Summary
Mitokondrier har spesialisert ribosomer som skilt fra sine bakteriell og cytoplasmatiske kolleger. Her viser vi hvordan mitoribosomes kan fås fra deres eget rom i HEK celler. Metoden innebærer isolering av mitokondrier fra suspensjon celler og påfølgende rensing av mitoribosomes.
Abstract
Menneskelige mitokondrier har et eget sett med ribosomer (mitoribosomes) som oversetter 13 viktige protein komponenter av oxidative fosforylering komplekser kodet av mitokondrie genomet. Siden alle proteiner syntetisert av menneskelig mitoribosomes er integrert membran proteiner, er menneskelige mitoribosomes bundet til mitokondrie interne membran under oversetting. Sammenlignet med det cytosolic ribosomet har mitoribosome en sedimentering koeffisient 55S, halv rRNA innholdet, ingen 5S rRNA og 36 ekstra proteiner. Derfor gjør høyere protein til RNA innsats og en atypisk struktur den menneskelige mitoribosome vesentlig forskjellig fra motparten cytosolic.
Til tross for den sentrale betydningen av mitoribosome liv var ingen protokoller tilgjengelig til å rense intakt komplekset fra humane cellelinjer. Tradisjonelt mitoribosomes ble isolert fra mitokondrier-rik dyr vev som krevde kilo starter materiale. Vi tenkte at mitokondrier i dele HEK293-avledet menneskelige celler dyrket i næringsrike uttrykk medium ville ha en aktiv mitokondrie oversettelse, og derfor kan være en passende kilde av materiale for strukturelle og biokjemiske studiene i mitoribosome. For å undersøke strukturen, utviklet vi en protokoll for store rensing av intakt mitoribosomes fra HEK celler. Her introduserer vi nitrogen kavitasjon metoden idet en raskere, mindre arbeidskrevende og mer effektiv alternativ å tradisjonell mekanisk skjær-baserte metoder for cellen lysis. Dette resulterte i forberedelsene til mitoribosome som er tillatt for dens strukturelle beslutning om å høy oppløsning, avslørende sammensetningen av den intakt menneskelig mitoribosome og dens montering mellomprodukter. Her vi følge opp dette arbeidet og presentere en optimalisert og kostnadseffektiv metode krever bare ~ 1010 kultivert HEK celler. Metoden kan brukes til å rense menneskelige mitoribosomal oversette komplekser, mutanter, kvalitetskontroll samlinger og mitoribosomal underenheter intermediater. Rensingen kan lineært besteget tidoblet hvis nødvendig, og brukes også til andre typer celler.
Introduction
Prosessen med mitokondrie proteinsyntese er basert på 13 viktige mt-mRNAs som er oversatt av en spesialisert membran-vedlagt mitoribosome til katalytisk kjernen av respiratoriske kjeden. Endret mitokondrie genomer og behovet for proteiner sette inn co-translationally i membranen har vesentlig formet arkitekturen av mitokondrie ribosomer1. Siste høyoppløselig strukturer av pattedyr mitoribosome viste en påfallende annerledes helhetsinntrykket bakteriell motpart2,3. Spesielt legges minst 36 mitokondrier-spesifikke proteiner, bidrar ~ 1 MDa ekstra molekylær masse, mens mt-rRNA er redusert med todelt og svært skilt. De strukturelle rearrangements endre nesten alle viktige funksjonelle egenskaper som tidligere var generelt akseptert å være universelt bevart4.
Nye hovedelementene har blitt kjøpt av hver enkelt av mitoribosomal underenheter, for eksempel små delenhet har innlemmet en iboende GTPase protein mS29 i "hodet" regionen. GTPase aktivitet har ikke blitt funnet i andre oversettelse systemer, og strukturen indikerer at GTPase kan ha en rolle i delenhet samlingen2. Den 5S rRNA som ble antatt å være et landemerke for alle kjente ribosomal store underenheter, danner kjernen i det sentrale protuberance, mangler i pattedyr mitoribosome og har vedtatt mt-tRNA-Val som en integrert byggekloss i stedet2. Forbud og kolleger viste at svin mitoribosome har mt-tRNA-Phe og ikke-Val5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk og kolleger fulgte om disse dataene og fant at mitoribosomes fra pasienter med nedsatt mt-tRNA-Val stabilitet i prinsippet rommer mt-tRNA-Phe6,7. Hvorfor mitoribosomes har tatt disse bestemte elementer og hva veier og trans-faktorer er nødvendig for disse unike samlinger er fortsatt ukjent.
Samlet innebærer høy kompleksiteten i den menneskelige mitoribosome, nye protein komponenter og unike foreningen av mt-tRNA som en strukturell element involvering av som-men-ukjent mitokondrier-spesifikke trans -faktorer. Men fordi mange av funksjonene i dette systemet er unikt for mitochondria, som tradisjonelt har vært vanskelig å8, er lite kjent om den molekylære og kvalitetskontroll mekanismen. Med utviklingen av høyoppløselige enkelt partikkel analyse av elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM)20oppstår muligheter nå å omfattende studere molekylære mekanismer underliggende montering, handlingen og kvalitetskontroll av menneskelige mitoribosome. Vår rapport av første menneskelige mitoribosome samlingen mellomliggende gir anerkjennelse at det er mulig å visualisere hvordan den menneskelige mitoribosome er dannet og viser at cryo-EM er medvirkende i identifisering av nye trans- fungerende montering faktorer9.
For å utvide denne innledende innsats, beskriver vi en rask protokoll for menneskelig mitoribosome rensing i detalj. En storskala isolering av svært ren intakt mitokondrier fra suspensjon celler er beskrevet i den første delen av protokollen. Denne fremgangsmåten kan krever 9 h og lett endres og tilpasses ulike celletyper og vekter. Et viktig skritt i denne protokollen er bruken av nitrogen kavitasjon bryte åpne cellene. Den andre delen av protokollen ble utviklet for å rense mitoribosomes. Denne fremgangsmåten krever 7T og gir en tilstrekkelig mengde mitoribosomes for biokjemisk og strukturelle studier. Bruk av ren mitokondrier som en utgangsmaterialet tilbyr høy kvalitet endelig preparater og kan ekstrapolert andre mitokondrie makromolekyler.
Protocol
Alle pattedyr celle kultur arbeid må utføres innenfor en biologiske sikkerhetskabinett kabinett. Bruk sterilt utstyr hvis kontakt med celler. Nitrilhansker og en labfrakk og følg god vev kultur praksis.
1. celle kultur
- Opprettholde HEK293S suspensjon celler i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 10% tetracycline-fri fosterets bovin serum (FBS), 5 μg/mL blasticidin og 200 μg/mL Azithromycin, 37 ° C og 5% CO2.
- Skaler opptil 9 x T175 flasker. På 90% confluency, høste celler og spinne dem ned på 500 x g for 5 min. Resuspend pelleted cellene i Freestyl med 5% tetracycline-fri FBS. Telle celler ved hjelp av en automatisert celle teller og justere celle konsentrasjonen til 1,5 x 106 celler/mL i en ventilerte risting kolbe.
Merk: Dette vil vanligvis tilsvarer en start volumet av 300 mL i en 1000 mL ventilerte kolbe. - Inkuber celler i en risting inkubator på 37 ° C og 5% CO2 på 120 rpm (50 mm risting diameter).
- Etter 2 dager telle celler og fortsette å dele cellene hvis cellen tetthet er over 3.0 x 106 celler/mL. Dele cellene ved å spinne ned 2 x 150 mL cellekultur i 2 x 250 mL konisk flasker på 500 g for 5 min. Resuspend celler i 2 x 10 mL frisk media og overføre til en 2 x 1, 000 mL ventilerte flasker som inneholder riktige volumet for en siste celle tetthet av 1,5 x 106 celle/mL, f.eks 2 x 300 mL fra en celle tetthet på 3,0 x 106 celler/mL.
- Inkuber celler i en risting inkubator på 37 ° C og 5% CO2 på 120 rpm (50 mm risting diameter).
- Etter to dager telle celler og fortsette å dele cellene hvis cellen tetthet er over 3.0 x 106 celler/mL. Dele cellene av snurrende 4 x 150 mL celle kultur i 4 x 250 mL konisk flasker på 500 g for 5 min. Resuspend celler i 2 x 10 mL frisk media og overføre til 2 x 2000 mL ventilerte kolbe som inneholder riktige volumet for en siste celle tetthet av 1,5 x 106 celle/mL, for eksempel 2 x 700 mL fra en start celle tetthet på 3,0 x 106 celler/mL.
- Inkuber celler i en risting inkubator på 37 ° C og 5% CO2 på 120 rpm (50 mm risting diameter).
- Etter to dager telle celler og fortsette å dele cellene hvis cellen tetthet er over 3.0 x 106 celler/mL. Dele cellene ved å helle det 2 x 700 mL luftet cellekultur i 2 x 2800 mL kolber og samtidig med 2 x 300 mL frisk media å nå et volum på 2 x 1 L.
- Inkuber celler i en risting inkubator på 37° C og 5% CO2 på 120 rpm (50 mm risting diameter).
- Etter 24 h telle celler og høste celler hvis cellen tetthet er mellom 3.0-4.0 x 106 celler/mL.
2. mitokondrier isolasjon
- Buffere kreves
Merk: Antallet er angitt for en forberedelse fra 2 L celler. Klargjør følgende lager løsninger før tiden for mitokondrie isolasjon buffer (MIB), sukrose/mannitol buffer (SM4), eksperimentelle buffer (MIBSM), rørets buffer (SEM).- Lag 0,5 L MIB buffer: 50mM HEPES-KOH, pH 7.5 10 mM KCl, 1, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, proteasehemmere.
- Gjøre 100 mL SM4 buffer: 280 mM sukrose, 840 mM mannitol, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 m M DTT, proteasehemmere.
- Lag 160 mL MIBSM buffer: 120 mL MIB buffer + 40 mL SM4 buffer.
- Lagre 200 mL PBS på 4 ° C.
- Gjøre 5 mL SEM buffer: 250 mM sukrose, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA.
- Gjør 4 x 10 mL lager løsninger for gradvis sukrose graderingen som inneholder 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA og 60% / 32% /23% og 15% sukrose, henholdsvis.
- Mitokondrier isolasjon
Merk: Det er viktig å arbeide raskt og holde alt på isen i hele denne prosedyren. - Nedkjøling av nitrogen kavitasjon kammeret før bruk.
- Høste 2 x 1 L celler (3-4 x 109 celler per sentrifuge tube) med sentrifugering 1000 x g i 7 min, 4 ° C.
- Dekanter nedbryting nøye og resuspend pelleted cellene raskt i 2 x 100 mL PBS. Basseng cellene.
- Sentrifuge resuspended cellene på 1200 x g for 10 min, 4 ° C.
- Dekanter nedbryting nøye og veie pellet (~ 20 g).
- Resuspend pellet 120 mL MIB buffer.
- Lar celler å svulme av forsiktig røre i et kaldt rom for 10 min.
- Plasser nitrogen kavitasjon kammeret på isen og overføre de swelled cellene til nitrogen kavitasjon kammeret. Legge til 45 mL SM4 buffer (1/3 av det siste bindet av resuspended celler, ca 140 mL, gir en siste konsentrasjon av 70 mM sukrose og 210 mM mannitol).
- Fest nitrogen kavitasjon kammer og fyll med nitrogen før trykket når 500 psi. Lukk kraner og holde isolert på is 20 min.
- Langsomt slippe ut trykket i nitrogen kavitasjon kammeret og samle de lysate (cirka 185 mL).
- Sentrifuge lysed materialet for å fjerne celle rusk og kjerner 800 x g i 15 min, 4 ° C.
- Samle nedbryting av helle den gjennom cheesecloth i et beaker holdt på is. Ikke kast pellet.
- Resuspend pellet 90 mL MIBSM buffer (1/2 forrige volumet). Homogenize med Teflon/glass Dounce homogenizer og gjenta sentrifugering 800 x g i 15 min, 4 ° C.
- Samle nedbryting av helle den gjennom cheesecloth i et beaker holdt på is. Kombiner denne nedbryting med nedbryting fra trinn 2.2.11.
- Sentrifuge de kombinerte supernatants 1000 x g i 15 min, 4 ° C.
- Samle nedbryting av helle den gjennom cheesecloth i et beaker holdt på is.
- Forkaste pellet og sentrifuge nedbryting som inneholder olje mitokondrier 10.000 x g i 15 min, 4 ° C.
Merk: Pellet vil vanligvis består av to deler: løs og stram. - Forsiktig vaske ut den løs pellet uten å forstyrre den stramme delen. Resuspend stramt pellet 10 mL MIBSM buffer.
- Utføre en protein konsentrasjon analysen ved hjelp av en kommersiell Protein analysen Kit eller lignende metode. Typisk konsentrasjon gir fra 2 L starter kultur er ~ 2 mg/mL.
- Legge til 200 enheter av RNase gratis DNase og la rotere på rull i kalde rommet for 20 min å jevnt blande DNase fjerning av genomisk DNA.
- Sentrifuge 10.000 x g i 15 min, 4 ° C og resuspend pellet 2 mL SEM buffer. Homogenize forsiktig med en liten Teflon/glass Dounce homogenizer for å resuspend eventuelle gjenværende aggregat. Utfør ikke mer enn fem opp går for å unngå brudd. Hold på is.
- Klargjør sukrose forløpningen i 14 mL SW40 rør ved nøye pipettering 1,5 mL 60% sukrose lager bufferen i bunnen av røret. Forsiktig legge til 4,5 mL 32% sukrose lager bufferen på 60% bandet uten å forstyrre den. Gjenta med 1,5 mL 23% sukrose lager buffer og igjen med 1,5 mL til 15% sukrose lager bufferen.
- Laste inn hele mitokondrie suspensjon (ca 3 mL) på sukrose graderingen.
- Sentrifuge SW40 rotoren på 139, 065 x g for 60 min.
- Nøye samle brun bandet migrere til grensesnittet til 32% og 60% sukrose bruker en overføring pipette, vanligvis 2-3 mL.
- Snapin-fryse renset mitokondrier i flytende nitrogen og store på-80 ° C.
3. Mitoribosome forberedelse
- Buffere kreves
Merk: Forberede følgende lager løsninger forhånd for lyseringsbuffer, sukrose pute/gradient og rørets buffer.- Gjøre 10 mL lyseringsbuffer: 25 mM HEPES-KOH, pH 7.5 150 mM KCl, 50mM MgOAc, 2% polyetylenglykol octylphenyl Eter, 2 mM DTT, proteasehemmere.
- Gjøre 10 mL sukrose pute buffer: 1 M sukrose (34% w/v), 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20 mM MgOAc, 1% polyetylenglykol octylphenyl Eter, 2 mM DTT.
- Gjøre 5 mL rørets buffer: 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20mM MgOAc, 2 mM DTT
- Lag 15% - 30% lineær sukrose forløpninger med rørets buffer i TLS-55 polykarbonat rør.
- Mitoribosome rensing
- Tine frossen mitokondrier på is.
- Legg 2 mengder lyseringsbuffer,f.eks legge 6 mL lyseringsbuffer til 3 mL mitokondrier. Bland umiddelbart ved å snu røret flere ganger.
- Homogenize med en liten Teflon/glass dounce homogenizer å hjelpe lyse og ruge i 5-10 min på is å fullføre lyse.
- Sentrifuge lysed materialet (ca 9 mL) på 30.000 x g for 20 min, 4 ° C fjerne uløselig materialet. Dekanter nedbryting nøye fra pellet og kast pellet.
- Gjenta sentrifugering 30.000 x g for 20 min på 4 ° C å sikre avklaring av nedbryting. Dekanter nedbryting nøye fra pellet og kast pellet.
- Forberede sukrose pute i TLA 120,2 rør (krystallklart): 0,4 mL sukrose pute per rør. Forberede en tube per mL lysed materiale.
- Lag lysed mitokondrier på sukrose pute: ca 1 mL per tube, som resulterer i en lysate: pute forholdet mellom 2.5: 1.
- Sentrifuge eksempel på 231, 550 x g for 45 min i TLA120.2 rotoren på 4 ° C.
- Forkaste nedbryting og skyll rør sekvensielt med 100 µl rørets bufferstørrelsen fjerne gjenværende sukrose.
- Resuspend pellets totalt 100 µl rørets buffer.
- Vortex på sakte fart for 30 å oppløse de gjenværende Aggregatene og sentrifuge 17,949 x g i 10 min i microtube sentrifuge på 4 ° C.
- Nøye samle nedbryting og gjenta sentrifugering.
- Måle mitoribosome absorpsjon på A260.
Merk: Typisk avkastningen er 7 A260, med A260: A280 forholdet mellom 1.3. - Laste inn hele utvalget til en enkel lineær sukrose gradient rør. Virvel i TLS-55 rotoren på 213, 626 x g for 120 minutter til 4 ° C.
- Smuldre vekk graderingen, fastslår optisk densitet ved A260 og basseng brøken tilsvarer nukleinsyre toppen sammen.
Merk: Den typiske A260: A280 toppen er > 1.6. - Utveksle bufferen om nødvendig bruke en valg. Beregne den endelige konsentrasjonen ved hjelp konvertering 1 A260 = 0,1 mg/mL.
- Fest fryse renset mitoribosome prøven i rørets buffer og butikk på-80 ° C.
Representative Results
Dele og svært levedyktig celler er et viktig utgangspunkt for rensing av aktive mitoribosomes. Denne protokollen gjelder HEK293 suspensjon celler. Vi bruker interne celle linje T501, som er stabilt uttrykke en transporter tetracycline-induserbart kontroll. Foreldrekontroll celle linjen er HEK293S-GnTI- celler (Tabell for materiale)10. I cellevekst og ekspansjon i FreeStyle 293 uttrykk Medium minimal tetthet bør holdes på 1,5 x 106 celle/mL, for å sikre en dobling rate på annenhver dag, mens maksimale celle tetthet bør ikke overstige ~ 5 x 106 cellers / mL. ved å nå en celle tetthet over 3 x 106 celle/mL cellene pelleted og resuspended i en fersk, forvarmet medier i et utvidet volum for å oppnå minimum celle tettheten av 1,5 x 106 celle/mL. Denne deling er utført flere ganger hver 2-3 dager til en ønsket cellemasse fremgangsmåten er oppnådd. Den siste celle tettheten kan variere mellom 3 til 4,5 x 106 celle/mL, og minst 2 L kreves som et utgangspunkt for isolering av mitokondrier. Cellen levedyktigheten bør opprettholdes generelt > 90%, og den endelige kulturen som er høstet > 95%. Behandling av storskala cellekultur med antibiotika er ikke anbefalt.
Etter en rekke differensial centrifugations, volumet av mitokondrie suspensjon etter trinn 2.2.20 er vanligvis mellom 3-5 mL. Mitokondrier er så skilt på sukrose gradient (figur 1) fra andre. Forløpningen gradvis sukrose er forberedt slik at volumet på graderingen og volumet av mitokondrie suspensjon sammen fylle opp sentrifugeringsrøret til maksimal volumet. Her spesiell behandling er nødvendig å samle brun bandet migrere til 60% / 32% grensesnitt med minimal forurensning fra omkringliggende bufferen. Dette er viktig for å holde konstant protein: vaskemiddel forholdet i følgende trinn i mitokondrier solubilization. Det anbefales å vurdere mitokondrie protein konsentrasjonen på dette stadiet, og en typisk avkastning av 15-20 mg totale mitokondrie protein forventes fra ~ 1010 kultivert HEK celler.
Etter vellykket mitokondrier isolasjon, de er lysed med tillegg av polyetylenglykol octylphenyl Eter og mitoribosomes skilles gjennom en sukrose pute (figur 2). For å skille mitoribosomes fra hydrofobe membranous stoffet, pellets er resuspended i bufferen ikke inneholder vaskemiddel, og hydrofobe komplekser er pelleted med sentrifugering. Denne fremgangsmåten gjentas, og rensing graden av mitoribosomes er kvantifisert ved A260/A280 forhold, som forventes å bli ~ 1.3. Typisk avkastning er 7 A260 fra en 2 L starter kultur. Denne mitoribosomal fraksjonen inneholder også flere store løselig mitokondrie komplekser, som pyruvate dehydrogenase og glutamat dehydrogenase. For å skille mitoribosomes fra løselig mitokondrie komplekser, brukes nedbryting sukrose tetthet gradering. Brøker som inneholder mitoribosome er vanligvis plassert nederst tredje av røret. Fraksjoneres på graderingen som sukrose gjøres deretter med en automatisert stempel eller manuelt ved forsiktig å ta 50 µL brøker med en pipette eller ved punching tube bunnen med en 21 G nål og samle dråper.
To store mitoribosomal bestander identifiseres i forløpningen: monosome 55S og store delenhet 39S, som illustrert i Figur 3 og Figur 4. Tilstedeværelsen av store delenhet brøken antyder at celler er høstet i en svært aktiv dele stat11. Forholdet mellom monosome og store delenhet topper endres. En ekstra topp ligger nærmere til bunns vises i preparater med forurensende cytoplasmatiske ribosomer 80. Vennligst merk at små sukrose forløpning svingende bøtte rotoren TLS-55 tillater rask rensing av ~ 1 mL av mitoribosomes på en optisk densitet 0.4-1 en260. Separasjon av de monosome og store delenhet topper kan variere noe avhengig av i fraksjoneres, men det er vanligvis noen overlapping av de to toppene. Derfor som brøker for å samle inn, og bassenget bør tas i betraktning for å sikre den høyeste andelen monosome, eller alternativt store delenhet, i utvalget. For høy oppløsning cryo-EM studier er avstanden mellom to mitoribosomal befolkningen ikke absolutt nødvendig (på grunn av ekstra i sili operasjoner). Men hvis bedre separasjon er nødvendig, anbefales det å bruke større rør og tilhørende kjører ganger.
Figur 1 : Rensing av mitokondrier på sukrose gradering. Subcellular organeller fra en 2 L starter kultur var fraksjonert gjennom en rekke differensial centrifugations som beskrevet i protokollen, og mitokondrier ble skilt på usammenhengende sukrose gradering. Renset mitokondrier finnes i nedre band på 32% / 60% grensesnittet.
Figur 2 : Rensing av mitoribosomes på en sukrose pute. Grov mitoribosomes fra en 2 L Start kultur er sedimented gjennom 1 M sukrose pute. Pellets er resuspended i en vaskemiddel uten buffer, og mitoribosomes er avklart av to centrifugations som beskrevet i protokollen. Absorbansen registreres for å vurdere kvaliteten på forberedelse og typisk A260/A280 forholdet mellom ~1.3 (høyre panel) bekrefter en mitoribosome rike brøkdel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Fine rensing av mitoribosomes på sukrose gradering. Absorbansen spor fra en 2 L starter kultur. Fraksjoner er nummerert fra toppen til bunnen av graderingen. To store mitoribosomal bestander identifiseres: store delenhet (peak 1) og monosome 55S (peak 2). Forholdet mellom de endres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Elektron mikroskop-bilde, 2D klasser og 3D rekonstruksjon. Venstre side: et mikroskop-bilde med prøven fra monosome toppen 2 på en kalibrert forstørrelse på 1,23 A / piksel. Midt-panelet: En representant etterbehandling data (2D klasser) avsløre intakt monosomes. Høyre panel: 3D rekonstruksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Om kilden til starter materiale, selv om relativt lett tilgjengelig dyr vev som er kjent for å være en rik kilde til mitokondriene, gjør det et populært valg for mitoribosomes3,5,12, 13, de kan ikke genetisk endret og gjengitt i laboratoriet lett. Derfor er det klart praktiske behov for å utvikle protokoller som involverer homogent kulturperler humane cellelinjer. Hovedforskjellen mellom protokollene håndtere vev og kultivert celler er lyse og homogenisering. Kultivert celler dyrket som en monolayer, er en typisk metoden Teflon/glass dounce homogenisering14. Opprinnelige forberedelse protokollene mens effektiv ble utviklet for små skjell15. En direkte skalere opp ansette en homogenizer med kapasitet på 500 mL er mulig11, men det krever ~ 2 timer med manuell arbeidskraft å oppnå 80% lysis. Dette introdusert minst tre spørsmål: samling av organeller på grunn av lang ventetid, ikke-homogene lysis på grunn av tung materialet synker til bunnen av en stor fartøy, oppvarming av prøven på grunn av nødvendigheten av flere strøk. Derfor benytter en foretrukne lysis nitrogen kavitasjon, som er basert på dekompresjon fra en trykksatt fartøyet16,17. I denne metoden er celler først svulmet på kalde rommet for å bløtgjøre cellene og gjøre dem mer utsatt for lysis. Som de er plassert i nitrogen kavitasjon enheten en buffer som inneholder sukrose og mannitol legges for å opprettholde en osmotisk trykk som vil bidra til å holde mitokondrier intakt. Nitrogen kavitasjon enheten er så trykk med store mengder oksygenfri nitrogen, som oppløses i cellene. Som trykket er utgitt nitrogen bobler av løsningen som resulterer i rupturing cellemembraner. Denne metoden gir flere fordeler over mekanisk homogenisere metoder som involverer skjær stress og friksjon som følger: 1) noen eksterne fysisk stress på cellene unngås; 2) en Adiabatisk utvidelse som kjøler prøven, sikrer ingen varmeskade organeller; 3) cellen komponenter er beskyttet mot oksidering av inert nitrogen gassen; 4) ingen pH endring av suspending medium; 5) prosessen er jevn og reproduserbar fordi de samme forstyrrende styrkene brukes i hver celle og hele prøven; 6) prosessen er rask og kan fullføres innen 20-30 min.
Isolering av mitokondrier fra kulturperler celler og vev har blitt beskrevet i litteraturen omfattende, og det er basert på en mild celle avbrudd en rekke differensial centrifugations. De fleste protokollene som brukes for øyeblikket følger de opprinnelige prosedyrene utarbeidet i midten av forrige århundre18. Selv de grunnleggende biokjemiske tilnærmingene er riktige, finnes det flere misforståelser som er merket i litteratur og Döberitz. For å optimalisere protokollen for mitoribosomes, vi systematisk undersøkt rapporterte de generelle prinsippene og konkludere med at: 1) inkludering av Mg2 + og K+ i bufferen er ikke avgjørende. Det har blitt argumentert at KCl bidrar til å hindre cytoplasmatiske proteiner dannes en gel19, men gitt en tilstrekkelig fortynning som beskrevet i våre protokollen, dette fenomenet oppstår ikke. Videre er er utelukkelsen av Mg2 + nyttig for å redusere forurensing av cytoplasmatiske ribosomer20; 2) det er ikke nødvendig å holde maksimal mulig volumkontrollen celleområde til middels å beskytte utgitt organeller fra hypo-osmotisk miljøet. Osmotisk støtte i våre protokollen er tilstrekkelig levert av sukrose inneholder buffere og fortynning av celler med mitokondrier isolasjon buffer (trinn 2.II.5) er avgjørende for effektiv separasjon av organeller i en storstilt forberedelse.
PH i mitokondrier isolasjon bufferen er nær fysiologiske verdier, dvs 7.5, som er også optimal pH for følgende mitoribosome utarbeidelse. Bindende agenter EDTA og EGTA legges til isolasjon media til chelate forurensende ioner, og de chelate gratis magnesium og kalsium, henholdsvis. Det har vært diskutert at inkludering av EDTA kan føre til skade av det indre mitokondrie membran14, derfor konsentrasjonen er begrenset til 1 mM som en forholdsregel. Vi har ikke observert noen forskjell når du bruker 5 mM EDTA i siste rensing trinn sukrose tetthet graderingen.
Protokollen beskrevet bruker her HEK293S-avledet menneskelige celler for rensing av mitoribosome. Kvaliteten av preparatet kan fått prøven undersøkes biokjemisk og strukturelt å Atom løsning. Dette gjør det mulig å bruke metoden menneskelige mitoribosomal oversette komplekser, kvalitetskontroll samlinger og mitoribosomal underenheter intermediater. Videre siden kreftceller har forsterket OXPHOS kapasitet og forhøyet mitokondrie protein oversettelsen sammenlignet med tilstøtende stromal vev21, er mitoribosomes etablert narkotika mål for kreft22. Derfor vil bruker denne protokollen for spesifikke rensing av mitoribosomes i nærvær av hemmere ha medisinske anvendelser. Også har mitoribosomal mutasjoner vært knyttet til arvelige mitokondrie sykdommer23. Siden disse mutasjonene har direkte virkninger på strukturen, vil tilnærming presenteres her være nyttig for deres strukturelle karakterisering. Protokollen kan eksperimentelt utvidet og brukes til en rekke vitenskapelige spørsmål takle den grunnleggende forståelsen av oversettelse i menneskelig mitokondrier og dens medisinsk betydning.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den svenske stiftelsen for strategisk forskning (fremtidige ledere Grant FFL15:0325), Ragnar Söderberg Foundation (Fellowship i medisin M44/16), svensk Research Council (starter Grant NT × 2015-04107), FEBS langsiktig fellesskap (SA) , H2020-MSCA-ITN-2016 prosjektet 721757 (VS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
| Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
| Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
| Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
| T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
| Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
| 250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
| Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
| Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
| Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
| Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
| SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
| Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
| TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
| TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
| Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |
References
- Ott, M., Amunts, A., Brown, A. Organization and regulation of mitochondrial protein synthesis. Annual review of biochemistry. 85, 77-101 (2016).
- Amunts, A., Brown, A., Toots, J., Scheres, S. H., Ramakrishnan, V. The structure of the human mitochondrial ribosome. Science. 348 (6230), 95-98 (2015).
- Greber, B. J., Bieri, P., Leibundgut, M., Leitner, A., Aebersold, R., Boehringer, D., Ban, N. The complete structure of the 55S mammalian mitochondrial ribosome. Science. 348 (6232), 303-308 (2015).
- Greber, B. J., Ban, N. Structure and function of the mitochondrial ribosome. Annual review of biochemistry. 85, 103-132 (2016).
- Greber, B. J., Boehringer, D., Leitner, A., Bieri, P., Voigts-Hoffmann, F., Erzberger, J. P., Ban, N. Architecture of the large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome. Nature. 505 (7484), 515-519 (2014).
- Rorbach, J., Gao, F., Powell, C. A., D'Souza, A., Lightowlers, R. N., Minczuk, M., Chrzanowska-Lightowlers, Z. M. Human mitochondrial ribosomes can switch their structural RNA composition. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201609338 (2016).
- Chrzanowska-Lightowlers, Z., Rorbach, J., Minczuk, M. Human mitochondrial ribosomes can switch structural tRNAs-but when and why? RNA biology. 14 (12), 1668-1671 (2017).
- Gammage, P. A., Moraes, C. T., Minczuk, M. Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized. Trends in Genetics. , (2017).
- Brown, A., Rathore, S., Kimanius, D., Aibara, S., Bai, X. C., Rorbach, J., Ramakrishnan, V. Structures of the human mitochondrial ribosome in native states of assembly. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 866 (2017).
- Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogenous N-glycosylation by tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 99, 13419-13424 (2002).
- Brown, A., Amunts, A., Bai, X. C., Sugimoto, Y., Edwards, P. C., Murshudov, G., Ramakrishnan, V. Structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria. Science. 346 (6210), 718-722 (2014).
- O'Brien, T. W., Kalf, G. F. Ribosomes from rat liver mitochondria I. Isolation procedure and contamination studies. Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2172-2179 (1967).
- Spremulli, L. L. Large-scale isolation of mitochondrial ribosomes from mammalian tissues. Mitochondria: Practical Protocols. , 265-275 (2007).
- Rice, J. E., Lindsay, J. G. Subcellular fractionation of mitochondria. Subcellular Fractionation: A Practical Approach. Grahamand, J. M., Rickwood, D. , IRL Press. Oxford. 107-142 (1997).
- Attardi, G., Ching, E. Biogenesis of mitochondrial proteins in HeLa cells. Methods in enzymology. 56, 66-79 (1979).
- Gottlieb, R. A., Adachi, S. Nitrogen cavitation for cell disruption to obtain mitochondria from cultured cells. Methods in enzymology. 322, 213-221 (2000).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), (2010).
- Kennedy, E. P., Lehninger, A. L. Oxidation of fatty acids and tricarboxylic acid cycle intermediates by isolated rat liver mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 179 (2), 957-972 (1949).
- Graham, J. M. Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3, Unit 3.3, (2001).
- Amunts, A., Brown, A., Bai, X. C., Llácer, J. L., Hussain, T., Emsley, P., Ramakrishnan, V. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).
- Sotgia, F., Martinez-Outschoorn, U. E., Howell, A., Pestell, R. G., Pavlides, S., Lisanti, M. P. Caveolin-1 and cancer metabolism in the tumor microenvironment: markers, models, and mechanisms. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 7, 423-467 (2012).
- Škrtić, M., Sriskanthadevan, S., Jhas, B., Gebbia, M., Wang, X., Wang, Z., Lai, C. K. Inhibition of mitochondrial translation as a therapeutic strategy for human acute myeloid leukemia. Cancer cell. 20 (5), 674-688 (2011).
- Boczonadi, V., Horvath, R. Mitochondria: impaired mitochondrial translation in human disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 48, 77-84 (2014).
