Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Hurtig Isolation af Mitoribosome fra HEK celler

Published: October 4, 2018 doi: 10.3791/57877
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Science for Life Laboratory, Department of Biochemistry and Biophysics, Stockholm University

Summary

Mitokondrier har specialiseret ribosomer, der afveg fra deres bakteriel og cytoplasmatisk modstykker. Her viser vi, hvordan mitoribosomes kan fås fra deres indfødte rum i HEK celler. Metoden indebærer isolering af mitokondrier fra suspension celler og deraf følgende rensning af mitoribosomes.

Abstract

De menneskelige mitokondrier besidder en dedikeret sæt af ribosomer (mitoribosomes) at oversætte 13 væsentlige proteinkomponenter af oxidativ fosforylering komplekser kodet af mitokondrie genomet. Da alle proteiner syntetiseret af menneskelige mitoribosomes er integreret Membranproteiner, er menneskets mitoribosomes bundet til den indre membran under oversættelse. I forhold til cytosole ribosomet har mitoribosome en sedimentering koefficient 55S, halv rRNA indhold, ingen 5S rRNA og 36 ekstra proteiner. Derfor en højere protein til RNA ratio og en atypisk struktur gør den menneskelige mitoribosome væsentligt adskiller sig fra dens cytosole modstykke.

Trods den centrale betydning af mitoribosome til livet var ingen protokoller til rådighed til at rense det intakte kompleks fra menneskelige cellelinjer. Traditionelt, mitoribosomes blev isoleret fra mitokondrier-rige dyrevæv, der kræves kg for at starte materiale. Vi begrundet at mitokondrier i dividere HEK293-afledte menneskelige celler dyrkes i næringsrige udtryk medium ville have en aktiv mitokondrie oversættelse, og derfor kunne være en passende kilde til materiale til de strukturelle og biokemiske studier af mitoribosome. For at undersøge dens struktur, udviklede vi en protokol til storstilet oprensning af intakte mitoribosomes fra HEK celler. Heri, introducere vi kvælstof kavitation metode som en hurtigere, mindre arbejdskrævende og mere effektivt alternativ til traditionelle mekaniske shear-baserede metoder til celle lysering. Dette resulterede i forberedelserne af den mitoribosome, der er tilladt for sin Strukturbestemmelse til høj opløsning, afslørende sammensætning af den intakte human mitoribosome og dens forsamling mellemprodukter. Her, vi følger på arbejdet og fremlægge en optimeret og mere omkostningseffektiv metode kræver kun ~ 1010 kulturperler HEK celler. Metoden kan anvendes til at rense menneskers mitoribosomal oversætte komplekser, mutanter, kvalitetskontrol forsamlinger og mitoribosomal subunits mellemprodukter. Rensning kan være lineært skaleres op tifold hvis nødvendigt, og også anvendes på andre typer af celler.

Introduction

Proces af mitokondrie proteinsyntesen er baseret på 13 væsentlige mt-mRNAs, der er oversat af en specialiseret membran-knyttet mitoribosome til at danne den katalytiske kerne af respiratorisk kæden. De ændrede mitokondrie genomer og behovet for proteiner til at indsætte co-translationally i membranen har væsentligt formet arkitektur af mitokondrie ribosomer1. Seneste høj opløsning strukturer af den mammale mitoribosome viste en markant forskellige generelle udseende til bakteriel modstykke2,3. Især, føjes mindst 36 mitokondrier-specifikke proteiner, bidrager ~ 1 MDa ekstra molekylvægt, mens mt-rRNA er reduceret med dobbelt og stærkt afveg. De strukturelle rearrangementer ændre næsten alle kritiske funktionelle egenskaber, der var tidligere almindeligt anerkendt for at være universelt bevaret4.

Nye vigtigste elementer er blevet opkøbt af hver enkelt af mitoribosomal underenheder, for eksempel, den lille underenhed har indarbejdet en iboende GTPase protein mS29 i sin 'hoved' region. GTPase aktivitet er ikke blevet fundet i andre maskinoversættelsessystemer, og strukturen angiver, at GTPase kan have en rolle i subunit forsamling2. 5S rRNA, der mentes at være en milepæl for alle kendte ribosomale store underenheder, danner kernen i den central forhøjning, der mangler i den mammale mitoribosome og har vedtaget mt-tRNA-Val som en integrerende byggesten i stedet2. Forbud og kolleger viste, at de svin mitoribosome har mt-tRNA-Phe og ikke-Val5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk og kolleger fulgte op på disse data og fandt, at mitoribosomes fra patienter med kompromitteret mt-tRNA-Val stabilitet kan principielt rumme mt-tRNA-Phe6,7. Hvorfor mitoribosomes har indarbejdet disse specifikke elementer og hvad veje og trans-faktorer er nødvendige for disse unikke forsamlinger forbliver ukendt.

Samlet set høj kompleksitet af den menneskelige mitoribosome, nye proteinkomponenter og den unikke sammenslutning af mt-tRNA som et strukturelt element indebærer inddragelse af som-endnu-ukendt mitokondrier-specifikke trans -faktorer. Men fordi mange af træk ved dette system er unikke til mitokondrier, som traditionelt har været vanskeligt at undersøge8, lidt er kendt om den molekylære og kvalitetskontrol mekanisme. Med udviklingen af høj opløsning enkelt partikel analyse af elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM)20opstå muligheder nu til omfattende studier i de molekylære mekanismer bag forsamling, handling og kontrol med kvaliteten af menneskelige mitoribosome. Vores betænkning af første strukturen af den menneskelige mitoribosome forsamling mellemliggende giver den erkendelse, at det er muligt at visualisere, hvordan den menneskelige mitoribosome er dannet og viser denne cryo-EM er medvirkende til identifikation af nye trans- konstitueret forsamling faktorer9.

For at udvide på dette første forsøg, beskriver vi en hurtig protokollen for human mitoribosome rensning i detaljer. I den første del af protokollen, er en storstilet dyrkning af meget ren intakt mitokondrier fra suspension celler beskrevet. Denne procedure kan kræver 9 h og nemt ændres og tilpasses forskellige celletyper og skalaer. Et vigtigt skridt i denne protokol er brugen af kvælstof kavitation at bryde åbne cellerne. Den anden del af protokollen blev udviklet til at rense mitoribosomes. Denne procedure kræver 7 h og giver en tilstrækkelig mængde af mitoribosomes til biokemiske og strukturelle studier. Brug af ren mitokondrier som råvare tilbyder høj kvalitet sidste forberedelser og kan ekstrapoleres til andre mitokondrie makromolekyler.

Protocol

Alle pattedyr celle kultur arbejde skal udføres i en biologisk sikkerhed kabinet. Bruge sterilt udstyr hvis kontakt med cellerne. Bære nitrilhandsker og en lab coat og følge god vævskultur praksis.

1. cellekultur

  1. Opretholde HEK293S suspension celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% tetracyklin-free fetal bovint serum (FBS), 5 μg/mL blasticidin og 200 μg/mL Azithromycin, ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Skalere op til 9 x T175 kolber. På 90% confluency, høst celler og dreje dem ned på 500 x g i 5 min. Resuspend pelleted cellerne i Freestyl suppleret med 5% tetracyklin-fri FBS. Tælle celler ved hjælp af en automatiseret celle counter og justere celle koncentration til 1.5 x 106 celler/mL i en udluftet ryste kolben.
    Bemærk: Dette svarer typisk til en start volumen på 300 mL i en 1000 mL udluftet kolbe.
  3. Inkuber celler i en rystende inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 på 120 rpm (50 mm ryster diameter).
  4. Efter 2 dage tælle cellerne og fortsætte med at opdele celler hvis den celle tæthed er over 3,0 x 106 celler/mL. Opdel celler ved at dreje ned 2 x 150 mL cellekultur i 2 x 250 mL konisk flasker på 500 g i 5 min. Resuspend celler i 2 x 10 mL frisk medier og overføre til en 2 x 1, 000 mL ventilerede beholdere indeholdende den passende mængde for en afsluttende celle tæthed af 1.5 x 106 celler/mL, fx 2 x 300 mL fra en start celle tæthed af 3.0 x 106 celler/mL.
  5. Inkuber celler i en rystende inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 på 120 rpm (50 mm ryster diameter).
  6. Efter to dage tælle cellerne og fortsætte med at opdele celler hvis den celle tæthed er over 3,0 x 106 celler/mL. Opdel celler ved spinning ned 4 x 150 mL cellekultur i 4 x 250 mL konisk flasker på 500 g i 5 min. Resuspend celler i 2 x 10 mL frisk medier og overføre til 2 x 2.000 mL udluftet kolbe indeholdende den passende mængde for en afsluttende celle tæthed på 1,5 x 106 celler/mL, fx 2 x 700 mL fra en start celle tæthed af 3.0 x 106 celler/mL.
  7. Inkuber celler i en rystende inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 på 120 rpm (50 mm ryster diameter).
  8. Efter to dage tælle cellerne og fortsætte med at opdele celler hvis den celle tæthed er over 3,0 x 106 celler/mL. Opdel celler ved at hælde 2 x 700 mL udluftes cellekultur ind 2 x 2800 mL kolber og topping med 2 x 300 mL frisk medier til at nå til et volumen på 2 x 1 L.
  9. Inkuber celler i en rystende inkubator ved 37° C og 5% CO2 på 120 rpm (50 mm ryster diameter).
  10. Efter 24 h tælle cellerne og høste cellerne hvis den celle tæthed er mellem 3,0-4,0 x 106 celler/mL.

2. mitokondrier Isolation

  1. Buffere kræves
    Bemærk: Mængderne, der er givet til en forberedelse fra 2 L celler. Forbered de følgende stamopløsninger forud for tid til mitokondrie isolation buffer (MIB), saccharose/mannitol buffer (SM4), eksperimentelle buffer (MIBSM), ophvirvling buffer (SEM).
    1. Gøre 0,5 L MIB buffer: 50mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, proteasehæmmere.
    2. Gøre 100 mL SM4 buffer: 280 mM saccharose, 840 mM mannitol, 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 m M DTT, proteasehæmmere.
    3. Gøre 160 mL MIBSM buffer: 120 mL MIB buffer + 40 mL SM4 buffer.
    4. Gemme 200 mL PBS ved 4 ° C.
    5. Gøre 5 mL SEM buffer: 250 mM saccharose, 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 mM EDTA.
    6. Gøre 4 x 10 mL stamopløsninger for trinvis saccharose forløb indeholdende 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 mM EDTA og 60% / 32% /23% og 15% saccharose, henholdsvis.
  2. Mitokondrier isolation
    Bemærk: Det er vigtigt at arbejde hurtigt og holde alt på isen under hele proceduren.
  3. Precool kvælstof kavitation kammer forudgående at bruge.
    1. Høste 2 x 1 L celler (3-4 x 109 celler pr. centrifugeglasset) ved centrifugering ved 1.000 x g i 7 min, 4 ° C.
    2. Dekanteres omhyggeligt og resuspend pelleted celler hurtigt i 2 x 100 mL PBS. Pool cellerne.
    3. Centrifugeres de resuspenderede celler på 1.200 x g i 10 min., 4 ° C.
    4. Dekanteres omhyggeligt og vejer pellet (~ 20 g).
    5. Resuspenderes i 120 mL MIB buffer.
    6. Tillad celler til at svulme af forsigtigt omrøring i et koldt rum i 10 min.
    7. Placer kvælstof kavitation kammer på isen og overføre de svulmede celler til kvælstof kavitation kammer. Tilføje 45 mL SM4 buffer (1/3 af den endelige mængden af resuspenderede celler, omkring 140 mL, hvilket giver en endelig koncentration på 70 mM saccharose og 210 mM mannitol).
    8. Fastgør kvælstof kavitation kammer og fyldes med kvælstof, indtil trykket når 500 psi. Lukke haner og holde isoleret på isen i 20 min.
    9. Langsomt trykket i kvælstof kavitation kammer og indsamle de lysate (ca. 185 mL).
    10. Centrifugeres det lysed materiale for at fjerne celle debris og kerner på 800 x g i 15 min., 4 ° C.
    11. Indsamle supernatanten ved at hælde det gennem ostelærred i et bægerglas, opbevares på is. Smid ikke pelleten.
    12. Resuspenderes i 90 mL MIBSM buffer (1/2 den forrige bind). Der homogeniseres ved hjælp af Teflon/glas Dounce homogeniseringsapparat og gentage centrifugering ved 800 x g i 15 min., 4 ° C.
    13. Indsamle supernatanten ved at hælde det gennem ostelærred i et bægerglas, opbevares på is. Kombiner denne supernatanten med supernatanten fra trin 2.2.11.
    14. Centrifugeres de kombinerede analysere på 1.000 x g i 15 min., 4 ° C.
    15. Indsamle supernatanten ved at hælde det gennem ostelærred i et bægerglas, opbevares på is.
    16. Kassér pelleten og centrifugeres supernatanten indeholdende rå mitokondrier på 10.000 x g i 15 min., 4 ° C.
      Bemærk: Pellet vil typisk bestå af to dele: løs og stram.
    17. Forsigtigt vaske ud den løs pellet uden at forstyrre den stramme del. Stram resuspenderes i 10 mL MIBSM buffer.
    18. Udføre en protein koncentration analyse ved hjælp af en kommerciel Protein Assay Kit eller lignende metode. Typiske koncentration udbytter fra 2 L starter kultur er ~ 2 mg/mL.
    19. Tilføje 200 enheder af RNase gratis DNase og forlade for at rotere på en valse i kølerum i 20 min. jævnt blandes DNase for fjernelse af genomisk DNA.
    20. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 15 min., 4 ° C og resuspenderes i 2 mL SEM buffer. Omrystes forsigtigt ved hjælp af en lille Teflon/glas Dounce homogeniseringsapparat til resuspend enhver resterende aggregater. Udføre ikke mere end fem up-and-down passerer for at undgå brud. Holde på is.
    21. Forbered saccharose gradient i 14 mL SW40 rør ved omhyggeligt pipettering 1,5 mL 60% saccharose stock buffer ind i bunden af røret. Forsigtigt tilføje 4,5 mL af 32% saccharose stock buffer på toppen af 60% band uden at forstyrre det. Gentag med 1,5 mL 23% saccharose stock buffer og igen med 1,5 mL 15% saccharose stock buffer.
    22. Læg de hele mitokondrie suspension (ca. 3 mL) på toppen af saccharose gradient.
    23. Der centrifugeres i SW40 rotor på 139, 065 x g i 60 min.
    24. Omhyggeligt indsamle brun bandet overflytning til grænsefladen for 32% og 60% saccharose ved hjælp af en overførsel pipette, typisk 2-3 mL.
    25. Snap-freeze renset mitokondrier i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C.

3. Mitoribosome forberedelse

  1. Buffere kræves
    Bemærk: Forbered de følgende stamopløsninger før tid for lysisbuffer, saccharose pude/gradient og resuspension buffer.
    1. Gøre 10 mL lysisbuffer: 25 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM KCl, 50mM MgOAc, 2% polyethylen glycol octylphenyl ether, 2 mM DTT, proteasehæmmere.
    2. Gøre 10 mL saccharose pude buffer: 1 M saccharose (34% w/v), 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM KCl, 20 mM MgOAc, 1% polyethylen glycol octylphenyl ether, 2 mM DTT.
    3. Gøre 5 mL resuspension buffer: 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM KCl, 20mM MgOAc, 2 mM DTT
    4. Gøre 15-30% lineær saccharose forløb med resuspension buffer i TLS-55 polycarbonat rør.
  2. Mitoribosome rensning
    1. Optø frosne mitokondrierne på is.
    2. Tilføj 2 bind af lysisbuffer,fx tilføje 6 mL lysisbuffer til 3 mL mitokondrier. Bland straks ved at vende røret flere gange.
    3. Omrystes med en lille Teflon/glas dounce homogeniseringsapparat til at bistå lysis og Inkuber i 5-10 min på is til at fuldføre lysering.
    4. Centrifugeres det lysed materiale (ca. 9 mL) ved 30.000 x g i 20 min., 4 ° C for at fjerne de uopløselige materiale. Dekanteres forsigtigt fra bundfaldet og kassér pelleten.
    5. Gentag centrifugering ved 30.000 x g i 20 min. ved 4 ° C for afklaring af supernatanten. Dekanteres forsigtigt fra bundfaldet og kassér pelleten.
    6. Forberede saccharose pude i TLA 120.2 rør (Ultraklart): 0,4 mL saccharose pude pr tube. Forberede en tube pr. mL af mængden materiale.
    7. Lag mængden mitokondrier på saccharose puder: ca 1 mL pr tube, hvilket resulterer i en lysate: pude forholdet mellem 2.5: 1.
    8. Der centrifugeres prøve på 231, 550 x g i 45 min. i TLA120.2 rotor ved 4 ° C.
    9. Supernatanten og skyl rør sekventielt med 100 µl af resuspension buffer til at fjerne resterende saccharose.
    10. Resuspend pellets i alt 100 µl resuspension buffer.
    11. Vortex på langsom hastighed til 30 s til at opløse de resterende aggregater og centrifugeres ved 17,949 x g i 10 min. i microtube centrifugeres ved 4 ° C.
    12. Omhyggeligt indsamle supernatanten og gentage centrifugeringen.
    13. Måle mitoribosome absorption ved A260.
      Bemærk: Den typiske udbytte er 7 A260, med A260: A280 forholdet mellem 1.3.
    14. Indlæse hele prøven på en enkelt lineær saccharose gradient rør. Der centrifugeres i TLS-55 rotor på 213, 626 x g for 120 min. ved 4 ° C.
    15. Fractionate gradient, bestemme den optisk tæthed på A260 og pool brøkdel svarende til nukleinsyre peak sammen.
      Bemærk: Den typiske A260: A280 forholdet mellem spidsværdien er > 1,6.
    16. Udveksle bufferen, eventuelt ved hjælp af en metode til valg. Beregne den endelige koncentration ved hjælp af konvertering 1 A260 = 0,1 mg/mL.
    17. Snap fryse renset mitoribosome eksempel resuspension buffer og opbevares ved-80 ° C.

Representative Results

Dividere og stærkt levedygtige celler er et afgørende udgangspunkt for rensning af aktive mitoribosomes. Denne protokol finder anvendelse på enhver HEK293 suspension celler. Vi bruger in-house cellelinie T501, som er stabilt at udtrykke en transporter under tetracyklin-inducerbar kontrol. Parental cellelinie er HEK293S-GnTI- celler (Table of Materials)10. I løbet af cellevækst og ekspansion i FreeStyle 293 udtryk Medium den minimale tæthed bør holdes på 1,5 x 106 celler/mL, for at sikre en fordobling på hver to dage, mens maksimale celle tæthed bør ikke overstige ~ 5 x 106 celle / mL. efter at have nået en celle tæthed over 3 x 106 celler/mL er cellerne pelleted og genopslemmes i en frisk, forvarmet medier i en udvidet volumen at opnå minimum celle tætheden af 1.5 x 106 celler/mL. Denne opdeling er udført flere gange hver 2-3 dage indtil en ønskede cellemasse for proceduren, der er opnået. Den sidste celle tæthed kan variere i rækken af 3-4,5 x 106 celler/mL, og mindst 2 L er påkrævet som udgangspunkt til isolering af mitokondrier. Cellernes levedygtighed bør opretholdes generelt > 90%, og for den endelige kultur, der er høstet > 95%. Behandling af den storstilede cellekultur med antibiotika frarådes.

Efter serien af differentieret centrifugations, omfanget af de mitokondrielle suspension efter trin 2.2.20 er typisk i rækken af 3-5 mL. Mitokondrier er derefter adskilles på saccharose gradient (figur 1) fra andre organeller. Trinvis saccharose gradient er udarbejdet således, at mængden af gradient og mængden af mitokondrie suspensionen sammen fylde centrifugering tube til sin maksimal volumen. Her særlig pleje er nødvendig for at indsamle brun bandet overflytning til 60% / 32% interface med minimal forurening fra de omkringliggende buffer. Dette er vigtigt for at holde konstant protein: vaskemiddel forholdet i de følgende trin i mitokondrierne oploesning. Det anbefales at vurdere den mitokondrielle proteinkoncentration på dette stadium, og et typisk udbytte på 15-20 mg samlede mitokondrie protein forventes fra ~ 1010 kulturperler HEK celler.

Efter vellykket mitokondrier isolation, de er mængden ved tilsætning af octylphenyl polyethylen glykolæter og mitoribosomes udskilles gennem en saccharose pude (figur 2). For at adskille mitoribosomes fra den hydrofobe hindeagtige stof, pellets er genopslemmes i bufferen ikke indeholder rengøringsmiddel, og hydrofobe komplekser er pelleted ved centrifugering. Denne procedure gentages, og rensning graden af mitoribosomes er kvantificeret ved A260/A280 ratio, som forventes at blive ~ 1.3. Typisk udbytte er 7 A260 fra en 2 L starter kultur. Denne mitoribosomal fraktion indeholder også ekstra store opløselige mitokondrie komplekser, såsom pyruvat dehydrogenase og glutamat dehydrogenase. For at adskille mitoribosomes fra de opløselige mitokondrie komplekser, anvendes supernatant til en saccharose tæthed farveforløb. Fraktioner der indeholder mitoribosome er generelt placeret nederst tredje af røret. Fraktionering af saccharose gradient kan derefter ske, enten med en automatiseret stempel eller manuelt ved omhyggeligt at tage 50 µL fraktioner med en pipette eller stansning rør bunden med en 21 G kanyle og indsamle dråberne.

To store mitoribosomal befolkninger er identificeret i farveforløbets: monosome 55 år og store subunit 39S, som illustreret i figur 3 og figur 4. Tilstedeværelsen af store subunit brøkdel tyder på, at cellerne er høstet i en højaktiv dividere stat11. Forholdet mellem monosome og store subunit toppe kan ændre. En ekstra top ligger tættere til bunden kan vises i præparater med kontaminerende cytoplasmatisk ribosomer 80S. Venligst Bemærk at den lille saccharose forløb ved hjælp af svingende spand rotor TLS-55 giver mulighed for hurtig rensning af ~ 1 mL af mitoribosomes med en optisk tæthed på 0,4-1 en260. Adskillelse af monosome og store subunit toppe kan variere lidt afhængigt af fraktionering, men der er som regel nogle overlapning mellem de to toppe. Derfor, hvilke fraktioner til at indsamle, og pool bør tages i betragtning for at sikre den højeste andel af monosome, eller alternativt store subunit, i prøven. For høj opløsning cryo-EM undersøgelser er adskillelse mellem de to mitoribosomal populationer ikke absolut nødvendige (på grund af yderligere i siliciummangan operationer). Men hvis bedre adskillelse er nødvendig, det anbefales at bruge større rør og tilsvarende kører gange.

Figure 1
Figur 1 : Oprensning af mitokondrier på en saccharose gradient. Subcellulært organeller fra en 2 L starter kultur var fraktioneret gennem en række differentierede centrifugations som beskrevet i protokollen, og mitokondrier var adskilt på en diskontinuert saccharose gradient. Renset mitokondrier er fundet i de lavere bånd på grænsefladen 32% / 60%.

Figure 2
Figur 2 : Oprensning af mitoribosomes på en saccharose pude. Rå mitoribosomes fra en 2 L begyndende kultur er aflejret gennem 1 M saccharose pude. Pellets er genopslemmes i et vaskemiddel-fri buffer, og mitoribosomes er tydeliggjort af to centrifugations, som beskrevet i protokollen. Absorbansen er optaget for at vurdere kvaliteten af forberedelse og typiske A260/A280 forholdet mellem ~1.3 (højre panel) attesterer en mitoribosome rige brøkdel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Fine rensning af mitoribosomes på en saccharose gradient. Absorbansen spor fra en 2 L starter kultur. Fraktioner er nummererede fra toppen til bunden af gradient. To store mitoribosomal befolkninger identificeres: store subunit (peak 1) og monosome 55S (peak 2). Forholdet mellem befolkningerne kan ændre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Elektron Mikrograf, 2D klasser og 3D rekonstruktion. Venstre panel: en Mikrograf med eksemplet fra monosome peak 2 på en kalibreret forstørrelse af 1,23 A / pixel. Midten panel: En repræsentativ post-processing data (2D klasser) afslører intakt monosomes. Højre panel: 3D rekonstruktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Hvad angår kilde for at starte materiale, selv om den relativt let tilgængelighed af animalsk væv, der er kendt for at være en rig kilde af mitochondrier, gør det til et populært valg for mitoribosomes3,5,12, 13, de kan ikke være genetisk modificerede og gengivet i laboratoriet nemt. Der er derfor et klart praktisk behov for at udvikle protokoller der involverer administrationsprocedurerne kulturperler menneskelige cellelinjer. Den store forskel mellem protokollerne, der beskæftiger sig med væv og celler, kulturperler er tilstand af lysis og homogenisering. For kulturperler celler dyrkes som en éncellelag, er en typisk metode Teflon/glas dounce homogenisering14. De oprindelige forberedelse protokoller mens effektiv blev udviklet til små skæl15. En direkte optrapning af ansættelse af en homogeniseringsapparat med kapacitet på 500 mL er muligt11, men det kræver ~ 2 h af manuel arbejdskraft at opnå 80% lysering. Dette indførte mindst tre spørgsmål: sammenlægning af organeller på grund af lange ventetider, ikke-homogene lysis på grund af tungt materiale synker til bunden af et stort skib, opvarmning af prøven på grund af nødvendigheden af flere strøg. Derfor, en bedre metode til lysis udnytter kvælstof kavitation, som er baseret på dekompression fra en trykisoleret fartøj16,17. I denne metode svulmede celler først i det kolde rum for at blødgøre cellerne og gøre dem mere modtagelige for lysering. Da de er placeret i enhedens kvælstof kavitation en buffer, som indeholder saccharose og mannitol er tilføjet for at opretholde en osmotisk tryk, der vil hjælpe med at holde mitokondrier intakt. Kvælstof kavitation enhed er derefter tryk med en stor mængde ilt-frit kvælstof, som opløses i cellerne. Da trykket er frigivet kvælstof bobler ud af løsning medfører brud af cellemembraner. Denne metode giver flere fordele sammenlignet med mekaniske homogenisering metoder der involverer shear understreger og friktion som følger: 1) enhver ekstern fysisk stress på cellerne undgås; 2) en adiabatisk ekspansion, der køler prøven sikrer ingen varmeskader organeller; 3) celle komponenter er beskyttet mod oxidation af inert nitrogen gas; 4) uden pH forandring af det suspending medium; 5) processen er ensartet og reproducerbar fordi de samme forstyrrende kræfter er anvendt inden for hver celle og hele prøven; 6) processen er hurtig og kan afsluttes inden for 20-30 min.

Isolering af mitokondrier fra dyrkede celler og væv er blevet beskrevet i litteraturen flittigt, og det er baseret på en blid celle afbrydelse efterfulgt af en serie af differentiale centrifugations. De fleste af de aktuelt anvendte protokoller fremgangsmà ¥ den oprindelige udviklet i midten af forrige århundrede18. Mens de grundlæggende biokemiske metoder er korrekte, er der flere misforståelser, der er fremhævet i litteraturen og forblev uopdaget. For at optimere protokol for mitoribosomes, vi systematisk undersøgt de rapporterede generelle principper og konkludere, at: 1) optagelse af Mg2 + og K+ i bufferen er ikke afgørende. Det er blevet hævdet, at KCl hjælper med at forhindre cytoplasmatisk proteiner fra danner en gel19, dog forudsat en tilstrækkelig fortynding som beskrevet i vores protokol, dette fænomen forekommer ikke. Derudover er udelukkelse af Mg2 + nyttigt at reducere forureninger af cytoplasmatisk ribosomer20; 2) der er ingen grund til at holde forholdet mellem maksimal mulige mængde af celler til medium til at beskytte de frigivne organeller fra hypo-osmotisk miljø. Den osmotiske støtte i vores protokol tilstrækkeligt fra saccharose-holdige buffere og fortynding af celler med mitokondrier isolation buffer (trin 2.II.5) er afgørende for en effektiv adskillelse af organeller i en storstilet forberedelse.

PH af mitokondrier isolation buffer er tæt på fysiologiske værdier, dvs 7.5, som også er den optimale pH for den følgende mitoribosome forberedelse. Bindemidler EDTA og EGTA er tilføjet isolation medier til Chelat kontaminerende ioner, og de Chelat gratis magnesium og calcium, henholdsvis. Det har været drøftet, at medtagelsen af EDTA kan føre til beskadigelse af den indre mitokondrielle membran14, koncentrationen er derfor begrænset til 1 mM som en sikkerhedsforanstaltning. Vi har ikke observeret nogen forskel, når du bruger 5 mM EDTA taktfast endelige rensning af saccharose tæthed farveforløb.

Protokollen beskrevet bruger heri HEK293S-afledte menneskelige celler til rensning af mitoribosome. Kvaliteten af forberedelsen tillader opnåede prøven undersøges biokemisk og strukturelt at atomic opløsning. Dette gør det muligt at anvende metoden til menneskelige mitoribosomal oversætte komplekser, kvalitetskontrol forsamlinger og mitoribosomal subunits mellemprodukter. Desuden, da kræftceller har forstærket OXPHOS kapacitet og forhøjede mitokondrie protein oversættelse sammenlignet med tilstødende stromale væv21, mitoribosomes er etableret drug mål for kræft22. Derfor vil bruger denne protokol til specifikke rensning af mitoribosomes i tilstedeværelse af hæmmere have medicinske anvendelser. Også, mitoribosomal mutationer har været forbundet med arvelig Mitokondrie sygdomme23. Da disse mutationer har direkte indvirkning på strukturen, vil tilgang præsenteres her være nyttige for deres strukturelle karakterisering. Protokollen kan eksperimentelt udvides og anvendes til en række videnskabelige spørgsmål at løse den grundlæggende forståelse af oversættelse i menneskelige mitokondrier og dens medicinske betydning.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af det svenske Institut for strategisk forskning (fremtidens ledere Grant FFL15:0325), Ragnar Söderberg Foundation (stipendium i medicin M44/16), svenske Forskningsråd (Start Grant NT × 2015-04107), FEBS langsigtede Fellowship (SA) , H2020-MSCA-ITN-2016 projekt 721757 (VS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate Thermo Scientific 31966-021
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific 16000-044
Blasticidin S HCl Thermo Scientific R210-01
Zeocin selection reagent Thermo Scientific R25001 100 mg/ml
Freestyle 293 Expression medium Thermo Scientific 12338026
T175 tissue culture flask with vented cap Sarstedt 83.3912.002
Shaker flasks with vented cap Thermo Scientific 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800
250 ml conical bottle tubes, sterile Corning 430776
Eve automated cell counter NanoEnTek E1000
Nitrogen cavitation cell disruption vessel Parr Instruments 4635, 4639 safety volume: 40ml, 600ml respectively
Dnase (RNA-free) HT Biotechnology N401a
Teflon/glass dounce homogenizers Cambridge Glassblowing Limited Size designed upon request
SW40 tubes for mitochondria gradient Beckman 344060 Polypropylene, thin wall
Transfer pipettes Sarstedt 86.1171
TLA 120.2 tubes for cushion Beckman 343778 Polycarbonate, thick wall
TLS-55 tubes for gradient Beckman 347356 Ultra-clear
Gradient Station IP BioComp 153-002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ott, M., Amunts, A., Brown, A. Organization and regulation of mitochondrial protein synthesis. Annual review of biochemistry. 85, 77-101 (2016).
  2. Amunts, A., Brown, A., Toots, J., Scheres, S. H., Ramakrishnan, V. The structure of the human mitochondrial ribosome. Science. 348 (6230), 95-98 (2015).
  3. Greber, B. J., Bieri, P., Leibundgut, M., Leitner, A., Aebersold, R., Boehringer, D., Ban, N. The complete structure of the 55S mammalian mitochondrial ribosome. Science. 348 (6232), 303-308 (2015).
  4. Greber, B. J., Ban, N. Structure and function of the mitochondrial ribosome. Annual review of biochemistry. 85, 103-132 (2016).
  5. Greber, B. J., Boehringer, D., Leitner, A., Bieri, P., Voigts-Hoffmann, F., Erzberger, J. P., Ban, N. Architecture of the large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome. Nature. 505 (7484), 515-519 (2014).
  6. Rorbach, J., Gao, F., Powell, C. A., D'Souza, A., Lightowlers, R. N., Minczuk, M., Chrzanowska-Lightowlers, Z. M. Human mitochondrial ribosomes can switch their structural RNA composition. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201609338 (2016).
  7. Chrzanowska-Lightowlers, Z., Rorbach, J., Minczuk, M. Human mitochondrial ribosomes can switch structural tRNAs-but when and why? RNA biology. 14 (12), 1668-1671 (2017).
  8. Gammage, P. A., Moraes, C. T., Minczuk, M. Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized. Trends in Genetics. , (2017).
  9. Brown, A., Rathore, S., Kimanius, D., Aibara, S., Bai, X. C., Rorbach, J., Ramakrishnan, V. Structures of the human mitochondrial ribosome in native states of assembly. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 866 (2017).
  10. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogenous N-glycosylation by tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 99, 13419-13424 (2002).
  11. Brown, A., Amunts, A., Bai, X. C., Sugimoto, Y., Edwards, P. C., Murshudov, G., Ramakrishnan, V. Structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria. Science. 346 (6210), 718-722 (2014).
  12. O'Brien, T. W., Kalf, G. F. Ribosomes from rat liver mitochondria I. Isolation procedure and contamination studies. Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2172-2179 (1967).
  13. Spremulli, L. L. Large-scale isolation of mitochondrial ribosomes from mammalian tissues. Mitochondria: Practical Protocols. , 265-275 (2007).
  14. Rice, J. E., Lindsay, J. G. Subcellular fractionation of mitochondria. Subcellular Fractionation: A Practical Approach. Grahamand, J. M., Rickwood, D. , IRL Press. Oxford. 107-142 (1997).
  15. Attardi, G., Ching, E. Biogenesis of mitochondrial proteins in HeLa cells. Methods in enzymology. 56, 66-79 (1979).
  16. Gottlieb, R. A., Adachi, S. Nitrogen cavitation for cell disruption to obtain mitochondria from cultured cells. Methods in enzymology. 322, 213-221 (2000).
  17. Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), (2010).
  18. Kennedy, E. P., Lehninger, A. L. Oxidation of fatty acids and tricarboxylic acid cycle intermediates by isolated rat liver mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 179 (2), 957-972 (1949).
  19. Graham, J. M. Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3, Unit 3.3, (2001).
  20. Amunts, A., Brown, A., Bai, X. C., Llácer, J. L., Hussain, T., Emsley, P., Ramakrishnan, V. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).
  21. Sotgia, F., Martinez-Outschoorn, U. E., Howell, A., Pestell, R. G., Pavlides, S., Lisanti, M. P. Caveolin-1 and cancer metabolism in the tumor microenvironment: markers, models, and mechanisms. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 7, 423-467 (2012).
  22. Škrtić, M., Sriskanthadevan, S., Jhas, B., Gebbia, M., Wang, X., Wang, Z., Lai, C. K. Inhibition of mitochondrial translation as a therapeutic strategy for human acute myeloid leukemia. Cancer cell. 20 (5), 674-688 (2011).
  23. Boczonadi, V., Horvath, R. Mitochondria: impaired mitochondrial translation in human disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 48, 77-84 (2014).

Tags

Biokemi spørgsmål 140 mitokondrier oversættelse ribosomet cryo-EM proteinsyntese biokemi
Hurtig Isolation af Mitoribosome fra HEK celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aibara, S., Andréll, J., Singh, … More

Aibara, S., Andréll, J., Singh, V., Amunts, A. Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells. J. Vis. Exp. (140), e57877, doi:10.3791/57877 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter