형 효과 왔고 가산적 모델 즉, 애벌레 피트 니스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 종류의 부정적 시너지 하지. (자세한 여기에)로 꿀벌 건강의 다양 한 결정 요인의 상호 작용에서 발생 하는 불확실성 pollinator 관리 전략의 효과 제한 합니다. 여러 위험 요인의 대화형 효과 예측 함으로써, 비슷한 실험실 기반 실험 결과 비 절약 노력에이 오랜 과제를 회피 도울 수 있다.
실험의 결과 영향을 미칠 수 있습니다이 프로토콜 내에서 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 가능 하다 면, 그것은 농약 잔류물의 무료 유기 꽃가루를 사용 하는 것이 좋습니다. 알 수 없는 소스에서 꽃가루를 사용 하 여 실험 결과 혼동 수 있습니다 다양 한 농약으로 오염 위험을 증가 합니다. 그것은 갓 연결된 Osmia 깐된 계란 또는 아주 젊은 애벌레는 연구에 사용 되는 갈 대를 중첩을 얻을 해야 합니다. 이렇게 하면 애벌레 의도 꽃가루 치료 종류에 거의 전적으로 올려진다. 중첩 리드 해야 수 해 부는 실패 하는 얕은 절 개를 사용 하 여 꽃가루 규정 하 고 계란 수확 하는 동안 손상 될 수 있습니다. 계란 제거 되었습니다 일단 그들은 손상을 방지 하기 위해 부드럽게 처리이 고 그들은 전송까지 멋진 어두운 위생 환경 (예를 들어, biosafety 내각)에서 무게 보트 유지 있습니다. 이 처리 시간 최소한 (< 30 분) 계란의 품질 손상 되지 보장 하기 위해 유지 되어야 한다. 모든 절차는 biosafety 깨끗 한 되도록 캐비닛에서 수행 되어야 합니다 작업 환경 및 오염의 가능성을 감소. 그들의 효 험, 갓 사용만을 치료에 대 한 살 균 제 솔루션을 준비. 꽃가루는 소수 성, 살 균 제 솔루션 / 살 균 물 꽃가루 규정 내에서 우울증으로 소개 한다. 이 제공을 통해 침투 하는 액체의 볼륨을 극대화 합니다. 그러나, 그것은 중요 하다 우울증 조항의 전체 깊이 관통 하지 않습니다 그것 캡슐 바닥에 준수 하는 솔루션에서 볼륨의 손실 귀 착될 것입니다. 개별 치료 및 컨트롤 휘발성 화합물 또는 꽃가루 부담 microbiota 교차 오염의 가능성을 줄이기 위해 별도 잘 접시에 실시 한다. 접힌된 테이프의 조각 일단 뚜껑 장소에 충분 한 공기 갭 수 있도록 접시의 가장자리에 첨부 되어야 한다. 매일 관찰 하는 동안 판 애벌레에 방해를 최소화 하기 위해 부드럽게 처리 되어야 합니다. 관찰 하 여야 한다 현미경 최소 빛 강도 및 뚜껑 분리 해서는 안 하지 않으면 죽은 애벌레를 삭제할. 예기치 않은 광범위 한 사망률의 경우 애벌레와 그들의 꽃가루 규정 해야 합니다 시각적으로 검열 되어야 감염 및 감염의 흔적을 확인 하. 손상 된 복제를 포함 하는 잘 플레이트 즉시 작업 공간 소독, 폐기, 및 감염의 확산을 방지 하기 위해 도구 소독 해야 합니다.
그것의 광범위 한 배열 응용 프로그램에도 불구 하 고이 방법에 특정 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 그것은 유기 꽃가루 때마다 사용할 수를 사용 하 여 좋습니다, 물류 금지은 충분 한 양의 순수한 uncontaminated 꽃가루를 온실 설정 내에서 식물을 제기. 이러한 경우, 야생 수집 꽃가루 사용할 수 있습니다, 농약 잔류물의 존재에 대 한 검사는 하. 야생 수집 꽃가루를 사용 하 여 오염의 위험을 줄이기 위해 또 다른 전략 스프레이 (예를 들어, 원시 그대로 지역 농업 농장에서 멀리 위치한) 되었을 가능성이 소스에서 꽃가루를 얻을 것입니다. 이 연구에 사용 된 호스트 꽃가루는 자연 숲과 초원 Wasatch 범위 Kaysville, 유타 근처의 산기슭 주변에 배치 했다 중첩 갈 대에서 얻은 했다. 이 지역의 모든 상업 농업 지역, 멀리 야생, 관리 되지 않는 자연 숲에 의해 지배 되 고 이러한 꿀벌 비행 하지까지 꿀벌83,,8485를 구하고 하는 때, 그것은 매우 가능성이 주어진 그들은 수집 꽃가루 살포 된 것 이다 그. 따라서, 여기에 수집 된 꽃가루 내에서 살충제 잔류물 사소한 될 가능성이 있습니다. 이러한 야생 풍경에서 구하고, 성인 여성 덜 것입니다 오염된 꽃가루 발생 애벌레 중 노출의 위험을 감소. 이 연구에 사용 된 상업적으로 구입한 꿀벌 꽃가루 자연 숲된 지역 북부 위스콘신 및 미시간에서에서 수집 됩니다. 인간의 소비에 대 한 판매, 공개 정보 및 공급 업체와 개인 통신 나타냅니다 두 드러 기는 화학적으로 처리 되지 않습니다, 꽃가루86어떤 수정 없이 자연, 원시 형태로 판매 된다. 따라서, 그것은 상업적으로 구입한 꿀벌 꽃가루에서 오염 부하 최소화 될 것 이라고 가정 하는 합리적입니다. 야생 자연 식물 관리 되지 않는 분야에서 꽃가루를 얻을 하지 않는 연구, 그것은 꽃가루 꽃가루 위험 분석에 사용 된 무료 오염 물질을 화학 분석에서 직접 경험적 증거를가지고 하는 것이 좋습니다. 또 다른 한계 인공 양육 환경에 의해 소개 하는 계략을 포함 한다. 최선의 노력에도 불구 하 고 그것은 물류 자연 중첩 리드 내 정확한 microenvironment 복제 가능 (예., 수 분, 산소 농도, 개별 챔버의 3 차원 구조)는 애벌레 영향을 줄 수 알 수 없는도 휘트니스입니다. Defensibly는 자연적인 규정식의 특성 시뮬레이션, 예비 데이터를 중첩 하는 갈 대에서 다이어트 조작 연구 생체 외에서 이전 가져와야 합니다. 이 연구에 사용 된 비 호스트 꽃가루 오 레 곤 포도 결 석 또는 드문87지역에서 얻은 것입니다, 비록 상업적으로 구입한 화분, 잠재적으로 결과 영향을 미치는 내 혼합 호스트 꽃가루의 흔적이 있을 수 있습니다. 이 기술의 또 다른 단점은 실험 기간 동안 스트레스를 처리 꿀벌에 부작용을 일으킬 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 일반적인 자연63에 깐된 계란을 발생, 실험실 조건 하에서 어렵다 해치 실패 때문에 스트레스, 실험적인 치료, 또는 자연적인 원인의 결과 처리 했는지 확인. 이후 이러한 요인 연구에 바이어스의 알 수 없는 발생할 수 있습니다, 하나는 얻은 결과 해석 하는 동안 주의 사용 해야 합니다.
실험 결과 (예: 모성 채집 효율75, 섹스 관련 유사77, 그리고 식이 꽃가루68,72), 바이어스 잊 혀 수 있습니다 요소에 대 한 설명된 프로토콜을 제어 하 여 제공 상당한 개선 이상 이전 출판 기술76, 그리고 가설 테스트에 대 한 더 엄격한 프레임 워크를 제공 합니다. 예를 들어, 사용 하 여 생체 외에서-reared 꿀벌 수 구멍 중첩 꿀벌49,88의 야생 인구 가운데 공부 하 그렇지 않으면 어려울 것 xenobiotic 치료 섹스 특정 응답에 대 한 조사. 조작 하 고 테스트 (예:다이어트 품질 및 수량, 다이어트 관련 microbiota, 시너지 농약에 노출), 여러 개의 상호 작용 요인에 대 한 잠재적인 비 적합성의 주요 결정 요인에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 프로토콜의 유연성은 쉽게 수정 허용 (예: 사용 하 여 다른 크기의 다양 한 크기, 종류와 다이어트의 금액 변경의 애벌레에 맞게 잘 접시), 고독한 꿀벌과 말 벌의 다른 여러 종으로 사용 하기 위해 의무가 만들기 76.이 연구 평가 피트 니스 수 유 단계에서 개발 및 survivorship을 기반, 동안 곤충 출현 속도, 음식-바디 변환 및 포스트 출현 장 수 에 추가 데이터를 얻기 위해 출현까지 incubated 수 49.이 정보는 사용자에 게 도움이 될 하위 치명적인 독성 분석 실험에서 치료 효과 평가할 수 있습니다. 꽃가루-미생물의 기능에 대 한 관심 증가, 실험실 기반 연구 그들의 꽃가루 microbiota71에 따라 저항 비 종 대 민감한 확인할 수 있습니다. 벌 그룹 간에 균 민감도에 차이가 꽃가루 하이브 저장 내 microbiota 시퀀싱 탐험 수 있습니다. 이 부여 xenobiotic 스트레스에 저항의 다양 한 각도에서 꽃가루 미생물의 역할을 확인할 수 있습니다. 미래 연구 또한 기본 요소 선택 비 종 내 oligolectic 행동을 운전 될 수 있습니다 호스트 및 비 호스트 꽃가루의 자연 microbiota 사이의 차이점을 식별 도움이 됩니다.
생체 외에서 양육 애벌레 고독한 꿀벌의 자연 변화에 비 적합성에 영향을 미치는 개인 및 상호 작용 요인의 역할을 묘사 함으로써 야생에서 경험에 대 한 제어를 도울 수 있다. 이 접근 가능 하 고 저렴 한 기술 주소 특정 연구 목표를 쉽게 수정할 수 있는 여러 매개 변수를 조작 함으로써 entomologists' 도구 키트를 확장 합니다. 생체 외에서 실험에서 증거 위험 인구를 식별할 수 있습니다, 비 보존 전략에 미치는 영향 상당한 있을 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 감사 실험실 박사 카 메 론 커리, 크리스텔 Guédot, 테리 Griswold, 마이클 Branstetter,에 대 한 3 명의 익명 검토자에 몰리 Bidwell, 디스 네 스 빗 및 Osmia 중첩 갈 대를 제공 하기 위한 팀 Krogh, Kimball 클락 원고를 개선 하는 그들의 유용한 의견. 이 작품은 미국 농 무부 농업 연구 서비스 충당 자금 (현재 연구 정보 시스템 #3655-21220-001), 위스콘신 농업의, 무역 및 소비자 보호 (#197199), 국립 과학 재단 (에 의해 지원 되었다 부여 번호 DEB-1442148), 미상 그레이트 호수 Bioenergy 연구 센터 (과학 BER 드-FC02-07ER64494의 암컷 사무실).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) | Kaysville, Davis County, Utah, USA | ||
| Osmia reeds | Nativebees.com | NA | Freshly plugged reeds |
| Dissection set | VWR | 89259-964 | Sterilize before use |
| Long Nose Pliers | Husky | 1006 | |
| 6 well culture plates | VWR | 10062-892 | Sterile sealed |
| 48 well culture plates | VWR | 10062-898 | Sterile sealed |
| Petri dishes | VWR | 25373100 | Sterile sealed |
| Square Weighing Boats | VWR | 10770-448 | |
| Camel Hair Brush | Bioquip | 1153A | |
| Tin capsules | EA Consumables | D1021 | Sterilize before use |
| Sucrose | VWR | 470302-808 | |
| Propiconazole 14.3 | Quali-Ppro | 60207-90-1 | Propiconazole 14.3% |
| Honey bee pollen | Bee energised | 897098001244 | Untreated, natural, raw pollen |
| Microbalance | VWR | 10204-990 | |
| Pulverisette | LAB SYNERGY INC. | 30334913 | |
| Wooden sticks | VWR | 470146908 | Sterilize before use |
| Sealing tape | VWR | 89097-912 | |
| Microscope | VWR | 89403-384 | |
| Planting tray | VWR | 470150-632 | |
| Ethanol | VWR | BDH1158-4LP | |
| Centrifuge tube | VWR | 21008936 | |
| Microsyringe | Cole-Palmer | UX-07940-07 | |
| Rubber tweezer | Amazon | B0135HWPN4 | |
| Syringe needles | VWR | 89219-334 | |
| Freeze drier | Labcono | LFZ-1L | |
| Statistical software | SPSS | Version 21.0 |
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