Summary
Mitokondrierna har specialiserade ribosomer som avvek från bakteriell och cytoplasmiska motsvarigheterna. Här visar vi hur mitoribosomes kan erhållas från deras infödda fack i HEK celler. Metoden innebär isolering av mitokondrier från suspension celler och påföljande rening av mitoribosomes.
Abstract
Mänskliga mitokondrierna besitter en särskild uppsättning ribosomer (mitoribosomes) som översätter 13 väsentliga proteinkomponenter av oxidativ fosforylering komplex kodas av mitokondriella genomet. Eftersom alla proteiner syntetiseras av mänskliga mitoribosomes är integrerad membranproteiner, är mänskliga mitoribosomes bundna till det mitokondriella inre membranet under översättning. Mitoribosome jämfört cytosoliska Ribosomen och har en sedimentation koefficient 55S, halv rRNA innehållet, ingen 5S rRNA och 36 ytterligare proteiner. Därför gör högre protein-till-RNA förhållande och en atypisk struktur den mänskliga mitoribosome väsentligen skiljer sig från dess cytosoliska motsvarighet.
Trots den centrala betydelsen av mitoribosome till liv fanns inga protokoll att rena det intakt komplexet från mänskliga cellinjer. Traditionellt mitoribosomes isolerades från mitokondrier-rika djurvävnader som krävs kg av utgångsmaterial. Vi resonerade att mitokondrier i dela HEK293-härledda mänskliga celler odlas i näringsrika uttryck medium skulle ha en aktiv mitokondriell översättning, och, därför kunde vara en lämplig källa till material för de strukturella och biokemiska studierna av mitoribosome. För att undersöka dess struktur, utvecklade vi ett protokoll för storskalig rening av intakt mitoribosomes från HEK celler. Häri, introducerar vi kväve kavitation metod som ett snabbare, mindre arbetsintensiva och effektivare alternativ till traditionella mekaniska skjuvning-baserade metoder för cellys. Detta resulterade i förberedelserna av de mitoribosome som möjliggjorde dess strukturella beslutsamhet att hög upplösning, avslöjar den intakt mänskliga mitoribosome och dess montering intermediärer sammansättning. Här, vi följa upp detta arbete och presentera en optimerad och mer kostnadseffektiv metod som kräver endast ~ 1010 odlade HEK celler. Metoden kan användas för att rena mänskliga mitoribosomal översätta komplex, mutanter, kvalitetskontroll sammansättningar och mitoribosomal subenheter intermediärer. Rening kan vara linjärt skalas upp tio gånger om det behövs, och också tillämpas på andra typer av celler.
Introduction
Processen för fungerande mitokondriell proteintillverkning bygger på 13 väsentliga mt-mRNA som översätts av en specialiserad membran-anslutna mitoribosome bildar katalytiska kärnan i luftvägarna kedjan. De förändrade mitokondriella genomet och behovet av proteinerna att infoga co-translationally i membranet har väsentligen formade arkitekturen av den mitokondriella ribosomer1. Senaste högupplösta strukturer av de däggdjur mitoribosome visade en påfallande olika övergripande utseende till bakteriell motsvarighet2,3. Särskilt, läggs minst 36 mitokondrierna-specifika proteiner, bidrar ~ 1 MDa extra molekylärt samlas, medan mt-rRNA är minskat med dubbla och mycket avvek. De strukturella rearrangements ändra nästan alla kritiska funktioner som var tidigare allmänt accepterat att vara universellt bevarad4.
Nya huvudsakliga element har förvärvats av var och en av mitoribosomal subunitsna, exempelvis den små subuniten har införlivat en inneboende GTPase protein mS29 i dess 'huvud' region. GTPase verksamhet har inte hittats i andra översättningssystem och struktur indikerar att GTPase kan ha en roll i subenhet montering2. Den 5S-rRNA som ansågs vara en landmark av alla kända ribosomal stora subenheter, som utgör kärnan av centrala förhöjning, saknas i de däggdjur mitoribosome och har antagit mt-tRNA-Val som en viktig byggsten i stället2. Förbud och kollegor visade att de svin mitoribosome har mt-tRNA-Phe och inte – Val5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk och kollegor följde upp dessa data och hittade att mitoribosomes från patienter med nedsatt mt-tRNA-Val stabilitet i princip rymmer mt-tRNA-Phe6,7. Varför mitoribosomes har införlivat dessa specifika element och vilka vägar och trans-faktorer krävs för dessa unika sammansättningar förbli okänd.
Sammantaget innebär höga komplexiteten i den mänskliga mitoribosome, nya proteinkomponenter och unika föreningen av den mt-tRNAen som ett strukturelement medverkan av som-ännu-unknown mitokondrierna-specifik trans -faktorer. Men eftersom många av funktionerna i detta system är unikt för mitokondrierna, som traditionellt har varit svårt att undersöka8, är lite känt om mekanismen för molekylär och kvalitetskontroll. Med utvecklingen av högupplösta enda Partikelanalys av electron cryo-mikroskopi (cryo-EM)20uppstår möjligheter nu utförligt studera de molekylära mekanismer bakom församlingen, action och kvalitetskontroll av människan mitoribosome. Vår rapport om den mänskliga mitoribosome församlingen mellanliggande första struktur ger ett erkännande att det är möjligt att visualisera hur den mänskliga mitoribosome bildas och visar att cryo-EM är avgörande för identifiering av nya trans- tillförordnad församlingen faktorer9.
För att expandera på detta inledande arbete, beskriver vi en snabb protokoll för mänskliga mitoribosome rening i detalj. I den första delen av protokollet beskrivs en storskalig isolering av högt rent intakt mitokondrier från suspension celler. Detta förfarande kan kräver 9 h och ändras enkelt och anpassat till olika celltyper och skalor. Ett viktigt steg i detta protokoll är användningen av kväve kavitation att bryta öppna cellerna. Den andra delen av protokollet utvecklades för att rena mitoribosomes. Detta förfarande kräver 7 h och ger en tillräcklig mängd mitoribosomes för biokemiska och strukturella studier. Användning av ren mitokondrier som utgångsmaterial erbjuder högkvalitativa sista förberedelserna och kan extrapoleras till andra mitokondriella makromolekyler.
Protocol
Alla däggdjursceller kulturarbete måste utföras inuti biologiska säkerhetsdragskåp. Använd steril utrustning om kontakt med celler. Bära nitrilhandskar och en labbrock och följer bra vävnadsodling praxis.
1. cell kultur
- Upprätthålla HEK293S suspension celler i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% tetracyklin-fritt fetalt bovint serum (FBS), 5 μg/mL blasticidin och 200 μg/mL azitromycin, vid 37 ° C och 5% CO2.
- Skala upp till 9 x T175 kolvar. På 90% konfluens, skörda celler och snurra dem ner på 500 x g för 5 min. Omsuspendera pelleterat cellerna i Freestyl kompletteras med 5% tetracyklin-fri FBS. Räkna celler med en automatisk cell räknare och justera cellkoncentrationen till 1,5 x 106 celler/mL i en ventilerad skakningar kolv.
Obs: Detta vanligtvis motsvarar en start volym 300 ml i en ventilerad 1000 mL-mätkolv. - Inkubera cellerna i en skakande inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 på 120 rpm (skakningar 50 mm i diameter).
- Efter 2 dagar räkna cellerna och fortsätt att dela celler om cell densiteten överstiger 3,0 x 106 celler/mL. Dela upp celler genom att snurra ner 2 x 150 mL cellkultur i 2 x 250 mL koniska flaskor på 500 g för 5 min. Omsuspendera cellerna i 2 x 10 mL färsk media och överför till en 2 x 1, 000 mL ventilerade kolvar som innehåller lämplig volym för en sista cell densiteten av 1,5 x 106 cell/mL, t.ex 2 x 300 mL från en start cell densiteten av 3.0 x 106 celler/mL.
- Inkubera cellerna i en skakande inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 på 120 rpm (skakningar 50 mm i diameter).
- Efter två dagar räkna cellerna och fortsätt att dela celler om cell densiteten överstiger 3,0 x 106 celler/mL. Split cellerna av spinning ner 4 x 150 mL cellkultur i 4 x 250 mL koniska flaskor på 500 g för 5 min. Omsuspendera cellerna i 2 x 10 mL färsk media och överföra till ventilerade 2 x 2 000 mL-kolv som innehåller lämplig volym för en sista cell densiteten av 1,5 x 106 cell/mL, t.ex 2 x 700 mL från en start cell densiteten av 3.0 x 106 celler/mL.
- Inkubera cellerna i en skakande inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 på 120 rpm (skakningar 50 mm i diameter).
- Efter två dagar räkna cellerna och fortsätt att dela celler om cell densiteten överstiger 3,0 x 106 celler/mL. Dela upp celler genom att hälla på 2 x 700 mL ventileras cellodling in 2 x 2800 mL kolvar och påfyllning med 2 x 300 mL färsk mediet för att nå en volym av 2 x 1 L.
- Inkubera cellerna i en skakande inkubator vid 37° C och 5% CO2 på 120 rpm (skakningar 50 mm i diameter).
- Efter 24 h räkna cellerna och skörda cellerna om cell densiteten är mellan 3,0-4,0 x 106 celler/mL.
2. mitokondrier isolering
- Buffertar som krävs
Obs: Kvantiteterna ges för ett preparat från 2 L celler. Förbered följande lager lösningar före tid för mitokondriell isolering buffert (MIB), sackaros/mannitol buffert (SM4), experimentell buffert (MIBSM), resuspension buffert (SEM).- Gör 0,5 L MIB buffert: 50mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, proteashämmare.
- Gör 100 mL SM4 buffert: 280 mM sackaros, mannitol 840 mM, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 m M DTT, proteashämmare.
- Gör 160 mL MIBSM buffert: 120 mL MIB buffert + 40 mL SM4 buffert.
- Lagra 200 mL PBS vid 4 ° C.
- Göra 5 mL SEM buffert: 250 mM sackaros, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA.
- Gör 4 x 10 mL stamlösningar för stegvis sackaros toningen som innehåller 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA och 60% / 32% /23% och 15% sackaros, respektive.
- Mitokondrier isolering
Obs: Det är viktigt att arbeta snabbt och hålla allt på is under hela förfarandet. - Precool den kväve kavitation kammare före användning.
- Skörda 2 x 1 L celler (3-4 x 109 celler per centrifugrör) genom centrifugering vid 1 000 x g i 7 min, 4 ° C.
- Dekantera supernatanten noggrant och resuspendera pelleterat cellerna snabbt i 2 x 100 mL PBS. Poolen cellerna.
- Centrifugera återsuspenderade cellerna vid 1200 x g i 10 min, 4 ° C.
- Dekantera supernatanten noggrant och väger pelleten (~ 20 g).
- Återsuspendera pelleten i 120 mL MIB buffert.
- Tillåta celler att svälla av försiktigt under omrörning i ett kallt rum för 10 min.
- Placera kväve kavitation kammaren på isen och överföra svällning cellerna till kväve kavitation kammaren. Lägga till 45 mL SM4 buffert (1/3 av den slutliga volymen av återsuspenderade celler, ca 140 mL, ger en slutlig koncentration på 70 mM sackaros och 210 mM mannitol).
- Fäst den kväve kavitation kammaren och fyll med kväve tills trycket når 500 psi. Stäng kranarna och hålla isolerade på is i 20 min.
- Släpp trycket i kväve kavitation kammaren långsamt och samla den lysate (cirka 185 mL).
- Centrifugera lyserat materialet för att ta bort cellfragment och atomkärnor vid 800 x g i 15 min, 4 ° C.
- Samla in supernatanten genom att hälla den genom cheesecloth i en bägare som hålls på is. Kasta inte pelleten.
- Återsuspendera pelleten i 90 mL MIBSM buffert (1/2 föregående volymen). Homogenisera med Teflon/glas Dounce Homogenisatorer och upprepa centrifugeringen vid 800 x g i 15 min, 4 ° C.
- Samla in supernatanten genom att hälla den genom cheesecloth i en bägare som hålls på is. Kombinera denna supernatanten med supernatanten från steg 2.2.11.
- Centrifugera kombinerade supernatanterna vid 1 000 x g i 15 min, 4 ° C.
- Samla in supernatanten genom att hälla den genom cheesecloth i en bägare som hålls på is.
- Kassera pelleten och Centrifugera supernatanten innehållande rå mitokondrierna vid 10 000 x g i 15 min, 4 ° C.
Obs: Kommer pelleten består vanligtvis av två delar: löst och hårt. - Tvätta noggrant ut lös pelleten utan att störa den trånga delen. Återsuspendera snäva pelleten i 10 mL MIBSM buffert.
- Utföra en protein koncentration analysen med en kommersiell Protein Assay Kit eller liknande metod. Typisk koncentration avkastningen från 2 L start kultur är ~ 2 mg/mL.
- Lägga till 200 enheter av RNase gratis DNAS och låt rotera på en roller i kylrummet för 20 min att blanda jämnt DNAS för borttagning av genomisk DNA.
- Centrifugera vid 10 000 x g i 15 min, 4 ° C och återsuspendera pelleten i 2 mL SEM buffert. Homogenisera försiktigt med en liten Teflon/glas Dounce Homogenisatorer för att resuspendera eventuella återstående aggregat. Utföra högst fem up-and-down passerar för att undvika brott. Hålla på is.
- Förbereda sackaros lutningen i 14 mL SW40 rör genom noggrant pipettering 1,5 mL 60% sackaros lager buffert i botten av röret. Tillsätt försiktigt 4,5 mL av 32% sackaros lager bufferten ovanpå 60% bandet utan att störa den. Upprepa med 1,5 mL 23% sackaros lager buffert och igen med 1,5 mL 15% sackaros lager buffert.
- Fyll hela mitokondriell suspensionen (ca 3 mL) ovanpå sackaros övertoningen.
- Centrifugera i SW40 rotor på 139, 065 x g för 60 min.
- Omsorgsfullt samla bruna bandet migrera till gränssnittet för 32% och 60% sackaros med hjälp av en överföring pipett, vanligtvis 2-3 mL.
- Snapin-frysa renat mitokondrierna i flytande kväve och förvaras vid-80 ° C.
3. Mitoribosome beredning
- Buffertar som krävs
Obs: Förbereda följande lager lösningar före tid för lyseringsbuffert, sackaros kudde/gradient och resuspension buffert.- Gör 10 mL lyseringsbuffert: 25 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 150 mM KCl, 50mM MgOAc, 2% polyetylenglykol octylphenyl eter, 2 mM DTT, proteashämmare.
- Gör 10 mL sackaros kudde buffert: 1 M sackaros (34% w/v), 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20 mM MgOAc, 1% polyetylenglykol octylphenyl eter, 2 mM DTT.
- Göra 5 mL resuspension buffert: 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20mM MgOAc, 2 mM DTT
- Göra 15-30% linjär sackaros övertoningar med resuspension buffert i TLS-55 polykarbonat rör.
- Mitoribosome rening
- Tina frysta mitokondrierna på is.
- Lägg 2 volymer lyseringsbuffert,t.ex. lägga till 6 mL lyseringsbuffert 3 mL mitokondrier. Blanda omedelbart genom att vända tuben flera gånger.
- Homogenisera med en liten Teflon/glas dounce Homogenisatorer att bistå Lys och inkubera i 5-10 min på is att slutföra Lys.
- Centrifugera lyserat materialet (cirka 9 mL) vid 30 000 x g i 20 min, 4 ° C ta bort olösligt material. Dekantera supernatanten noggrant från pelleten och kassera pelleten.
- Upprepa centrifugeringen vid 30 000 x g i 20 min vid 4 ° C för förtydligande av supernatanten. Dekantera supernatanten noggrant från pelleten och kassera pelleten.
- Förbereda sackaros dynan i TLA 120,2 rör (Ultra clear): 0,4 mL sackaros kudde per rör. Laga en röret per mL lyserat material.
- Lager lyserat mitokondrier på sackaros kuddar: ungefär 1 mL per rör, vilket resulterar i en lysate: kudde förhållandet mellan 2.5:1.
- Centrifugera provet vid 231, 550 x g i 45 min i TLA120.2 rotor vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och skölj rören sekventiellt med 100 µl av resuspension bufferten att ta bort kvarvarande sackaros.
- Återsuspendera pellets i totalt 100 µl resuspension buffert.
- Vortex på långsam hastighet för 30 s att lösa upp återstående aggregaten och centrifugera 17,949 x g i 10 min i mikrorör Centrifugera vid 4 ° C.
- Noggrant samla supernatanten och upprepa centrifugeringen.
- Mäta mitoribosome absorption vid A260.
Obs: Den typiska avkastningen är 7 A260, med A260: A280 baserat på 1,3. - Fyll hela provet på en enkel linjär sackaros lutning röret. Centrifugera i TLS-55 rotor på 213, 626 x g under 120 minuter vid 4 ° C.
- Fractionate lutning, bestämma den optiska densiteten vid A260 och pool den del som motsvarar den nukleinsyra toppen tillsammans.
Obs: Typiska A260: A280 förhållandet av toppen är > 1,6. - Utbyta bufferten vid behov med en metod för val. Beräkna den slutliga koncentrationen med konvertering 1 A260 = 0,1 mg/mL.
- Snapin frysa renat mitoribosome provet i resuspension buffert och förvaras vid-80 ° C.
Representative Results
Dela och mycket livskraftiga celler är en viktig utgångspunkt för rening av aktiva mitoribosomes. Detta protokoll är tillämpligt till någon HEK293 suspension celler. Vi använder egen cell fodrar T501, som stabilt uttrycker en transportör tetracyklin-inducerbara kontroll. Föräldrakontroll cell linjen är HEK293S-GnTI– celler (Tabell för material)10. Under cellernas tillväxt och expansion i FreeStyle 293 uttryck Medium minimal densiteten bör hållas 1,5 x 106 cell/mL, för att säkerställa en fördubbling andelen varannan dag, medan maximal cell densiteten bör inte överstiga ~ 5 x 106 cell / mL. när den når en cell densiteten över 3 x 106 cell/mL är cellerna pelleterat och resuspended i en fräsch, förvärmd media i en utökad volym att uppnå minsta cell densiteten av 1,5 x 106 cell/mL. Denna uppdelning utförs upprepade gånger varje 2-3 dagar tills en önskad cellmassan till förfarandet uppnås. Sista cell densiteten kan variera i intervallet 3-4,5 x 106 cell/mL och minst 2 L krävs som utgångspunkt för isolering av mitokondrier. Cellviabiliteten bör bibehållas Allmänt > 90%, och för den slutliga kultur som skördas > 95%. Behandling av storskaliga cellkulturen med antibiotika rekommenderas inte.
Efter serien av differential centrifugations, volymen av den mitokondriella suspensionen efter steg 2.2.20 är vanligtvis i intervallet 3-5 mL. Mitokondrierna är sedan separerade på toningen som sackaros (figur 1) från andra organeller. Stegvis sackaros toningen är beredd så att volymen på toningen och volymen av mitokondriell upphängning tillsammans fylla upp centrifugering röret till dess maximal volym. Här särskild omsorg som behövs för att samla in bruna bandet migrera till 60% / 32% gränssnitt med minimal förorening från omgivande bufferten. Detta är viktigt för att hålla konstant protein: tvättmedel baserat i följande steg i mitokondrierna lösbarhet. Det är klokt att bedöma den mitokondriella proteinkoncentration i detta skede, och en typisk avkastning på 15-20 mg totalt mitokondriell protein förväntas från ~ 1010 odlade HEK celler.
Vid lyckad mitokondrier isolering, de är lyserat genom tillsats av polyetylenglykol octylphenyl eter, och mitoribosomes skiljs åt genom en sackaros kudde (figur 2). För att skilja mitoribosomes från den hydrofoba membranös substansen, pellets är resuspended i bufferten inte innehåller rengöringsmedel och hydrofoba komplex är pelleterat genom centrifugering. Denna procedur upprepas och rening graden av mitoribosomes kvantifieras i A260/A280 förhållande, som förväntas vara ~ 1,3. Typiska avkastningen är 7 A260 från en 2 L start kultur. Denna mitoribosomal fraktionen innehåller också ytterligare stora lösliga mitokondriell komplex, såsom pyruvat dehydrogenas och glutamat dehydrogenas. För att skilja mitoribosomes från de lösliga mitokondriella komplex, tillämpas supernatanten en sackaros täthetlutning. Fraktioner som innehåller mitoribosome är generellt belägna längst tredje av röret. Fraktioneringen av sackaros övertoningen kan sedan göras med en automatiserad kolv eller manuellt genom att försiktigt ta 50 µL fraktioner med en pipett eller genom stansning tube botten med en 21 G nål och samla in dropparna.
Två stora mitoribosomal populationer identifieras i övertoningen: monosome 55S och stora subenheten 39S, som illustreras i figur 3 och figur 4. Närvaron av den stora subunit fraktionen föreslår att celler skördas i en högaktiv avdelande staten11. Förhållandet mellan monosome och stora subenheten toppar kan ändras. En ytterligare topp ligger närmare till botten kan visas i preparat med kontaminerande cytoplasmiska ribosomer 80S. Vänligen observera att lilla sackaros övertoning med den svängande hink rotor TLS-55 möjliggör snabb rening av ~ 1 mL av mitoribosomes på en optisk densitet 0,4-1 en260. Avskiljandet av monosome och stora subenheten toppar kan variera något beroende på fraktioneringen, men vanligtvis finns det viss överlappning av de två topparna. Därav, vilka fraktioner att samla in, och pool bör beaktas för att säkerställa den högsta andelen monosome eller alternativt stora subenheten, i provet. För högupplösta cryo-EM studier krävs separationen mellan de två mitoribosomal populationerna inte absolut (på grund av ytterligare i silico operationer). Dock om bättre separation är nödvändigt, rekommenderas att använda större tuber och motsvarande rinnande tider.
Figur 1 : Rening av mitokondrier på sackaros toning. Subcellulär organeller från en 2 L start kultur var fractionated genom en serie av differential centrifugations som beskrivs i protokollet och mitokondrier skildes på en diskontinuerlig sackaros lutning. Renat mitokondrierna finns i det lägre bandet på gränssnittet 32% / 60%.
Figur 2 : Rening av mitoribosomes på en sackaros kudde. Rå mitoribosomes från en 2 L start kultur är sedimenterade genom 1 M sackaros kudde. Pellets är resuspended i tvättmedel-fri buffert och mitoribosomes förtydligas av två centrifugations som beskrivs i protokollet. Absorbansen registreras för att bedöma kvaliteten på utarbetande och typiska A260/A280 förhållandet mellan ~1.3 (högra panelen) intygar bråkdelen mitoribosome rik. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Fin rening av mitoribosomes på en sackaros övertoning. Absorbansen spår från en 2 L start kultur. Fraktioner numreras från toppen till botten av övertoningen. Två stora mitoribosomal populationer identifieras: stora subenheten (topp 1) och monosome 55S (topp 2). Förhållandet mellan befolkningarna kan ändras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Elektron Mikrograf, 2D klasser och 3D rekonstruktion. Vänstra panelen: en mikrofotografi med provet från monosome topp 2 vid 1.23 A kalibrerad förstoring / pixel. Mitten panel: En representativ efterbearbetning data (2D klasser) avslöjar intakt monosomes. Högra panelen: 3D rekonstruktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
När det gäller källan till utgångsmaterial, även om relativt lätt tillgängligheten av djurvävnader som är kända för att vara en rik källa av mitokondrier, gör det ett populärt val för mitoribosomes3,5,12, 13, de kan inte vara genetiskt modifierade och reproduceras i labbet enkelt. Därför finns det ett klart praktiskt behov för att utveckla protokoll som omfattar homogeneously odlade mänskliga cellinjer. Den stora skillnaden mellan protokoll som behandlar vävnader och odlade celler är funktionsläget av Lys och homogenisering. För odlade celler odlas som en enskiktslager, är en typisk metod Teflon/glas dounce homogenisering14. De ursprungliga beredning protokoll medan effektiv utvecklades för små fjäll15. En direkt skala upp anställa en Homogenisatorer med 500 mL kapacitet är möjligt11, men det kräver ~ 2 h av manuellt arbete att uppnå 80% lysis. Detta introducerade minst tre frågor: aggregering av organeller på grund av långa väntetider, inhomogen Lys på grund av tunga materialet sjunka till botten av ett stort fartyg, uppvärmning av provet på grund av nödvändigheten av flera penndrag. Därför utnyttjar en föredra metoden med Lys kväve kavitation, vilket är baserat på dekompression från en trycksatt fartyget16,17. Den här metoden är celler först svällde i kylrummet för att mjuka upp cellerna och göra dem mer mottagliga för Lys. Som de är placerade i enhetens kväve kavitation läggs en buffert som innehåller sackaros och mannitol för att bibehålla en osmotiska trycket som kommer att hålla mitokondrier intakt. Kväve kavitation enheten trycksätts sedan med en stor volym av syrefri kväve, som upplöses i cellerna. Eftersom trycket är släppta kväve bubblorna ur lösning vilket resulterar i spricker av cellmembranen. Denna metod erbjuder flera fördelar jämfört med mekaniska homogeniserande metoder som involverar skjuvspänningar och friktion enligt följande: 1) externa fysiska stress på cellerna undviks. (2) en adiabatisk expansion som kyler provet, garanterar inga värmeskador organeller; (3) cell komponenter skyddas från oxidation av inert kväve gas; (4) ingen pH förändring av uppskjutande medium; (5) processen är enhetliga och reproducerbara eftersom samma störande krafter används inom varje cell och hela provet; (6) processen är snabb och kan slutföras inom 20-30 min.
Isolering av mitokondrier från odlade celler och vävnader har beskrivits i litteraturen omfattande, och den är baserad på en mild cell störningar följt av en serie av differential centrifugations. De flesta av protokoll som används för närvarande följer de ursprungliga förfaranden som utvecklats i mitten av förra seklet18. Medan de grundläggande biokemiska metoderna är rätt, finns det flera missuppfattningar som är belyst i litteraturen och förblev oupptäckt. För att optimera protokollet för mitoribosomes, vi systematiskt undersökt rapporterade allmänna principer och dra slutsatsen att: 1) införandet av Mg2 + och K+ i bufferten är inte avgörande. Det har hävdats att den KCl bidrar till att förhindra cytoplasmatiska proteiner bildas en gel19, dock ges en tillräcklig utspädning som beskrivs i våra protokoll, detta fenomen uppstår inte. Dessutom är uteslutande av Mg2 + användbart för att minska föroreningar av cytoplasmisk ribosomer20; (2) det finns ingen anledning att hålla maximal möjlig volymförhållandet av celler till medium för att skydda de släppta organeller från hypo-osmotiska miljön. Osmotisk stöd i vårt protokoll tillhandahålls tillräckligt av sackaros som innehåller buffertar och utspädning av celler med mitokondrier isolering buffert (steg 2.II.5) är avgörande för effektiv separation av organeller i en storskalig beredning.
Mitokondrier isolering buffert pH ligger nära fysiologiska värden, dvs 7.5, som är också den optimala pH för följande mitoribosome beredning. Bindemedel EDTA och EGTA läggs till isolering media till kelat kontaminerande joner, och de kelat gratis magnesium och kalcium, respektive. Det har diskuterats att införandet av EDTA kan leda till skador på de inre mitokondriella membran14, därför koncentrationen är begränsad till 1 mM som en försiktighetsåtgärd. Vi har inte observerat någon skillnad när du använder 5 mM EDTA i steget slutliga rening av sackaros täthetlutning.
Protokollet beskrivs använder häri HEK293S-härledda mänskliga celler för rening av mitoribosome. Kvaliteten på förberedelserna tillåter det erhållna provet undersökas biokemiskt och strukturellt till atomär upplösning. Detta gör att man kan använda metoden på mänskliga mitoribosomal översätta komplex, kvalitetskontroll sammanställningar och mitoribosomal subenheter intermediärer. Dessutom, eftersom cancerceller har förstärkt OXPHOS kapacitet och förhöjda mitokondriell protein översättning jämfört med intilliggande stromal vävnad21, mitoribosomes är etablerade målmolekyler för cancer22. Använder det här protokollet för specifika rening av mitoribosomes i närvaro av hämmare har därför medicinska tillämpningar. Mitoribosomal mutationer har också kopplats till ärftliga mitokondriella sjukdomar23. Eftersom dessa mutationer har direkta effekter på strukturen, kommer att den strategi som presenteras här vara användbart för deras strukturella karakterisering. Protokollet kan experimentellt utvidgas och användas till en mängd vetenskapliga frågor att ta itu med den grundläggande förståelsen av översättning i mänskliga mitokondrier och dess medicinska betydelse.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av Stiftelsen för strategisk forskning (framtiden ledare Grant FFL15:0325), Ragnar Söderbergs stiftelse (Fellowship i medicin M44/16), Vetenskapsrådet (Starting Grant NT × 2015-04107), FEBS långsiktiga Fellowship (SA) , H2020-behöriga myndigheters-ITN-2016 projektet 721757 (VS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
| Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
| Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
| Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
| T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
| Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
| 250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
| Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
| Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
| Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
| Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
| SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
| Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
| TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
| TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
| Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |
References
- Ott, M., Amunts, A., Brown, A. Organization and regulation of mitochondrial protein synthesis. Annual review of biochemistry. 85, 77-101 (2016).
- Amunts, A., Brown, A., Toots, J., Scheres, S. H., Ramakrishnan, V. The structure of the human mitochondrial ribosome. Science. 348 (6230), 95-98 (2015).
- Greber, B. J., Bieri, P., Leibundgut, M., Leitner, A., Aebersold, R., Boehringer, D., Ban, N. The complete structure of the 55S mammalian mitochondrial ribosome. Science. 348 (6232), 303-308 (2015).
- Greber, B. J., Ban, N. Structure and function of the mitochondrial ribosome. Annual review of biochemistry. 85, 103-132 (2016).
- Greber, B. J., Boehringer, D., Leitner, A., Bieri, P., Voigts-Hoffmann, F., Erzberger, J. P., Ban, N. Architecture of the large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome. Nature. 505 (7484), 515-519 (2014).
- Rorbach, J., Gao, F., Powell, C. A., D'Souza, A., Lightowlers, R. N., Minczuk, M., Chrzanowska-Lightowlers, Z. M. Human mitochondrial ribosomes can switch their structural RNA composition. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201609338 (2016).
- Chrzanowska-Lightowlers, Z., Rorbach, J., Minczuk, M. Human mitochondrial ribosomes can switch structural tRNAs-but when and why? RNA biology. 14 (12), 1668-1671 (2017).
- Gammage, P. A., Moraes, C. T., Minczuk, M. Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized. Trends in Genetics. , (2017).
- Brown, A., Rathore, S., Kimanius, D., Aibara, S., Bai, X. C., Rorbach, J., Ramakrishnan, V. Structures of the human mitochondrial ribosome in native states of assembly. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 866 (2017).
- Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogenous N-glycosylation by tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 99, 13419-13424 (2002).
- Brown, A., Amunts, A., Bai, X. C., Sugimoto, Y., Edwards, P. C., Murshudov, G., Ramakrishnan, V. Structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria. Science. 346 (6210), 718-722 (2014).
- O'Brien, T. W., Kalf, G. F. Ribosomes from rat liver mitochondria I. Isolation procedure and contamination studies. Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2172-2179 (1967).
- Spremulli, L. L. Large-scale isolation of mitochondrial ribosomes from mammalian tissues. Mitochondria: Practical Protocols. , 265-275 (2007).
- Rice, J. E., Lindsay, J. G. Subcellular fractionation of mitochondria. Subcellular Fractionation: A Practical Approach. Grahamand, J. M., Rickwood, D. , IRL Press. Oxford. 107-142 (1997).
- Attardi, G., Ching, E. Biogenesis of mitochondrial proteins in HeLa cells. Methods in enzymology. 56, 66-79 (1979).
- Gottlieb, R. A., Adachi, S. Nitrogen cavitation for cell disruption to obtain mitochondria from cultured cells. Methods in enzymology. 322, 213-221 (2000).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), (2010).
- Kennedy, E. P., Lehninger, A. L. Oxidation of fatty acids and tricarboxylic acid cycle intermediates by isolated rat liver mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 179 (2), 957-972 (1949).
- Graham, J. M. Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3, Unit 3.3, (2001).
- Amunts, A., Brown, A., Bai, X. C., Llácer, J. L., Hussain, T., Emsley, P., Ramakrishnan, V. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).
- Sotgia, F., Martinez-Outschoorn, U. E., Howell, A., Pestell, R. G., Pavlides, S., Lisanti, M. P. Caveolin-1 and cancer metabolism in the tumor microenvironment: markers, models, and mechanisms. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 7, 423-467 (2012).
- Škrtić, M., Sriskanthadevan, S., Jhas, B., Gebbia, M., Wang, X., Wang, Z., Lai, C. K. Inhibition of mitochondrial translation as a therapeutic strategy for human acute myeloid leukemia. Cancer cell. 20 (5), 674-688 (2011).
- Boczonadi, V., Horvath, R. Mitochondria: impaired mitochondrial translation in human disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 48, 77-84 (2014).
