Summary
Mitochondriën zijn ribosomen die afweek van hun tegenhangers bacteriële en cytoplasmatische gespecialiseerd. Hier laten we zien hoe de mitoribosomes van hun inheemse compartiment in HEK cellen kan worden verkregen. Bij deze methode wordt isolatie van mitochondriën uit schorsing cellen en daaruit voortvloeiende zuivering van mitoribosomes.
Abstract
De menselijke mitochondriën bezitten een specifieke set van ribosomen (mitoribosomes), die 13 essentiële proteïne componenten van de complexen van de oxidatieve fosforylatie gecodeerd door het mitochondriaal genoom te vertalen. Aangezien alle eiwitten gesynthetiseerd door menselijke mitoribosomes integraal membraaneiwitten, zijn menselijke mitoribosomes vastgebonden aan de mitochondriale binnenste membraan tijdens de vertaling. Vergeleken met het cytosolische ribosoom heeft de mitoribosome een coëfficiënt van sedimentatie van 55-plussers, halve de rRNA inhoud, geen 5S rRNA en 36 extra eiwitten. Zorg daarom voor een hogere eiwit-naar-RNA-ratio en een atypische structuur de menselijke mitoribosome aanzienlijk verschillend van zijn cytosolische tegenhanger.
Ondanks het cruciale belang van de mitoribosome tot leven waren geen protocollen beschikbaar voor het zuiveren van het intact complex van menselijke cellijnen. Traditioneel mitoribosomes werden geïsoleerd uit de mitochondriën-rijke dierlijke weefsels die kilogram vereist van de grondstof. We gemotiveerd dat mitochondriën in het verdelen van de HEK293-afgeleide menselijke cellen gekweekt in voedselrijke expressie medium zou een actieve mitochondriale vertaling, en daarom zou een geschikte bron van materiaal voor de structurele en biochemische studies van de mitoribosome. Om te onderzoeken zijn structuur, ontwikkelden we een protocol voor grootschalige reiniging van intacte mitoribosomes van HEK cellen. Hierin voeren wij stikstof cavitatie methode als een snellere, minder arbeidsintensief en efficiënter alternatief voor traditionele mechanische schuintrekken gebaseerde methoden voor lysis van de cel. Dit resulteerde in de voorbereidingen van het mitoribosome dat is toegestaan voor structurele vastbesloten te zijn op hoge resolutie, waaruit de samenstelling van de intact menselijke mitoribosome en haar vergadering tussenproducten. Hier, we follow-up van deze werkzaamheden en presenteren een geoptimaliseerde en meer kosteneffectieve methode waarbij alleen ~ 1010 gekweekte cellen van het HEK. De methode kan worden gebruikt voor het zuiveren van menselijke mitoribosomal vertalen complexen, mutanten, kwaliteitscontrole assemblages en mitoribosomal subeenheden tussenproducten. De zuivering kan worden lineair opgeschaald vertienvoudigd als nodig, en ook op andere typen cellen toegepast.
Introduction
Het proces van mitochondriale eiwitsynthese is gebaseerd op 13 essentiële mt-mRNAs die zijn vertaald door een gespecialiseerde membraan-ingeschreven mitoribosome om te vormen van de katalytische kern van de respiratoire keten. Het gewijzigde mitochondriaal genoom en de noodzaak voor de eiwitten in het membraan co-translationally invoegen hebben aanzienlijk de architectuur van de mitochondriale ribosomen1gevormd. Recente hoge resolutie structuren van de zoogdieren mitoribosome toonde een opvallend verschillende uiterlijk naar de bacteriële tegenhanger2,3. In het bijzonder worden ten minste 36 mitochondriën-specifieke eiwitten toegevoegd, bij te dragen ~ 1 MDa extra moleculaire massa, terwijl mt-rRNA is verminderd door tweeledig en sterk afweek. De structurele herschikkingen veranderen bijna alle kritische functies die eerder in het algemeen aanvaard om universeel geconserveerd4.
Nieuwe hoofdelementen zijn verkregen door elk van de subeenheden van mitoribosomal, bijvoorbeeld, de kleine subeenheid een intrinsieke GTPase eiwit mS29 heeft opgenomen in haar regio 'hoofd'. GTPase activiteit is niet gevonden in andere vertaalsystemen en de structuur geeft aan dat de GTPase een rol in de subeenheid vergadering2 wellicht. De 5S rRNA die werd verondersteld te zijn een bezienswaardigheid van alle bekende ribosomal grote subeenheden, vormen de kern van de centrale uitsteeksel, ontbreekt in de zoogdieren mitoribosome en heeft aangenomen mt-tRNA-Val als een integraal bouwsteen in plaats daarvan2. Verbod en collega's toonde aan dat de varkens mitoribosome mt-tRNA-Phe heeft en niet-Val5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk en collega's over deze gegevens opgevolgd en gevonden dat mitoribosomes van patiënten met gecompromitteerde mt-tRNA-Val stabiliteit is in principe geschikt voor mt-tRNA-Phe6,7. Waarom de mitoribosomes hebben opgenomen deze specifieke elementen en welke trajecten en trans-factoren zijn vereist voor deze unieke assemblages onbekend blijven.
Over het geheel genomen de hoge complexiteit van de menselijke mitoribosome, nieuwe proteïne componenten en de unieke vereniging van de mt-tRNA als een constructiedeel impliceert de betrokkenheid van als-nog-unknown mitochondriën-specifieke trans -factoren. Echter, omdat veel van de functies van dit systeem uniek voor de mitochondriën, die van oudsher moeilijk zijn te onderzoeken8, is weinig bekend over de moleculaire en kwaliteitscontrole mechanisme. Met de ontwikkeling van hoge-resolutie één deeltje analyse door elektron cryo-microscopie (cryo-EM)20, nu ontstaan kansen om te uitvoerig bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de vergadering, de actie en de kwaliteitscontrole van de mens mitoribosome. Ons verslag van de eerste structuur van de menselijke mitoribosome vergadering tussenliggende biedt de erkenning dat het mogelijk is om te visualiseren hoe de menselijke mitoribosome wordt gevormd en toont dat cryo-EM is behulpzaam bij de identificatie van nieuwe trans- waarnemend vergadering factoren9.
Uit te breiden op deze eerste poging, beschrijven we een snelle protocol voor de zuivering van het menselijke mitoribosome in detail. In het eerste deel van het protocol, wordt een grootschalige isolatie zeer zuivere intacte mitochondria uit schorsing cellen beschreven. Deze procedure kan vereist 9u en gemakkelijk gewijzigd en aangepast aan de verschillende soorten cellen en schalen. Een belangrijke stap in dit protocol is het gebruik van stikstof cavitatie open te breken de cellen. Het tweede deel van het protocol werd ontwikkeld om te zuiveren van mitoribosomes. Deze procedure vereist 7 h en levert van een voldoende hoeveelheid mitoribosomes voor biochemische en structurele studies. Gebruik van zuivere mitochondriën en een grondstof biedt kwalitatief hoogwaardige laatste voorbereidingen kan worden geëxtrapoleerd naar andere mitochondriale macromoleculen.
Protocol
Alle zoogdiercellen cultuur werkzaamheden moet worden uitgevoerd binnen een biologische veiligheidskast. Het gebruik van steriel injectiemateriaal als contact met cellen. Nitril handschoenen en een laboratoriumjas dragen en volg goede weefselkweek praktijk.
1. de celkweek
- HEK293S ophanging cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% tetracycline-vrije foetale runderserum (FBS), 5 μg/mL blasticidin en 200 μg/mL azithromycine, bij 37 ° C en 5% CO2handhaven.
- Schalen tot 9 x T175 kolven. Bij 90% confluentie, oogst cellen en draai ze naar beneden bij 500 x g gedurende 5 min. resuspendeer de Ingehuld cellen in Freestyl aangevuld met 5% FBS tetracycline-vrij. Cellen met behulp van een geautomatiseerde cel counter tellen en cel concentratie aan 1.5 x 106 cellen/mL in een geventileerde schudden kolf aan te passen.
Opmerking: Dit komt meestal overeen met een startende volume van 300 mL in een geventileerde maatkolf van 1000 mL. - Incubeer de cellen in een schudden incubator bij 37 ° C en 5% CO2 op 120 toeren per minuut (schudden diameter 50 mm).
- Na 2 dagen de cellen tellen en overgaan tot de cellen splitsen als de celdichtheid 3.0 x 106 cellen/mL bedraagt. De cellen splitsen door het draaien van de cultuur van de cel van 2 x 150 mL in 2 x 250 mL conische flessen bij 500 g gedurende 5 min. resuspendeer cellen in 2 x 10 mL verse media en overbrengen naar een 2 x 1, 000 mL ontlucht kolven met het juiste volume voor een definitieve celdichtheid van 1.5 x 106 cellen/mL, bijvoorbeeld 2 x 300 mL van een startende celdichtheid van 3.0 x 106 cellen/mL.
- Incubeer de cellen in een schudden incubator bij 37 ° C en 5% CO2 op 120 toeren per minuut (schudden diameter 50 mm).
- Na twee dagen de cellen tellen en overgaan tot de cellen splitsen als de celdichtheid 3.0 x 106 cellen/mL bedraagt. Split de cellen door spinnen beneden 4 x 150 mL celcultuur in 4 x 250 mL conische flessen bij 500 g gedurende 5 min. resuspendeer de cellen in 2 x 10 mL verse media en overbrengen naar 2 x 2.000 mL ontlucht kolf met het juiste volume voor een definitieve celdichtheid van 1.5 x 106 cellen/mL, bijvoorbeeld 2 x 700 mL van een startende celdichtheid van 3.0 x 106 cellen/mL.
- Incubeer de cellen in een schudden incubator bij 37 ° C en 5% CO2 op 120 toeren per minuut (schudden diameter 50 mm).
- Na twee dagen de cellen tellen en overgaan tot de cellen splitsen als de celdichtheid 3.0 x 106 cellen/mL bedraagt. De cellen splitsen door het gieten van de 2 x 700 mL ontlucht celcultuur in 2 x 2800 mL kolven en bijvullen met 2 x 300 mL verse media te bereiken van een volume van 2 x 1 L.
- Incubeer de cellen in een schudden incubator bij 37° C en 5% CO2 op 120 toeren per minuut (schudden diameter 50 mm).
- Na 24 h cellen tellen en oogsten van de cellen als de celdichtheid 3.0-4.0 x 106 cellen/mL bedraagt.
2. de mitochondriën isolatie
- Buffers vereist
Opmerking: De hoeveelheden worden gegeven voor een bereiding op basis van 2 L cellen. De onderstaande voorraadoplossingen tevoren voor mitochondriale isolatie buffer (MIB), sacharose/mannitol buffer (SM4), experimentele buffer (MIBSM), resuspensie buffer (SEM) voor te bereiden.- Make 0.5L MIB buffer: 50mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, proteaseinhibitors.
- 100 mL SM4 buffer maken: 840 mM mannitol, sacharose 280 mM, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 m M DTT, proteaseinhibitors.
- Make 160 mL MIBSM buffer: 120 mL MIB buffer + 40 mL SM4 buffer.
- Opslaan van 200 mL PBS bij 4 ° C.
- Maken van 5 mL SEM buffer: 250 mM sacharose, 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA.
- Maken van stamoplossingen van de 4 x 10 mL voor het verloop van de stapsgewijze sacharose met 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 1 mM EDTA en 60% / 32% /23% en 15% sucrose, respectievelijk.
- Mitochondriën isolatie
Opmerking: Het is belangrijk dat het werk snel en houd alles op ijs tijdens de gehele procedure. - Precool de stikstof cavitatie kamer vóór gebruik.
- 2 x 1 L cellen (3-4 x 109 cellen per centrifugebuis) oogsten door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 7 minuten, 4 ° C.
- Decanteren zorgvuldig het supernatant en resuspendeer de Ingehuld cellen snel in 2 x 100 mL PBS. Het zwembad van de cellen.
- Centrifugeer de geresuspendeerde cellen bij 1.200 x g gedurende 10 min, 4 ° C.
- Giet het supernatant zorgvuldig en weegt de pellet (~ 20 g).
- Resuspendeer de pellet in 120 mL MIB buffer.
- Toestaan dat cellen om te zwellen door zachtjes roeren in een koude kamer voor 10 min.
- Plaats de stikstof cavitatie zaal op het ijs en de swelled cellen overbrengen in de stikstof cavitatie kamer. Toevoegen van 45 mL SM4 buffer (1/3 van het uiteindelijke volume van de geresuspendeerde cellen, ongeveer 140 mL, opbrengst een eindconcentratie van 70 mM sucrose en 210 mM mannitol).
- Zet vast de stikstof cavitatie kamer en vullen met stikstof tot de druk 500 psi bereikt. Sluit kranen en houden geïsoleerd op het ijs gedurende 20 minuten.
- Langzaam de druk in de stikstof cavitatie zaal vrij en verzamelen de lysate (ongeveer 185 mL).
- Centrifugeer het lysed materiaal om te verwijderen van het puin van de cel en de kernen bij 800 x g gedurende 15 minuten, 4 ° C.
- De bovendrijvende vloeistof verzamelen door het door de kaasdoek gieten in een bekerglas van gehouden op ijs. Gooi niet de pellet.
- Resuspendeer de pellet in 90 mL MIBSM buffer (1/2 de vorige volume). Meng met behulp van Teflon/glas Dounce homogenizer en herhaal het centrifugeren bij 800 x g gedurende 15 minuten, 4 ° C.
- De bovendrijvende vloeistof verzamelen door het door de kaasdoek gieten in een bekerglas van gehouden op ijs. Combineer deze supernatant met het supernatant uit stap 2.2.11.
- Centrifugeer het gecombineerde supernatant bij 1.000 x g gedurende 15 minuten, 4 ° C.
- De bovendrijvende vloeistof verzamelen door het door de kaasdoek gieten in een bekerglas van gehouden op ijs.
- Negeren van de pellet en Centrifugeer het supernatant met ruwe mitochondriën bij 10.000 x g gedurende 15 minuten, 4 ° C.
Opmerking: De pellet zal doorgaans bestaan uit twee delen: losse en strak. - Zorgvuldig wassen de losse pellet zonder verstoring van de strakke gedeelte. Resuspendeer de strakke pellet in 10 mL MIBSM buffer.
- Het uitvoeren van een eiwit concentratie assay met een commerciële eiwit Assay Kit of soortgelijke methode. De opbrengsten van de typische concentratie van 2 L beginnen cultuur zijn ~ 2 mg/mL.
- Voeg 200 eenheden van RNase vrije DNase en laten draaien op een roller in de koude kamer voor 20 min te mengen gelijkmatig de DNase voor verwijdering van de genomic DNA.
- Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 15 minuten, 4 ° C en resuspendeer de pellet in 2 mL SEM buffer. Meng zachtjes met een klein Teflon/glas Dounce homogenizer resuspendeer de resterende aggregaten. Voer niet meer dan vijf en neergaande passen om te voorkomen dat de breuk. Houd op ijs.
- Bereid het verloop van de sucrose in 14 mL SW40 buizen door zorgvuldig pipetteren 1,5 mL voor 60% sacharose voorraad buffer in de onderkant van de buis. Voeg voorzichtig 4.5 mL van de 32% sacharose voorraad buffer op de top van de fluctuatiemarge van 60% zonder verstoring van het. Herhaal met 1,5 mL 23% sacharose voorraad buffer en opnieuw met 1,5 mL 15 gewichtspercenten sacharose voorraad buffer.
- Laden van de hele mitochondriale schorsing (ongeveer 3 mL) op de top van het verloop van sacharose.
- Centrifugeer in SW40 rotor op 139, 065 x g voor 60 min.
- Zorgvuldig verzamelen de bruine band migreren naar de interface van 32% en 60% sacharose met behulp van een pipet van de overdracht, meestal 2-3 mL.
- Module-freeze de gezuiverde mitochondriën in vloeibare stikstof en winkel bij-80 ° C.
3. Mitoribosome voorbereiding
- Buffers vereist
Opmerking: De onderstaande voorraadoplossingen tevoren voor de lysis-buffermengsel, sacharose kussen/verloop en resuspensie buffer te bereiden.- 10 mL lysis-buffermengsel maken: 25 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 150 mM KCl, 50mM MgOAc, 2% polyethyleenglycol octylphenyl ether, 2 mM DTT, proteaseinhibitors.
- 10 mL sacharose kussen buffer maken: 1 M sacharose (34% w/v), 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20 mM MgOAc, 1% polyethyleenglycol octylphenyl ether, 2 mM DTT.
- Maken van 5 mL resuspensie buffer: 20 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM KCl, 20mM MgOAc, 2 mM DTT
- Maak 15% - 30% lineaire sacharose verlopen met resuspensie buffer in TLS-55 polycarbonaat buizen.
- Mitoribosome reiniging
- Ontdooi bevroren mitochondria op ijs.
- 2 delen van de lysis-buffermengsel toevoegen,bijvoorbeeld het toevoegen van 6 mL lysis-buffermengsel aan 3 mL mitochondriën. Meng onmiddellijk door het omkeren van de buis meerdere malen.
- Meng met een kleine Teflon/glas dounce homogenizer om te helpen de lysis en incubeer gedurende 5-10 min op ijs aan het voltooien van de lysis.
- Centrifugeer het lysed materiaal (ongeveer 9 mL) bij 30.000 x g gedurende 20 min, 4 ° C tot het verwijderen van de onoplosbare materiaal. Giet het supernatant zorgvuldig uit de pellet en gooi de pellet.
- Herhaal het centrifugeren op 30.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C om verduidelijking van de bovendrijvende substantie. Giet het supernatant zorgvuldig uit de pellet en gooi de pellet.
- Het kussen van de sucrose in TLA 120,2 buizen (ultra-heldere) bereiden: 0.4 mL-kussen van de sacharose per buis. Één tube per mL lysed materiaal voor te bereiden.
- Lysed mitochondriën op de kussens van sacharose laag: ongeveer 1 mL per buis, resulterend in een lysate: kussen ratio van 2.5:1.
- Centrifugeer het monster bij 231, 550 x g gedurende 45 min. in TLA120.2 rotor bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en spoel de buizen opeenvolgend met 100 µl van de resuspensie buffer te verwijderen van de resterende sacharose.
- Resuspendeer de pellets in totaal 100 µl resuspensie buffer.
- Vortex op lage snelheid voor 30 s tot ontbinding van de resterende aggregaten samen en centrifugeer bij 17,949 x g gedurende 10 minuten in microtube centrifuge bij 4 ° C.
- Zorgvuldig verzamelen van het supernatant en herhaal het centrifugeren.
- Meten mitoribosome absorptie bij A260.
Opmerking: De typische opbrengst is 7 A260, met A260: A280 verhouding van 1.3. - Het laden van het gehele monster op een enkele lineaire sacharose kleurovergang buis. Centrifugeer in TLS-55 rotor op 213, 626 x g gedurende 120 minuten bij 4 ° C.
- Fractionate het verloop, de optische dichtheid bij A260 te bepalen en de breuk die overeenkomt met de piek van nucleïnezuur samen bundelen.
Opmerking: De typische A260: A280 verhouding van de piek is > 1.6. - De buffer zonodig met behulp van een methode van keuze uit te wisselen. De eindconcentratie berekenen met behulp van de conversie 1 A260 = 0,1 mg/mL.
- Module bevriezen het gezuiverde mitoribosome monster in de resuspensie buffer en winkel bij-80 ° C.
Representative Results
Verdelen en zeer levensvatbare cellen is een essentieel vertrekpunt voor zuivering van actieve mitoribosomes. Dit protocol is van toepassing op alle HEK293 schorsing cellen. We zijn met behulp van in-house cellijn T501, die stabiel is het uiten van een transporter onder tetracycline-afleidbare controle. De ouderlijke cellijn is10cellen (Tabel of Materials) HEK293S-GnTI- . Tijdens de celgroei en uitbreiding in het FreeStyle 293 expressie Medium de minimale dichtheid dient te worden bewaard bij 1.5 x 106 cellen/mL, teneinde een verdubbeling tarief van elk twee dagen, terwijl de maximale celdichtheid mag niet meer dan ~ 5 x 106 cel / mL. bij het bereiken van een celdichtheid boven 3 x 106 cellen/mL zijn de cellen Ingehuld en geresuspendeerde in een frisse, voorverwarmde media in een uitgebreide volume om de dichtheid van de minimumgrootte voor een cel van 1.5 x 106 cellen/mL. Deze splitsing wordt uitgevoerd herhaaldelijk om 2-3 dagen tot een gewenste cel massa onder de regeling wordt bereikt. De celdichtheid van de laatste in het bereik van 3-4,5 x 106 cellen/mL kan variëren, en ten minste 2 liter is vereist als uitgangspunt voor de isolatie van de mitochondriën. De levensvatbaarheid van de cellen in het algemeen moet worden gehandhaafd > 90%, en voor de definitieve cultuur die wordt geoogst > 95%. Behandeling van de grootschalige celcultuur met antibiotica wordt niet aanbevolen.
Na de reeks van differentiële centrifugations, het volume van de mitochondriale schorsing na stap 2.2.20 is meestal in het bereik van 3-5 mL. De mitochondriën zijn dan van andere organellen gescheiden op de helling van sacharose (Figuur 1). Het verloop van de stapsgewijze sacharose bereid is zodanig dat het volume van het verloop en het volume van de mitochondriale schorsing samen opwaarts naar de centrifugeren buis tot zijn maximale volume vullen. Hier speciale aandacht nodig is voor het verzamelen van de bruine band migreren naar de 60% / 32% interface met minimale besmetting uit de omliggende buffer. Dit is belangrijk om te houden van constant eiwit: wasmiddel verhouding in de volgende stap van de solubilisatie van de mitochondriën. Het wordt geadviseerd om te beoordelen van de mitochondriale eiwitconcentratie in dit stadium, en een typische rendement van 15-20 mg totale mitochondriale eiwit verwachting uit ~ 1010 gekweekte HEK cellen.
Na succesvolle mitochondriën isolatie, ze zijn lysed door toevoeging van polyethyleenglycol octylphenyl ether, en mitoribosomes worden gescheiden door een kussen van sacharose (Figuur 2). Als u wilt scheiden mitoribosomes uit de hydrofobe membraanachtig stof, pellets zijn geresuspendeerde in de buffer niet met wasmiddel en Ingehuld hydrofobe complexen zijn door middel van centrifugeren. Deze procedure wordt herhaald, en de mate van zuivering van mitoribosomes wordt gekwantificeerd door A260/A280 verhouding, die naar verwachting worden ~ 1.3. Typische opbrengst is 7 A260 van een 2 L cultuur beginnen. Dit gedeelte van de mitoribosomal bevat ook extra grote oplosbare mitochondriale complexen, zoals pyruvaat dehydrogenase en Glutamaat dehydrogenase. Om te mitoribosomes scheiden van de oplosbare mitochondriale complexen, wordt het supernatant toegepast op een kleurovergang met sacharose dichtheid. Breuken met de mitoribosome liggen over het algemeen aan de onderkant van de buis derde. De versplintering van het verloop van sacharose kan dan worden gedaan met een geautomatiseerde zuiger of handmatig door het zorgvuldig nemen 50 µL breuken met een pipet of door de onderkant van de buis met een naald 21 G ponsen en het verzamelen van de druppels.
Twee grote mitoribosomal populaties worden geïdentificeerd in het verloop: monosome 55-plussers en grote subeenheid 39S, zoals geïllustreerd in Figuur 3 en 4 van de figuur. De aanwezigheid van de grote subeenheid breuk suggereert dat cellen in een zeer actieve scheidingslijn staat11worden geoogst. De verhouding tussen de monosome en de grote subeenheid pieken kan veranderen. Een extra piek ligt dichter naar de bodem mogelijk weergegeven in preparaten met contaminerende cytoplasmatische ribosomen 80S. Gelieve nota dat de kleine sacharose verloop met behulp van de swingende emmer rotor TLS-55 zorgt voor de snelle reiniging van ~ 1 mL van de mitoribosomes op een optische dichtheid van 0.4-1 een260. De scheiding tussen de monosome en de grote subeenheid pieken kan enigszins variëren afhankelijk van de fractionering, maar meestal is er enige overlapping van de twee bergtoppen. Vandaar, welke breuken te verzamelen, en zwembad in overweging moet worden genomen met het oog op het hoogste percentage monosome, of u kunt ook grote subeenheid, in de steekproef. Voor hoge resolutie cryo-EM studies is de scheiding tussen de twee mitoribosomal populaties niet absoluut nodig (als gevolg van extra in silico operaties). Als betere scheiding nodig is, is het echter raadzaam om grotere buizen en bijbehorende keren wordt uitgevoerd te gebruiken.
Figuur 1 : Zuivering van mitochondriën op een helling van sacharose. Subcellular organellen van een 2 L beginnen cultuur waren gefractioneerde door middel van een reeks van differentiële centrifugations zoals beschreven in het protocol, en mitochondriën zijn gescheiden op een discontinue sacharose verloop. De gezuiverde mitochondriën zijn te vinden in de onderste band op het raakvlak van 32% / 60%.
Figuur 2 : Zuivering van mitoribosomes op een kussen van sacharose. Ruwe mitoribosomes uit een 2 L startende cultuur zijn gesedimenteerd via 1 M sacharose kussen. De pellets zijn geresuspendeerde in een buffer wasmiddel-vrije en mitoribosomes worden verduidelijkt door twee centrifugations zoals beschreven in het protocol. De absorptie is opgenomen om te beoordelen van de kwaliteit van de voorbereiding en de typische A260/A280 verhouding van ~1.3 (rechtervenster) verklaart een rijke mitoribosome-Fractie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Fijn zuivering van mitoribosomes op een helling van sacharose. Trace van de extinctie van een 2 L cultuur beginnen. Breuken worden genummerd vanaf de bovenkant naar de bodem van het verloop. Twee grote mitoribosomal populaties worden geïdentificeerd: grote subeenheid (piek 1) en monosome 55-plussers (piek 2). De verhouding tussen de bevolking kan veranderen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Opname van het elektron, 2D klassen en 3D reconstructie. Linker paneel: een opname met het monster uit de monosome piek 2 op een geijkte vergroting van 1.23 A / pixel. Midden paneel: Een representatieve post-processing gegevens (2D klassen) onthullen intact monosomes. Rechter paneel: 3D reconstructie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Met betrekking tot de bron van de grondstof, hoewel de relatief gemakkelijke beschikbaarheid van dierlijke weefsels die bekend is dat ze een rijke bron van mitochondriën, maakt het een populaire keuze voor mitoribosomes3,5,12, 13, ze genetisch niet kunnen worden bewerkt en weergegeven in het lab gemakkelijk. Vandaar, is er een duidelijke praktische noodzaak voor het ontwikkelen van protocollen waarbij homogeen gekweekte menselijke cellijnen. Het grote verschil tussen de protocollen omgaan met weefsels en gekweekte cellen is de wijze van lysis en homogenisering. Voor gekweekte cellen gegroeid als een enkelgelaagde, is een typische methode Teflon/glas dounce homogenisering14. De oorspronkelijke voorbereiding protocollen terwijl efficiënte werden ontwikkeld voor kleine schalen15. Een directe schaalvergroting dienst van een homogenizer met een capaciteit van 500 mL is mogelijk11, echter het vereist ~ 2 h van handenarbeid tot lysis van de 80%. Dit leidt op zijn minst drie kwesties: samenvoeging van organellen als gevolg van de lange wachttijden, niet-homogene lysis als gevolg van zware materiaal zinken naar de bodem van een groot schip, Verwarming van het monster als gevolg van de noodzaak van meerdere streken. Een beter methode van lysis van de maakt daarom gebruik van stikstof cavitatie, die is gebaseerd op decompressie van een hydrofoor vaartuig16,17. Bij deze methode worden cellen eerst gepofte op de koude kamer om te verzachten van de cellen en hen vatbaarder voor lysis. Als ze zijn geplaatst in het stikstof cavitatie apparaat een buffer met sacharose en mannitol wordt toegevoegd teneinde een osmotische druk, die zal helpen mitochondriën intact te houden. De stikstof cavitatie apparaat is dan onder druk met een groot volume van zuurstofvrije stikstof, die in de cellen oplost. Als het druk vrijgegeven stikstof bubbels uit oplossing wat resulteert is in het bezwijken van de celmembranen. Deze methode biedt diverse voordelen ten opzichte van mechanische homogenisator methoden waarbij schuifspanningen en wrijving als volgt: 1) elke externe fysieke spanning op de cellen wordt vermeden; 2) een adiabatische expansie dat koelt het monster, garandeert geen warmte schade aan organellen; 3) celbestanddelen worden beschermd tegen oxidatie door het inerte stikstofgas; 4) geen wijziging van de pH van het opschorten medium; 5) het proces is uniform en reproduceerbare omdat dezelfde ontwrichtende krachten worden toegepast binnen elke cel en de rest van het monster; 6) het proces is snel en binnen 20-30 min kan worden voltooid.
Isolatie van de mitochondriën van gekweekte cellen en weefsels is beschreven in de literatuur uitgebreid, en het is gebaseerd op een verstoring van de zachte cel gevolgd door een reeks van differentiële centrifugations. De meeste van de momenteel gebruikte protocollen volgen de oorspronkelijke procedures ontwikkeld in het midden van de vorige eeuw18. Terwijl de biochemische basisoplossingen kloppen, zijn er verschillende misvattingen die zijn gemarkeerd in de literatuur en onopgemerkt bleef. Voor het optimaliseren van het protocol voor mitoribosomes, wij systematisch onderzocht de gerapporteerde algemene beginselen en concluderen dat: 1) opname van Mg2 + - en K+ in de buffer is niet cruciaal. Het heeft betoogd dat de KCl helpt om te voorkomen dat cytoplasmatische eiwitten vormen een gel19, echter een voldoende verdunning zoals beschreven in ons protocol, verstrekt dit fenomeen doet zich niet voor. Bovendien, uitsluiting van Mg2 + is nuttig om verontreinigingen door cytoplasmatische ribosomen20; 2) er is niet nodig om te houden van maximale mogelijke volumeverhouding van cellen naar medium ter bescherming van de vrijgegeven organellen van de hypo-osmotische milieu. De osmotische in ons protocol wordt voldoende ondersteund in sacharose-bevattende buffers, als met de verdunning van cellen met mitochondriën isolatie buffer (2.II.5 stap) is essentieel voor de efficiënte scheiding van organellen in een grootschalige preparaat.
De pH van mitochondriën isolatie buffer is dicht bij fysiologische waarden, d.w.z. 7.5, ook de optimale pH voor de volgende mitoribosome voorbereiding. Bindmiddelen EDTA en de EGTA worden toegevoegd aan de isolatie media chelaat contaminerende ionen, en ze chelaat gratis magnesium en calcium, respectievelijk. Het is al besproken dat opneming van EDTA kan leiden tot de beschadiging van het innerlijke mitochondriale membraan14, dus de concentratie is beperkt tot 1 mM als een voorzorgsmaatregel. We hebben geen verschil niet waargenomen bij het gebruik van 5 mM EDTA in de definitieve zuivering van sacharose dichtheid verloop.
Het protocol beschreven gebruikt hierin HEK293S-afgeleide menselijke cellen voor zuivering van de mitoribosome. De kwaliteit van de voorbereiding kan het verkregen monster biochemically en structureel atomaire resolutie worden onderzocht. Hierdoor kan men de methode toepassen op menselijke mitoribosomal vertalen complexen, kwaliteitscontrole assemblages en mitoribosomal subeenheden tussenproducten. Bovendien, omdat kankercellen hebben versterkte OXPHOS capaciteit en verhoogde mitochondrial eiwit vertaling in vergelijking met aangrenzende stromale weefsel21, mitoribosomes zijn gevestigde drug doelen voor kanker22. Daarom, met behulp van dit protocol voor specifieke zuivering van mitoribosomes in aanwezigheid van remmers moeten medische toepassingen. Mitoribosomal mutaties zijn ook gekoppeld aan erfelijke mitochondriale ziekten23. Aangezien deze mutaties directe gevolgen voor de structuur hebben, zal de hier gepresenteerde benadering nuttig zijn voor hun structurele karakterisering. Het protocol kan experimenteel worden uitgebreid en toegepast op een aantal wetenschappelijke vragen het fundamentele begrip van vertaling in menselijke mitochondriën en het medisch belang ervan aan te pakken.
Disclosures
Geen
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Zweedse Foundation voor strategisch onderzoek (toekomst leiders Grant FFL15:0325), Ragnar Söderberg Stichting (Fellowship in geneeskunde M44/16), Zweedse Onderzoeksraad (Starting Grant NT × 2015-04107), FEBS op lange termijn Fellowship (nv) , H2020-MSCA-ITN-2016 project 721757 (VS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
| Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
| Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
| Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
| T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
| Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
| 250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
| Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
| Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
| Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
| Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
| SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
| Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
| TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
| TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
| Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |
References
- Ott, M., Amunts, A., Brown, A. Organization and regulation of mitochondrial protein synthesis. Annual review of biochemistry. 85, 77-101 (2016).
- Amunts, A., Brown, A., Toots, J., Scheres, S. H., Ramakrishnan, V. The structure of the human mitochondrial ribosome. Science. 348 (6230), 95-98 (2015).
- Greber, B. J., Bieri, P., Leibundgut, M., Leitner, A., Aebersold, R., Boehringer, D., Ban, N. The complete structure of the 55S mammalian mitochondrial ribosome. Science. 348 (6232), 303-308 (2015).
- Greber, B. J., Ban, N. Structure and function of the mitochondrial ribosome. Annual review of biochemistry. 85, 103-132 (2016).
- Greber, B. J., Boehringer, D., Leitner, A., Bieri, P., Voigts-Hoffmann, F., Erzberger, J. P., Ban, N. Architecture of the large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome. Nature. 505 (7484), 515-519 (2014).
- Rorbach, J., Gao, F., Powell, C. A., D'Souza, A., Lightowlers, R. N., Minczuk, M., Chrzanowska-Lightowlers, Z. M. Human mitochondrial ribosomes can switch their structural RNA composition. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201609338 (2016).
- Chrzanowska-Lightowlers, Z., Rorbach, J., Minczuk, M. Human mitochondrial ribosomes can switch structural tRNAs-but when and why? RNA biology. 14 (12), 1668-1671 (2017).
- Gammage, P. A., Moraes, C. T., Minczuk, M. Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized. Trends in Genetics. , (2017).
- Brown, A., Rathore, S., Kimanius, D., Aibara, S., Bai, X. C., Rorbach, J., Ramakrishnan, V. Structures of the human mitochondrial ribosome in native states of assembly. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 866 (2017).
- Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogenous N-glycosylation by tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 99, 13419-13424 (2002).
- Brown, A., Amunts, A., Bai, X. C., Sugimoto, Y., Edwards, P. C., Murshudov, G., Ramakrishnan, V. Structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria. Science. 346 (6210), 718-722 (2014).
- O'Brien, T. W., Kalf, G. F. Ribosomes from rat liver mitochondria I. Isolation procedure and contamination studies. Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2172-2179 (1967).
- Spremulli, L. L. Large-scale isolation of mitochondrial ribosomes from mammalian tissues. Mitochondria: Practical Protocols. , 265-275 (2007).
- Rice, J. E., Lindsay, J. G. Subcellular fractionation of mitochondria. Subcellular Fractionation: A Practical Approach. Grahamand, J. M., Rickwood, D. , IRL Press. Oxford. 107-142 (1997).
- Attardi, G., Ching, E. Biogenesis of mitochondrial proteins in HeLa cells. Methods in enzymology. 56, 66-79 (1979).
- Gottlieb, R. A., Adachi, S. Nitrogen cavitation for cell disruption to obtain mitochondria from cultured cells. Methods in enzymology. 322, 213-221 (2000).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), (2010).
- Kennedy, E. P., Lehninger, A. L. Oxidation of fatty acids and tricarboxylic acid cycle intermediates by isolated rat liver mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 179 (2), 957-972 (1949).
- Graham, J. M. Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3, Unit 3.3, (2001).
- Amunts, A., Brown, A., Bai, X. C., Llácer, J. L., Hussain, T., Emsley, P., Ramakrishnan, V. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).
- Sotgia, F., Martinez-Outschoorn, U. E., Howell, A., Pestell, R. G., Pavlides, S., Lisanti, M. P. Caveolin-1 and cancer metabolism in the tumor microenvironment: markers, models, and mechanisms. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 7, 423-467 (2012).
- Škrtić, M., Sriskanthadevan, S., Jhas, B., Gebbia, M., Wang, X., Wang, Z., Lai, C. K. Inhibition of mitochondrial translation as a therapeutic strategy for human acute myeloid leukemia. Cancer cell. 20 (5), 674-688 (2011).
- Boczonadi, V., Horvath, R. Mitochondria: impaired mitochondrial translation in human disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 48, 77-84 (2014).
