यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल वयस्क पुरुष डार्क अगौटी चूहों में दोनों कॉर्टिकल गोलार्द्धों के व्यापक ग्रे मैटर डिमाइलेशन के प्रजनन की अनुमति देता है। इस विधि में कैथेटर के इंट्रासेरेब्रल प्रत्यारोपण, मायलिन ओलिगोडेन्ड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन के खिलाफ उप-नैदानिक प्रतिरक्षण, और प्रत्यारोपित कैथेटर के माध्यम से समर्थक भड़काऊ साइटोकिन मिश्रण का इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन शामिल है।
मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की सबसे आम प्रतिरक्षा-मध्यस्थता बीमारी है और उत्तरोत्तर शारीरिक विकलांगता और मृत्यु की ओर जाता है, रीढ़ की हड्डी और सेरिबैलम में सफेद पदार्थ घावों के कारण, साथ ही ग्रे मैटर में जनसांख्यिकी द्वारा। जबकि प्रयोगात्मक एलर्जी एन्सेफेलोमाइलाइटिस के पारंपरिक मॉडल रीढ़ की हड्डी और सेरिबेलर सफेद पदार्थ में सेल-मध्यस्थता सूजन की जांच के लिए उपयुक्त हैं, वे ग्रे मैटर विकृतियों को संबोधित करने में विफल रहते हैं। यहां, हम कॉर्टिकल डिमाइलेशन के एक उपन्यास चूहा मॉडल के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिससे रोग और आणविक तंत्र की जांच होती है जिससे कॉर्टिकल घाव होते हैं। डेमिलिएंशन को एक अपूर्ण फ्रायंड के एडजुवेंट में कम खुराक मायलिन ओलिगोडेन्ड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) के साथ प्रतिरक्षण से प्रेरित किया जाता है जिसके बाद कैथेटर-मध्यस्थता वाले इंट्रासेरेब्रल डिलीवरी प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स होते हैं। कैथेटर, इसके अलावा, इंजेक्शन प्रेरित आघात के कारण के बिना demyelination के कई दौर सक्षम बनाता है, साथ ही संभावित चिकित्सकीय दवाओं के इंट्रासेरेब्रल वितरण एक पूर्व नैदानिक जांच के दौर से गुजर । विधि भी नैतिकता की दृष्टि से अनुकूल है के रूप में पशु दर्द और संकट या विकलांगता नियंत्रित कर रहे है और अपेक्षाकृत कम । पूरे प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन के लिए अपेक्षित समय सीमा लगभग 8 – 10 सप्ताह है।
एमएस सीएनएस की एक प्रतिरक्षा-मध्यस्थता, भड़काऊ बीमारी है, जो मुख्य रूप से माइलिन शीट्स को नुकसान पहुंचाती है, लेकिन अंततः अक्षीय हानि और स्थायी न्यूरोनल क्षति की ओर ले जाती है। एमएस सीएनएस की सबसे आम प्रतिरक्षा-मध्यस्थता बीमारी है, जिसमें दुनिया भर में लगभग 2.3 मिलियन लोगों की अनुमानित व्यापकता है, नेशनल एमएस सोसाइटी1के अनुसार, और एक प्रमुख व्यक्तिगत और सामाजिक आर्थिक बोझ का प्रतिनिधित्व करता है। रोग की शुरुआत की औसत आयु 30 वर्ष है और गंभीर विकलांगता के कारण उत्पादक वर्षों के नुकसान की ओर जाता है। एमएस वर्तमान में लाइलाज है, और वर्तमान उपचार के तौर-तरीकों का उद्देश्य पतन-प्रेषण एमएस में एक तीव्र पतन के दौरान लक्षणों का प्रबंधन करना और इम्यूनोमोडुलेटरी थेरेपी2,3द्वारा रिलेप्स आवृत्ति को कम करने के लिए रोग के पाठ्यक्रम को संशोधित करना है। कोई उपचार विकल्प अभी तक प्रगतिशील प्रकार4के लिए प्रभावोत्पादक साबित हो गया है, बी सेल घट चिकित्सा के हाल ही में एक नैदानिक परीक्षण के अपवाद के साथ, जो सक्रिय सूजन5के साथ प्राथमिक प्रगतिशील एमएस (PPMS) रोगियों के एक उपसमूह में प्रभावोत्पादक होना दिखाया गया था । जबकि कई संभावित आनुवंशिक6 और पर्यावरण जोखिमकारकों 7 की पहचान की गई है, एमएस की एटियोलॉजी, हालांकि, अज्ञात रहता है ।
एमएस में बड़े भड़काऊ demyelinating सजीले टुकड़े की विशेषता है, और चोटों को फैलाना, सफेद बात8,9। फोकल घावों को एक व्यापक टी-सेल मध्यस्थता हमले, ओलिगोडेन्ड्रोसाइट विनाश, प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोग्लियोसिस और अक्षीय अध: पतन के साथ जोड़ा गया है, जिससे मोटर न्यूरॉन में गिरावट आई है। ग्रे मैटर डेमेलियेशन और शोष को इस बीमारी की अतिरिक्त हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं के रूप में मान्यता मिली है9,10,11. बाद में12,13रोगियों में न्यूरोलॉजिकल रोग और संज्ञानात्मक गिरावट में योगदान करनेकासुझाव दिया गया है । कॉर्टिकल डिमाइलेशन के तीन पैटर्न को प्रतिष्ठित किया गया है, अर्थात् मैं) ल्यूकोक्रैटिकल, सफेद पदार्थ के घावों (34%), ii) छोटे, पेरिवास्कुलर (16%), और iii) उपपिअल (50%) के साथ समीपस्थ। फोकल व्हाइट मैटर घावों के विपरीत, इन ग्रे मैटर घावों को टी-सेल मध्यस्थता हमले की कमी की सूचना दी गई है और इसके बजाय एक बढ़ी हुई माइक्रोग्लियल सक्रियण, एपोप्टोसिस और न्यूरोनल लॉस12की विशेषता है।
आज तक, बीमारी की जटिलता के कारण, एक ही पशु मॉडल में मानव एमएस को फिर से काटना संभव नहीं हो पाया है। विभिन्न प्रकार के एमएस पशु मॉडल, प्रत्येक रोग रोगजनन और प्रगति के विभिन्न पहलुओं का अनुकरण करते हुए, इसके बजाय,14,15विकसित किए गए हैं। वर्तमान पशु मॉडल तीन अलग-अलग रोग प्रक्रियाओं की नकल करते हैं: i) फोकल भड़काऊ घाव, ii) सफेद पदार्थ की चोट को फैलाना, और iii) ग्रे मैटर पैथोलॉजी को फैलाना।
एमएस व्हाइट मैटर सजीले टुकड़े के पशु अध्ययन ज्यादातर कृंतक एन्सेफेलोमायलाइटिस (EAE) मॉडल में आयोजित किए गए हैं। टेस्ट जानवरों को एक पायस के साथ सक्रिय रूप से प्रतिरक्षित किया जाता है जिसमें मायलिन एंटीजन [आमतौर पर मायलिन ओलिगोडेन्ड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी)16,17,मायलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी)18,या प्रोटेओलिपिड प्रोटीन (पीएलपी)19]एक साथ एक पूर्ण फ्रांड के एडजूवंट (सीएफए)20]के साथ। इस बीमारी को माइलिन-विशिष्ट टी-कोशिकाओं21के दत्तक अंतरण से भी निष्क्रिय रूप से प्रेरित किया जा सकता है। रोग पाठ्यक्रम एंटीजन/माउस स्ट्रेन कॉम्बिनेशन पर निर्भर करता है जिसका उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, C57BL/6 में एमओजी35-55, एक मोनोफेसिक क्रोनिक डिजीज22में परिणाम देता है, जबकि स्विस जिम लैम्बर्ट (एसजेएल) चूहों में पीएलपी139-151 चूहों के कारण लिंग-विशिष्ट तरीके से24 में एक रिलैपिंग-प्रेषण रोग पाठ्यक्रम23 होताहै । चूहा एमओजी35-55,इसके अलावा, एक एंसेपाइलोजेनिक टी-सेल प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है, जबकि मानव एमओजी35-55 C57BL/6 चूहों25में बी-सेल-निर्भर सूजन को प्रेरित करता है। विभिन्न ईएई मॉडल मुख्य रूप से रीढ़ की हड्डी और सेरिबैलम में सेल-मध्यस्थता सूजन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं, लेकिन कॉर्टेक्स, कॉर्पस कैलोसम और उपकॉकृतीय संरचनाओं जैसी अग्रेब्राण संरचनाएं काफी हद तक26से बच जाती हैं। न तो सफेद पदार्थ की चोट को फैलाना और न ही ग्रे मैटर डिमाइलेशन, इसके अलावा, EAE मॉडल26, 27में पर्याप्त रूप से दोहरायाजाताहै। सक्रिय ईएई प्रेरण से जुड़े कॉर्टिकल डिमाइलेशन को मार्मोसेट28, 29 और कुछ लुईस चूहे उप उपभेदों में सूचित किया गया है, बाद के मामले में एमएचसी वर्ग 1 और वर्ग द्वितीय आइसोटाइप और एलील्स30के प्रचलित संयोजनों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है।
क्यूप्रीजोन मॉडल31 कॉर्टिकल, उप-कॉर्टिकल 32 और हिप्पोकैम्पल 33 क्षेत्रों के साथ-साथ कॉर्पस कैलोसम 34 और कॉडेट पुटामेन35के व्यापक डिमाइलेशन के साथ फैलाना सफेद पदार्थ डिमाइलेशन और ग्रे मैटर पैथोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। क्यूप्रिजोन नशा, जो सैद्धांतिक रूप से, ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स के मेटाबोलिक तनाव-प्रेरित एपोप्टोसिस में परिणाम देता है, एमएस दिमाग के कॉर्टिकल डेमीलिनिंग घावों जैसे माइक्रोग्लिया एक्टिवेशन, एस्ट्रोग्लियोसिस और घुसपैठ परिधीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सापेक्ष कमी की कुछ विशेषताओं की नकल करता है। न्यूरोनल एपोप्टोसिस और थैलेसीमिक शोष की कमी, साथ ही आहार क्यूपरिजोन सप्लीमेंट32की समाप्ति पर मनाए गए एक मजबूत पुनर्मीलन के साथ डिमाइलेशन का पूरा समाधान, हालांकि, क्यूपरीजोन के उपयोग को प्रीक्लिनिकल एमएस मॉडल के रूप में सीमित करता है। विषाक्त डिमाइलेशन को सफेद पदार्थ के इलाकों36, 37में लिसोलेिथिन या एथिडियम ब्रोमाइड के फोकल इंजेक्शन द्वारा भी प्रेरित किया जा सकता है, लेकिन इन तरीकों का शायद ही कभी उपयोग कियाजाताहै। विषाक्त डिमाइलेशन मॉडल रेमियोलेशन के जटिल तंत्रों के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं, जैसे ओलिगोडेन्ड्रोसाइट प्रोजेनिटर कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स38,39के लिए आवश्यकता। हाल की दो समीक्षाओं15,40में ईएई और नशा मॉडलों के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान की गई है .
साइटोकिन-प्रेरित डिमिलिनेशन को शुरू में ईएई41में रीढ़ की हड्डी के सफेद पदार्थ के घावों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। बाद में, इसे एमएस डार्क अगूटी (डीए) या लुईस चूहों में कॉर्टिकल ग्रे मैटर विकृतियों का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया था, जो पहले एक अधूरे फ्रायंड के एडजुवंट (आईएफए) में एमओजी1-12542,43 या एमओजी1-11644 के साथ एक उप-नैदानिक प्रतिरक्षण द्वारा किया जाता है। शास्त्रीय EAE मॉडल के विपरीत, ये प्राइमेड जानवर रीढ़ की हड्डी में फोकल भड़काऊ घावों के नैदानिक लक्षणों का प्रदर्शन नहीं करते हैं। इसके बजाय, मस्तिष्क में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया और demyelination बाद में एक समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन मिश्रण के एक इंट्रासैरेब्रल प्रशासन द्वारा प्राप्त कर रहे है [ट्यूमर परिग कारक अल्फा (TNFα) और इंटरफेरॉन गामा (IFNγ)] एक बार जानवरों के रक्त में विरोधी MOG एंटीबॉडी के एक स्थिर टाइटर प्राप्त किया है ।
मर्कलर एट अल द्वारा अध्ययन। ४२ और गार्डनर एट अल । 44 ने उप-नैदानिक एमओजी प्रतिरक्षण और एक इंट्रासर्नेब्रल या सबराक्नेबल साइटोकिन इंजेक्शन द्वारा उप-क्लिनिकल कॉर्टिकल डिमिलिनेशन प्रेरण की प्रभावकारिता साबित की है। हालांकि, डिमाइलेशन की रिपोर्ट की गई अवधि 14 दिनों या उससे कम समय में बहुत कम थी, जिससे किसी भी औषधीय हस्तक्षेप परीक्षण के लिए खिड़की सीमित हो गई। दोनों मॉडल, इसके अलावा, एक दर्दनाक इंजेक्शन मोडस का उपयोग करते हैं, जो प्रति इंजेक्शन आघात और रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) टूटने का कारण बन सकता है और इस प्रकार परेंचिमा में भड़काऊ कोशिकाओं की अनियंत्रित भर्ती का कारण बन सकता है। इसके अलावा, दोनों अध्ययनों ने एक सीमित क्षेत्र तक, इप्सिलाटेरल कॉर्टेक्स में, या साइटोकिन इंजेक्शन की साइट के करीब के आसपास तक सीमित क्षेत्र तक सीमित है।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने डीए चूहों के दाहिने पैरीटल कॉर्टेक्स में एक कैथेटर प्रत्यारोपित किया, जिसमें कैथेटर टिप कॉर्पस कैलोसम के ठीक ऊपर स्थित था। BBB अखंडता की पूरी वसूली की अनुमति देने के लिए, जानवरों कैथेटर प्रत्यारोपण के बाद 2 सप्ताह की एक आराम अवधि की अनुमति दी गई । बाद में, चूहों को आईएफए में 5 माइक्रोन्ड रिकॉम्बिनेंट एमओजी1-125 के साथ उप-चिकित्सकीय रूप से प्रतिरक्षित किया गया था। लगभग 4 सप्ताह के बाद एक स्थिर एंटी-एमओजी एंटीबॉडी टिटर की प्राप्ति के बाद, एक प्रोग्रामेबल सिरिंज पंप का उपयोग करके 10 मिनट के भीतर कैथेटर के माध्यम से साइटोकिन मिश्रण के 2 माइक्रोन इंजेक्ट किए गए थे। इस प्रक्रिया ने 15 दिनों में इप्सी और कॉन्ट्रालेटरल सेरेब्रल गोलार्द्धों दोनों के व्यापक कॉर्टिकल डिमाइलेशन को प्राप्त किया, जिसमें साइटोकिन इंजेक्शन43के लगभग 30 दिनों के बाद आंशिक पुनर्जंमीकरण हुआ। इसके अलावा, कैथेटर के माध्यम से प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के दोहराए गए प्रशासन द्वारा कई डिमाइलेशन चरणों को प्रेरित किया जा सकता है, और वैश्विक मस्तिष्क शोष, प्रगतिशील एमएस उपप्रकार45की एक आम विशेषता, दूसरे डिमाइलेशन चरण43के बाद के रूप में जल्दी प्रेरित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रत्यारोपित कैथेटर का उपयोग औषधीय हस्तक्षेपों का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है।
नीचे वर्णित प्रोटोकॉल एक इंट्रासेब्रल कैथेटर का उपयोग करके डीए चूहों के दोनों मस्तिष्क गोलार्द्धों में व्यापक कॉर्टिकल डिमिटेरियनेशन की प्रजनन योग्य पीढ़ी के लिए प्रयोगात्मक चरणों का विस्तृत विवरण प्रदान करता है।
हमारी विधि दा चूहों का उपयोग करता है। चूहों के अनुकूलन की संभावना एक छोटे कैथेटर और शिकंजा के उपयोग की आवश्यकता होगी । यह भी ध्यान में रखना चाहिए कि रोग पाठ्यक्रम, भड़काऊ प्रतिक्रिया, और demyelination की हद तक क्या यहां प्रस्तुत किया है अगर एक अलग प्रजाति/तनाव का उपयोग किया जाता है से अलग हो सकता है । चूहों के विभिन्न उपभेदों का उपयोग करके शास्त्रीय ईएई मॉडल के साथ इस तरह के अंतर देखे गए हैं। चूहा मूल के MOG92-106, उदाहरण के लिए, ए एसडब्ल्यू चूहों में प्राथमिक प्रगतिशील या माध्यमिक प्रगतिशील EAE के परिणामस्वरूप, whilst यह SJL/J चूहों४६में relaping-प्रेषण EAE प्रेरित किया । इसलिए एक ही तनाव के जानवरों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । पिछले विभिन्न अध्ययनों में ईएई अभिव्यक्ति में लैंगिकमतभेदोंकी भी सूचना दी गई है । इस तरह के लिंग प्रभाव की घटना अच्छी तरह से यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए उंमीद की जा सकती है अभी तक आगे के प्रयोगों में मांय किया जाना बाकी है ।
एक एनेस्थेटिक्स मिश्रण का इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) प्रशासन जिसमें फेन्टनाइल का 0.02 मिलीग्राम/एमएल, मिदाजोलम का 0.4 मिलीग्राम/एमएल और मेडेटोमिडीन का 0.2 मिलीग्राम/एमएल शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के लिए उपयोग किया जाता है। वयस्क पुरुष डीए चूहों का वजन 270 – 300 ग्राम है, इस मिश्रण के लगभग 0.4 – 0.6 एमएल(यानी,~ 1.5 एमएल/किलो) की आवश्यकता होती है ताकि 60 -90 मिनट तक चलने वाले संज्ञाहरण को प्रेरित किया जा सके। सर्जरी के बाद, संज्ञाहरण एक मारक के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा विरोधी है जिसमें फ्लूमजेनिल के 0.07 मिलीग्राम/एमएल और शारीरिक नमकीन (0.9% एनएसीएल) में एटीपेमेज़ोल के 0.42 मिलीग्राम/एमएल शामिल हैं। 1 -1.5 एमएल/किलो की खुराक 5 मिनट के भीतर संज्ञाहरण का विरोध करती है। वैकल्पिक रूप से, जानवरों को एनेस्थेटिक्स से शारीरिक रूप से धोने पर अनायास जागने की अनुमति दी जा सकती है, लेकिन उस मामले में, जानवरों को निगरानी में रखने की आवश्यकता होगी जब तक कि वे पूरी तरह से सचेत न हों।
पशुओं की सर्जरी के लिए अक्सर उपयोग किए जाने वाले अन्य संज्ञाहरण विकल्प, जैसे केटामाइन और जाइलाज़ीन47 या सोडियम पेंटोबार्बिटल48का आईपी इंजेक्शन, या आइसोफ्लोरेन49 और हेलोथेन50जैसे अस्थिर एनेस्थेटिक्स का साँस लेना, यहां प्रस्तुत सर्जरी के लिए भी विचार किया जा सकता है। हालांकि, एक एनेस्थेटिक एजेंट चुनना महत्वपूर्ण है जो इच्छित डाउनस्ट्रीम हस्तक्षेप (एस) में हस्तक्षेप नहीं करता है।
प्रतिरक्षण और इंट्रासैरेब्रल साइटोकिन इंजेक्शन के दौरान, एनेस्थीसिया के लिए 5% आइसोफ्लुन का उपयोग किया जाता है। यहां वर्णित मॉडल चूहों का उपयोग करके स्थापित किया गया था, और सूचीबद्ध प्रायोगिक विवरण, इस प्रकार, विशेष रूप से चूहे पर लागू होते हैं। कैथेटर प्रत्यारोपण निर्देशांक का चयन संभव सफेद पदार्थ परिवर्तन (कॉर्पस कैलोसम में कैथेटर टिप) के एक साथ विश्लेषण को सक्षम करने के लिए किया गया था। जबकि कैथेटर प्रविष्टि साइट को एंटेरोपोस्टेरियर और पार्श्व स्थिति के संबंध में भिन्न किया जा सकता है, केंद्रीय सल्कस के चयन के लिए बेहतर सगित्तल साइनस को नुकसान से बचने की आवश्यकता होती है।
वर्णित विधि की एक और विशेषता इप्सी और कॉन्ट्रालेट्रल गोलार्द्धों दोनों का समकक्ष डिमाइलेशन है, संभवतः कॉर्टिकल क्षेत्रों51से मध्यवर्ती तरल पदार्थ के शारीरिक प्रवाह द्वारा इंजेक्शन साइटोकीन मिश्रण को सबराक्नेइड अंतरिक्ष में ले जाने के परिणामस्वरूप। इंजेक्शन मोड, और कैथेटर का स्थान नहीं, इसलिए, सेरेब्रल कॉर्टेक्स में विलीनीकरण का कारण बनता है, और दाएं या बाएं पार्श्व प्रांतस्था का विकल्प, इस प्रकार, इस संबंध में सारहीन होना चाहिए।
प्रोटोकॉल एक 26 जी कैथेटर का उपयोग करता है, जो व्यापक दर्दनाक चोट से बचने के लिए काफी छोटा है और प्रयोग के लंबे समय तक कैथेटर टिप के क्लोजिंग की बढ़ी हुई दर से बचने के लिए काफी बड़ा है। निश्चित रूप से, प्रत्यारोपण और कैथेटर की उपस्थिति ही एक एस्ट्रोसाइटिक और माइक्रोग्लियाल सक्रियण का कारण बनती है, नियंत्रण जानवरों में भी केवल कैथेटर प्रत्यारोपण प्राप्त होता है; हालांकि, साइटोकिन-इंजेक्शन वाले जानवरों की तुलना में यह मामूली है। 43 बाद के विश्लेषणों में किसी भी हस्तक्षेप से बचने के लिए, हमने पॉली-ईथर-ईथर-कीटोन (तिरछी) से बने एमआरआई-संगत कैथेटर का इस्तेमाल किया।
वास्तव में, डिमाइलेशन की एक समान गहराई, प्रस्तुत विधि के साथ आईपीएसआई और कॉन्ट्रालेटरल दोनों क्षेत्रों में बनाई गई है। इसका तात्पर्य यह है कि कैथेटर गहराई/लंबाई प्रांतस्था में जनसांख्यिकी के पैटर्न और सीमा में एक प्रमुख भूमिका नहीं निभा सकता है । इसलिए, कैथेटर-प्रेरित घाव आकार को कम करने के लिए कैथेटर लंबाई के संशोधन पर विचार किया जा सकता है। फिर भी, एक काफी कम कैथेटर लंबाई थोड़ा कम स्पष्ट कॉर्टिकल डेमिलेशन का कारण बन सकती है, जबकि कैथेटर लंबाई के लिए विशेष रूप से परीक्षण के प्रयोगों द्वारा एक निर्णायक उत्तर प्राप्त किया जाएगा।
मॉडल का एक लाभ यह है कि प्रत्यारोपित कैथेटर कैथेटर के माध्यम से कॉर्टेक्स को प्रशासित संभावित चिकित्सीय के परीक्षण के लिए अनुमति देता है ताकि हिस्टोलॉजिकल रूप से पता लगाने योग्य कॉर्टिकल डेमिलेशन (दिन 15 या बाद में) के शिखर पर या बाद में रेमियोलेशन की अनुमति दी जा सके, जबकि एक प्रीट्रीटेशन सेटिंग में यह प्रतिरक्षण के बाद होगा लेकिन साइटोकिन इंजेक्शन से पहले। समय सीमा पर निर्णय जब चिकित्सा प्रशासन प्रशासित किया जाएगा, इसलिए, विशेष अनुसंधान सवाल और ब्याज की दवा पर निर्भर करेगा ।
कैथेटर प्रत्यारोपण के बाद, अध्ययन के अंत तक कैथेटर हटाने से बचने के लिए संशोधित (अधिमानतः उच्च शीर्ष) पिंजरों में एकल जानवरों को घर करना महत्वपूर्णहै (चित्रा 8)। जानवरों को भी इनलेट के साथ कैथेटर टोपी unscrew हो सकता है, हालांकि यह शायद ही कभी होता है । जानवरों को दैनिक रूप से देखा जाना चाहिए और हटाई गई टोपियां ताजा लोगों के साथ प्रतिस्थापित की जानी चाहिए, ताकि इनलेट की अनुपस्थिति में कैथेटर टिप रुकावट से बचा जा सके, और इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन के बाद परेंन्चिमा में सटीक वितरण सुनिश्चित किया जा सके। जानवरों को कैथेटर प्रत्यारोपण के बाद जल्द से जल्द 2 सप्ताह में प्रतिरक्षित किया जाता है ताकि रक्त-मस्तिष्क बाधा के उपचार और बंद होने की अनुमति दी जा सके।
प्रतिरक्षण के बाद सीरम एंटी एमओजी एंटीबॉडी टाइटर्स को मापा जाना चाहिए। एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग से पता चला है कि MOG1-125 के 5 माइक्रोन (आईएफए में) वयस्क पुरुष दा चूहों में 4 सप्ताह के भीतर पर्याप्त प्रतिरक्षण प्रदान की है । ५,००० μg/ml और उच्च का एक टाइटर पर्याप्त होगा, लेकिन निश्चित रूप से MOG तैयारी और पशु तनाव सहित कई कारकों पर निर्भर करेगा और इस प्रकार, व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना होगा । साइटोकिन इंजेक्शन से पहले भी लकवाग्रस्त हिंद अंगों के साथ शास्त्रीय ईएई फेनोटाइप के परिणामस्वरूप अत्यधिक उच्च एंटीजन खुराक से बचना महत्वपूर्ण है।
प्रत्येक जानवर को 5 माइक्रोन के साथ प्रतिरक्षित किया जाता है, जिसमें 5 माइक्रोनिंट मायलिन ओलिगोडेन्ड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (आरएमओजी1-125)को अधूरा फ्रायंड के एडजुवेंट (आईएफए) के 200 माइक्रोल में पायस किया जाता है। चूंकि तैयारी के दौरान सिरिंज के भीतर कुछ पायस खो जाता है, इसलिए प्रत्येक जानवर के लिए इस राशि से अधिक तैयार करने की सलाह दी जाती है। हमने चूहे के एन-टर्मिनस से पुनः संयोजन एमओजी (1-125) का उपयोग किया, जिसे एस्चेरिचिया कोलाई में व्यक्त किया गया था और फिर चेलेट क्रोमेटोग्राफी द्वारा एकरूपता को शुद्ध किया गया था, 6 एम यूरिया में भंग किया गया था, और शारीरिक तैयारी प्राप्त करने के लिए पीबीएस के खिलाफ डायलाइज्ड किया गया था52,53। हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एमओजी का भी उपयोग किया जा सकता है।
एमओजी1-116,एमओजी35-55 या पीएलपी 139-151 जैसे अन्य एंटीजन तैयारी का उपयोग विभिन्न ईएई मॉडलों में किया जाता है, और एंटीजन और पशु तनाव मतभेदों को इन मॉडलों में अलग-अलग रोग फेनोटाइप प्रेरित करने के लिए जाना जाता है20। इन एंटीजन तैयारी का परीक्षण डीए चूहों में नहीं किया गया था और, यदि आरएमओजी1-125को वरीयता में उपयोग किया जाता है, तो यहां प्रस्तुत की गई बीमारी फेनोटाइप या हिस्टालॉजी परिणामों से भिन्न हो सकता है।
एक कनेक्टर कैनुला कैथेटर के समान लंबाई इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन से पहले तैयार किया जाता है। यह एक टेम्पलेट कैथेटर के साथ कोडांतरण और एक ही आकार (लंबाई में 2 मिमी)(चित्रा 4)को काटने के द्वारा किया जा सकता है । यह महत्वपूर्ण है कि कनेक्टर कैनुला साइटोकिन इंजेक्शन के दौरान हवा बुलबुला मुक्त हो- क्योंकि इंजेक्शन की मात्रा केवल 2 माइक्रोन है, यहां तक कि कैनुला टिप पर एक छोटे से हवा का बुलबुला भी सफलतापूर्वक मस्तिष्क में वितरित तरल की मात्रा को काफी कम कर देगा। यह पंप को चालू रखने और कैनुला डालने से तभी हासिल किया जाता है जब टिप पर इंजेक्शन लिक्विड की बढ़ती बूंद मौजूद होती है। कैनुला प्रविष्टि के बाद, कनेक्टर कैथेटर से खराब हो जाता है, जबकि ओवरटाइटिंग से बचता है ताकि कैथेटर के ऊपरी सिरे को नुकसान न पहुंचाया जा सके, जिससे इंजेक्शन के बाद फिर से जाना मुश्किल हो जाएगा। इंजेक्शन-प्रेरित आघात से बचने के लिए 0.2 माइक्रोन/न्यूनतम की इंजेक्शन गति का उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, एक धीमी गति से इंजेक्शन, इंजेक्शन के बाद एक 20 मिनट प्रतीक्षा अवधि के साथ संयुक्त, मध्यवर्ती तरल पदार्थ में इंजेक्शन तरल के प्रसार और CSF में एक प्रभावी draining सुनिश्चित करता है । वैक्यूम प्रभाव से बचने के लिए कैनुला को धीरे-धीरे हटा दिया जाता है।
रिपोर्ट की गई विधि में शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप शामिल है और इसलिए, कर्मचारियों को स्टीरियोटाटिक सर्वाइवल सर्जरी करने में सक्षम होना आवश्यक है। जानवरों के साथ सीधे संपर्क में कर्मियों को उपयुक्त पशु प्रयोग पाठ्यक्रम लेना चाहिए था । प्रोटोकॉल के शेष सक्षम प्रयोगशाला सदस्यों द्वारा किया जा सकता है।
विधि का उद्देश्य सेरेब्रल कॉर्टेक्स के सूजन-ट्रिगर डिमाइलेशन का उत्पादन करना है और मानव एमएस की सभी विशेषताओं को पुन: पेश नहीं करताहै (उदाहरण के लिए,फोकल भड़काऊ सफेद पदार्थ घावों की घटना, जो मानव एमएस की एक पहचान है)।
The authors have nothing to disclose.
लेखक मेडिकल यूनिवर्सिटी ग्राज़ में इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल रिसर्च के सभी कर्मियों को उनकी मदद और सहयोग के साथ-साथ पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग के लिए क्रिस्टोफर जॉन राइटन का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।
Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) | |||
Fentanyl | Hameln pharma plus, Germany | as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml | |
Midazolam | ERWO Pharma, Austria | 50039017 | 5 mg/ml |
Medetomidin | Orion Pharma, Finland | as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml | |
Flumazenil | Roche, Switzerland | 0.1 mg/ml | |
Atipamezol | Orion Pharma, Finland | as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml | |
10% povidone-iodine complex | Mundipharma, Austria | ||
Dental cement | Heraeus Kulzer, Germany | 6603 7633 | |
Physiological saline solution | Fresenius Kabi, Austria | 0.9% NaCl | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Germany | P3813 | |
Isofluorane | AbbVie, Austria | ||
Lubricating eye drops | Thea Pharma, Austria | ||
70% EtOH | Merck, Germany | 1070172511 | Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v |
2.5% enrofloxacin | Bayer, Germany | Prophylactic antibiotics | |
carprofen | Pfizer, USA | Painkillers, 50 mg/ml | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich, Germany | P9416 | |
Pentobarbital | Richter Pharma, Austria | pentobarbital sodium, 400 mg/ml | |
Interferon gamma | PeproTech, USA | 400-20 | |
Tumor necrosis factor alfa | R&D Systems, USA | 510-RT-050/CF | |
rMOG1-125 | own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden | Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA | |
Anti-MOG antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka |
Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich, Germany | F5506 | |
Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Germany | A9576 | |
Peroxidase substrate solution | Vector Laboratories, USA | SK-45000 | |
Stereotactic frame | David Kopf Instruments, USA | ||
Catheters, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8IC315GPKXXC | |
Dummy cannulas | PlasticsOne, USA | 8IC315DCNSPC | |
Plastic screws, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8L080X093N01 | |
Connector cannula | PlasticsOne, USA | 8IC313CXSPCC | |
Screw driver with 2mm tip-size | |||
Drill with flexible shaft extension | Proxxon, Germany | NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620, | |
Drill bit, round, 0.5 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF310 104 001 001 009 | |
Drill bit, twisted, 1.3 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF350 104 417 364 013 | |
Scalpel | Braun, Germany | BB510 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools, Germany | 91003-12 | |
Cotton tip applicator | Henry Schein Medical, Austria | 900-3155 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools, Germany | 14101-14, 14088-10 | |
Surgical forceps | Fine Science Tools, Germany | 11002-12, 11251-35 | |
Bulldog clamps | Fine Science Tools, Germany | 18050-35 | |
Homoeothermic blanket | TSE systems, Germany | ||
Infrared Lamp | Beurer, Germany | 616.51 | |
Dental curing light | Guilin Woodpecker Medical, China | ||
Absorbable suture | Johnson & Johnson, Belgium | V792E | |
Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | AL-1000 | |
Exam gloves | |||
Surgical gown | |||
Electric Shaver | Aesculap, Germany | GT420 | |
Volatile anesthetic vaporizer | Rothacher Medical, Switzerland | CV 30-301-D | |
Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer | Air Liquide, Austria | 19,113 | |
Volatile anesthesia chamber | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0347 | |
Anesthesia mask for rats | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0307-A | |
1 ml syringe | Codan, Denmark | REF 62.1612 | |
26 Gauge needle for injection | Braun, Germany | 4657683 | |
20 Gauge needle for cytokine injection and immunization | Braun, Germany | 4657519 | |
Luer lock tip glass syringes | Poulten & Graf, Germany | 7.140-37 | |
3 way stopcock | Becton Dickinson, Sweden | 394600 | |
96-well plate | Thermo Fisher Scientific, USA | 442404 | |
Plate reader | Cole-Parmer, USA | EW-1396-00 | |
37°C incubator | Kendro, Germany | 50042301 | |
Micropipettes | Gilson, USA | F167350 |