Summary
Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Reproduktion einer weit verbreiteten Demyelinisierung der grauen Substanz beider kortikaler Hemisphären bei erwachsenen männlichen Dunklen Agouti-Ratten. Die Methode umfasst die intrazerebrale Implantation eines Katheters, die subklinische Immunisierung gegen Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die intrazerebrale Injektion einer entzündungsfördernden Zytokinmischung durch den implantierten Katheter.
Abstract
Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste immunvermittelte Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) und führt progressiv zu körperlicher Behinderung und Tod, verursacht durch Läsionen der weißen Substanz im Rückenmark und Kleinhirn sowie durch Demyelinisierung in der grauen Substanz. Während herkömmliche Modelle der experimentellen allergischen Enzephalomyelitis für die Untersuchung der zellvermittelten Entzündung in der spinalen und kleinhirnen weißen Substanz geeignet sind, gehen sie nicht auf Pathologien der grauen Substanz ein. Hier stellen wir das experimentelle Protokoll für ein neuartiges Rattenmodell der kortikalen Demyelinisierung vor, das die Untersuchung der pathologischen und molekularen Mechanismen ermöglicht, die zu kortikalen Läsionen führen. Die Demyelinisierung wird durch eine Immunisierung mit niedrig dosiertem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) in einem unvollständigen Freund-Adjuvans induziert, gefolgt von einer kathetervermittelten intrazerebralen Abgabe von entzündungsfördernden Zytokinen. Der Katheter ermöglicht darüber hinaus mehrere Demyelinisierungsrunden, ohne ein injektionsinduziertes Trauma zu verursachen, sowie die intrazerebrale Abgabe potenzieller therapeutischer Medikamente, die einer präklinischen Untersuchung unterzogen werden. Die Methode ist auch ethisch günstig, da Tierschmerzen und -not oder Behinderung kontrolliert und relativ minimal sind. Der erwartete Zeitrahmen für die Implementierung des gesamten Protokolls beträgt ca. 8 - 10 Wochen.
Introduction
MS ist eine immunvermittelte, entzündliche Erkrankung des ZNS, die in erster Linie die Myelinblätter schädigt, aber schließlich zum axonalen Verlust und dauerhaften neuronalen Schäden führt. MS ist die häufigste immunvermittelte Erkrankung des ZNS mit einer geschätzten Prävalenz von etwa 2,3 Millionen Menschen weltweit, so die National MS Society1, und stellt eine große persönliche und sozioökonomische Belastung dar. Das Durchschnittsalter des Krankheitsbeginns beträgt 30 Jahre und führt zum Verlust von produktiven Jahren durch schwere Behinderung. MS ist derzeit unheilbar, und die derzeitigen Behandlungsmodalitäten zielen darauf ab, die Symptome während eines akuten Rückfalls bei schubförmig-remittierender MS zu behandeln und den Krankheitsverlauf zu modifizieren, um die Rückfallhäufigkeit durch immunmodulatorische Therapie zu verringern2,3. Keine Behandlungsoption hat sich bisher als wirksam für die progressiven Typen4erwiesen, mit Ausnahme einer kürzlich durchgeführten klinischen Studie zur B-Zell-depleting-Therapie, die sich bei einer Untergruppe von primär progredienten MS (PPMS)-Patienten mit aktiver Entzündung als wirksam erwiesen hat5. Während mehrere potenzielle genetische6 und Umweltrisikofaktoren7 identifiziert wurden, bleibt die Ätiologie der MS jedoch unbekannt.
MS ist gekennzeichnet durch große entzündliche demyelinierende Plaques in und diffuse Verletzungen der weißen Substanz8,9. Fokale Läsionen wurden mit einem ausgedehnten T-Zell-vermittelten Angriff, Oligodendrozytenzerstörung, reaktiver Astrogliose und axonaler Degeneration in Verbindung gebracht, was zu einem Rückgang der Motoneuronen führte. Demyelinisierung und Atrophie der grauen Substanz haben Anerkennung als zusätzliche histopathologische Merkmale der Krankheiterlangt 9,10,11. Letzteres wurde vorgeschlagen, um zur neurologischen Dysfunktion und zum kognitiven Verfall bei Patienten12,13beizutragen. Drei Muster der kortikalen Demyelinisierung wurden unterschieden, nämlich i) leukokortikal, zusammenhängend mit den Läsionen der weißen Substanz (34%), ii) klein, perivaskulär (16%) und iii) subpial (50%). Im Gegensatz zu fokalen Läsionen der weißen Substanz wurde berichtet, dass diesen Läsionen der grauen Substanz ein T-Zell-vermittelter Angriff fehlt und stattdessen durch eine verstärkte mikrogliale Aktivierung, Apoptose und neuronalen Verlust gekennzeichnet ist12.
Bisher war es nicht möglich, die menschliche MS in einem einzigen Tiermodell zu rekapitulieren, was vor allem auf die Komplexität der Krankheit zurückzuführen ist. Stattdessen wurde eine Vielzahl von MS-Tiermodellen entwickelt, die jeweils verschiedene Aspekte der Krankheitspathogenese und des Fortschreitens simulieren14,15. Aktuelle Tiermodelle ahmen drei verschiedene Krankheitsprozesse nach: i) fokale entzündliche Läsionen, ii) diffuse Verletzung der weißen Substanz und iii) diffuse Pathologie der grauen Substanz.
Tierexperimentelle Studien von MS-Plaques der weißen Substanz wurden hauptsächlich in Nagetier-Enzephalomyelitis-Modellen (EAE) durchgeführt. Versuchstiere werden aktiv mit einer Emulsion immunisiert, die ein Myelin-Antigen [in der Regel Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)16,17, Myelin-Basisprotein (MBP)18oder Proteolipidprotein (PLP)19] enthält, zusammen mit einem vollständigen Freund-Adjuvans (CFA)20. Die Krankheit kann auch passiv durch einen adoptiven Transfer von Myelin-spezifischen T-Zellen induziert werden21. Der Krankheitsverlauf hängt von der verwendeten Antigen/Maus-Stammkombination ab. MOG35-55 in C57BL/6 führt beispielsweise zu einer monophasischen chronischen Erkrankung22,während PLP139-151 bei Schweizer Jim Lambert (SJL)-Mäusen geschlechtsspezifisch zu einem schubförmig-remittierenden Krankheitsverlauf23 führt24. Ratte MOG35-55induziert weiterhin eine enzephalogenische T-Zell-Reaktion, während menschliches MOG35-55 B-Zell-abhängige Entzündungen bei C57BL/6-Mäuseninduziert 25. Verschiedene EAE-Modelle bieten ein hervorragendes Werkzeug, um zellvermittelte Entzündungen hauptsächlich im Rückenmark und Kleinhirn zu untersuchen, aber Vorderhirnstrukturen wie kortex, Corpus callosum und subkortikale Strukturen bleiben weitgehend verschont26. Weder diffuse Verletzungen der weißen Substanz noch die Demyelinisierung der grauen Substanz werden zudem in den EAE-Modellen26,27adäquat repliziert. Kortikale Demyelinisierung im Zusammenhang mit aktiver EAE-Induktion wurde bei Weißbüschelaffen28,29 und in bestimmten Lewis-Ratten-Unterstämmen berichtet, im letzteren Fall auf die vorherrschenden Kombinationen von MHC-Isotypen der Klasse I und Klasse II und Allele30zurückzuführen.
Das Cuprizon-Modell31 ist ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der diffusen Demyelinisierung der weißen Substanz und der Pathologie der grauen Substanz mit einer umfangreichen Demyelinisierung der kortikalen, subkortikalen32und hippokampalen33 Regionen sowie des Corpus callosum34 und des Caudat-Putamens35. Cuprizon-Intoxikation, die im Prinzip zu einer metabolischen stressinduzierten Apoptose der Oligodendrozyten führt, ahmt einige Merkmale der kortikalen demyelinierenden Läsionen von MS-Gehirnen nach, wie eine Mikroglia-Aktivierung, Astrogliose und einen relativen Mangel an infiltrierenden peripheren Immunzellen. Das Fehlen von neuronaler Apoptose und Thalamatrophie sowie die vollständige Auflösung der Demyelinisierung mit einer robusten Remyelinisierung, die nach Beendigung der diätetischen Cuprizon-Supplementierung beobachtet wurde32,begrenzen jedoch die Verwendung der Cuprizon-Intoxikation als präklinisches MS-Modell. Toxische Demyelinisierung kann auch durch eine fokale Injektion von Lysolecithin oder Ethidiumbromid in die Trakte der weißen Substanz36,37induziert werden, aber diese Methoden werden selten verwendet. Toxische Demyelinisierungsmodelle eignen sich besonders für die Analyse der komplexen Mechanismen der Remyelinisierung, wie z.B. den Bedarf an Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und Astrozyten38,39. Detaillierte Informationen zu EAE und Intoxikationsmodellen finden Sie in zwei aktuellen Bewertungen15,40.
Die Zytokin-induzierte Demyelinisierung wurde ursprünglich entwickelt, um spinale Läsionen der weißen Substanz in EAE41zu untersuchen. Dunkle Agouti (DA) oder Lewis-Ratten werden zunächst durch eine subklinische Immunisierung mit MOG1-125 42, 43oder MOG1-11644 in einem unvollständigen Freund-Adjuvans (IFA) vorbereitet. Im Gegensatz zu klassischen EAE-Modellen zeigen diese grundierten Tiere keine klinischen Symptome fokaler entzündlicher Läsionen im Rückenmark. Stattdessen werden eine Entzündungsreaktion und Demyelinisierung im Gehirn durch eine intrazerebrale Verabreichung einer entzündungsfördernden Zytokinmischung [Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) und Interferon gamma (IFNγ)] erreicht, sobald die Tiere einen stabilen Titer von Anti-MOG-Antikörpern im Blut erreicht haben.
Studien von Merkler et al. 42 und Gardner et al. 44 haben die Wirksamkeit einer subpialen kortikalen Demyelinisierungsinduktion durch eine subklinische MOG-Immunisierung und eine intrazerebrale oder subarachnoidale Zytokininjektion nachgewiesen. Die berichtete Dauer der Demyelinisierung war jedoch zu kurz - eine vollständige Remyelinisierung trat in 14 Tagen oder weniger auf, wodurch das Zeitfenster für pharmakologische Interventionstests begrenzt wurde. Beide Modelle verwenden zudem einen traumatischen Injektionsmodus, der per se ein Injektionstrauma und einen Abbau der Blut-Hirn-Schranke (BBB) verursachen und somit zu einer unkontrollierten Rekrutierung von Entzündungszellen in das Parenchym führen könnte. Beide Studien zeigten außerdem eine Demyelinisierung, die auf einen begrenzten Bereich beschränkt ist, im ipsilateralen Kortex oder in unmittelbarer Nähe der Stelle der Zytokininjektion.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, implantierten wir einen Katheter in den rechten parietalen Kortex von DA-Ratten, wobei sich die Katheterspitze direkt über dem Corpus callosum befand. Um eine vollständige Wiederherstellung der BBB-Integrität zu ermöglichen, wurde den Tieren eine Ruhezeit von 2 Wochen nach der Katheterimplantation gewährt. Anschließend wurden die Ratten subklinisch mit 5 μg rekombinantem MOG1-125 in IFA immunisiert. Nach Erreichen eines stabilen Anti-MOG-Antikörpertiters nach ca. 4 Wochen wurden innerhalb von 10 min mit einer programmierbaren Spritzenpumpe 2 μL Zytokingemisch über den Katheter injiziert. Dieses Verfahren löste in 15 Tagen eine weit verbreitete kortikale Demyelinisierung sowohl der ipsi- als auch der kontralateralen Hirnhemisphäre aus, mit einer partiellen Remyelinisierung etwa 30 Tage nach der Zytokininjektion43. Mehrere Demyelinisierungsphasen könnten darüber hinaus durch die wiederholte Verabreichung entzündungsfördernden Zytokinen durch den Katheter induziert werden, und die globale Hirnatrophie, ein gemeinsames Merkmal progressiver MS-Subtypen45,konnte bereits nach der zweiten Demyelinisierungsphase43induziert werden. Wichtig ist, dass der implantierte Katheter auch verwendet werden könnte, um pharmakologische Eingriffe zu testen.
Das unten beschriebene Protokoll bietet eine detaillierte Erklärung der experimentellen Schritte für eine reproduzierbare Erzeugung einer weit verbreiteten kortikalen Demyelinisierung in beiden Gehirnhemisphären von DA-Ratten unter Verwendung eines intrazerebralen Katheters.
Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden sind vom Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung zugelassen; Lizenznummer: 66.010/0132-WF/V/3b/2014). Die erwachsenen männlichen DA-Ratten (10 - 12 Wochen) wurden in einem 12/12 h Hell/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.
1. Materialaufbereitung
HINWEIS: Die Operation wird unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Stellen Sie vor dem Start sicher, dass alle chirurgischen Instrumente einschließlich der Bohrer mit einem geeigneten Desinfektionsmittel gereinigt werden.
- Bereiten Sie eine Anästhesiemischung vor: 0,02 mg / ml Fentanyl, 0,4 mg / ml Midazolam und 0,2 mg / ml Medetomidin (Endkonzentrationen in der Mischung).
HINWEIS: Siehe den entsprechenden Diskussionsabschnitt für alternative Anästhetika. - Bereiten Sie eine Gegenmittelmischung vor: 0,07 mg / ml Flumazenil und 0,42 mg / ml Atipamezol (Endkonzentrationen in der Mischung).
- Montieren Sie den Katheter und die Katheterkappe mit dem Einlass und der Schraube. Schneiden Sie den Katheter mit einem Skalpell auf eine Länge von 2 mm (Abbildung 1).
HINWEIS: Verwenden Sie dafür keine Schere, da sie die kreisförmige Querschnittsform der Katheterspitze zusammendrücken und verzerren.
2. Chirurgische Vorbereitung
- Betäubung der Ratte durch intraperitoneale (i.p.) Verabreichung der Anästhesiemischung (1,5 ml/kg Körpergewicht).
- Rasieren Sie den Kopf der Ratte zwischen den Ohren mit dem Elektrorasierer. Legen Sie eine homöotherme Decke auf den stereotaktischen Rahmen, bevor Sie das Tier positionieren, um Unterkühlung während der gesamten Operation zu vermeiden.
- Immobilisieren Sie den Rattenkopf im stereotaktischen Rahmen mit den Ohrbügeln und der Bissplatte, um sicherzustellen, dass der Kopf horizontal und stabil ist. Überprüfen Sie die Stabilität, indem Sie mit dem Finger oder einer Pinzette Druck auf den Schädel ausüben.
HINWEIS: Eine lose Fixierung und nicht horizontale Positionierung innerhalb des stereotaktischen Rahmens kann zu einer Abweichung von den beabsichtigten Koordinaten führen. - Tragen Sie schmierende Augentropfen auf, um Hornhauttrockenheit während der Operation zu verhindern. Bedecken Sie die Augen mit einem undurchsichtigen Material, um eine chirurgische Lichteinwirkung zu verhindern.
- Reinigen Sie den rasierten Bereich, indem Sie abwechselnd 70% Ethanol und 10% Povidon-Jod-Komplex auftragen.
HINWEIS: Befolgen Sie alle Vorsichtsmaßnahmen während der Operation, um eine Infektion zu vermeiden. Die Operation wird unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Wenn die Asepsis gebrochen ist, muss das kontaminierte Material ersetzt werden.
3. Katheterimplantation
- Machen Sie einen Längsschnitt von etwa 2 cm Länge in der Mitte der Kopfhaut. Verwenden Sie Bulldoggenklemmen, um die Haut an den Seiten abzuhalten. Eine Übersicht über diese Schritte finden Sie in Abbildung 2.
- Entfernen Sie das Blut mit einem Applikator mit Baumwollspitze.
- Entfernen Sie das Schädelperiost. Reinigen Sie das Gewebe mit dem Baumwollspitzen-Applikator und legen Sie den Schädelknochen frei. Lassen Sie den Schädel ca. 1 min trocknen.
- Identifizieren Sie die anatomischen Orientierungspunkte, Lambda, Bregma und mediale Naht. Wenn der Bohrer auf dem stereotaktischen Rahmen installiert ist, positionieren Sie die Bohrspitze am Bregma als Ausgangspunkt. Bewegen Sie sich 2 mm posterior von der Bregma und bewegen Sie ~2,4 mm seitlich zur medialen Naht.
- Bohren Sie an dieser Stelle ein Loch mit einem Durchmesser von 0,5 mm für den Katheter. Knochenstaub vorsichtig wegblasen.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Dura mater während der Bohrung intakt bleibt. Um dies zu gewährleisten, verwenden Sie 1) einen Bohrer, der auf dem stereotaktischen Rahmen installiert werden kann, 2) inspizieren Sie das Loch häufig während des Bohrens und 3) bohren Sie in kleinen Schritten - wenn zu viel Druck auf den Schädel ausgeübt wird, wird die Bohrspitze fortgesetzt und das Gehirn beschädigt, wenn der Schädel vollständig durchdrungen ist. - Bohren Sie 3 weitere Löcher (~1,3 mm Durchmesser) für die Ankerschrauben wenige Millimeter vom ersten Loch entfernt. Knochenstaub vorsichtig wegblasen.
HINWEIS: Wählen Sie Ankerschraubenpositionen, die genügend Platz für die Katheterplatte (~ 2 mm Durchmesser) und die Ankerschraubenverschlüsse (~ 1 mm) bieten. - Entfernen Sie den Knochenstaub durch Bewässerung mit ca. 1 - 2 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder physiologischer Kochsalzlösung mit einer Spritze. Reinigen Sie den Schädel. Ziehen Sie die Ankerschrauben um 2 - 3 volle Umdrehungen fest.
HINWEIS: Die Ankerschrauben sind notwendig, um den Aufbau zu stabilisieren, indem der Zahnzement und damit der Katheter an Ort und Stelle gehalten werden. Achten Sie beim Anziehen einer Ankerschraube darauf, dass sie nicht leicht abnehmbar ist, indem Sie sie mit einer Zette vorsichtig nach oben heben. Da die Implantation des Katheters selbst ein Gewebetrauma verursacht, führt eine zusätzliche Dura-Verletzung beim Bohren oder Anziehen der Ankerschrauben zu mehreren traumatischen Verletzungen und behindert möglicherweise die Vergleichbarkeit innerhalb einer Gruppe. Ziehen Sie zuerst die Ankerschrauben fest und setzen Sie den Katheter zuletzt ein. - Führen Sie den 2 mm langen Katheter durch das erste Loch senkrecht zur Schädeloberfläche ein. Während Sie den Katheter noch halten, tragen Sie ein wenig Zahnzement auf und lassen Sie ihn mit einer kurzen (~ 5 s) Exposition gegenüber dem Zahnhärtungslicht polymerisieren, um den Katheter zu stabilisieren, so dass im nächsten Schritt beide Hände verwendet werden können.
VORSICHT: Vermeiden Sie bei der Arbeit mit einem Zahnhärtungslicht den direkten Blick auf die Spitze oder auf das vom Anwendungsbereich reflektierte Licht, da die hohe Intensität dieses Lichts Netzhautschäden verursachen kann. Verwenden Sie eine geeignete Schutzbrille. - Tragen Sie mehr Dentalzement um den Katheter auf, verankern Sie die Schrauben und verfestigen Sie den Zahnzement mit dem Zahnhärtungslicht (~ 15 - 30 s). Bestätigen Sie die Aushärtung des Zements mit der Spitze einer Zette.
4. Schließen der Wunde und Antagonisierung der Anästhesie
- Schließen Sie die Kopfhaut mit resorbierbaren Nähten, vorder und hinter dem Katheter.
HINWEIS: Da es am Ende der Implantation zu einem holprigen Aufbau über dem Schädel wird, führen Sie den Wundverschluss entsprechend durch. Wenn Sie die Haut zu sehr anheben, führt dies zu Beschwerden für das Tier. - Injizieren Sie die Gegenmittelmischung subkutan (1,5 ml/kg Körpergewicht) mit einer 1-ml-Spritze mit einer 26-G-Nadel.
- Verabreichung von Enrofloxacin (2,5%) durch subkutane Injektion (7,5 mg/kg Körpergewicht) zur prophylaktischen Antibiotikabehandlung. Carprofen (1 mg/ml; 5 mg/kg Körpergewicht) und Buprenorphin (1,2 mg/kg) zur Schmerzlinderung durch subkutane Injektion verabreichen.
5. Nachsorge und Medikation
- Bringen Sie das Tier in den modifizierten Käfig zurück und halten Sie es 1 - 3 h unter Beobachtung, wobei Infrarotlicht aufweicht, um Unterkühlung zu vermeiden. Beobachten und positionieren Sie das Tier alle 5 bis 10 Minuten bis zur postoperativen Genesung. Achten Sie besonders darauf, eine ständige Lichteinwirkung der Augen bis zur Genesung zu vermeiden.
- Wiederholen Sie die Verabreichung von Enrofloxacin (7,5 mg/kg Körpergewicht) und Carprofen (1 mg/ml; 5 mg/kg Körpergewicht) durch subkutane Injektionen am Tag nach der Operation. Buprenorphin ist nicht notwendig, um aufgefrischt zu werden, da die vorherige Behandlung für 72 Stunden wirksam ist.
6. Herstellung der Impfmischung (frühestens 14 Tage nach Katheterimplantation)
Hinweis: Legen Sie die Spritzen während der Zubereitung auf Eis.
- Verbinden Sie zwei 10 mL Luer Lock Tip Glasspritzen mit den kurzen Armen eines 3-Wege-Absperrhahns und schließen Sie den dritten Auslass mit dem langen Arm.
- Stellen Sie sicher, dass die Verbindungen sicher und leckagefrei sind: Geben Sie ca. 4 ml steriles PBS in die offene Spritze, während Sie Kolben 2 halten. Setzen Sie Kolben 1 ein und schieben Sie beide Kolben hin und her, während Sie nach Leckagen suchen. Wenn keine Leckage auftritt, entsorgen Sie das PBS und entfernen Sie Kolben 1 wieder.
- 1 mL IFA und 50 μg rMOG1-125 zusammen pipetten und die Mischung mit sterilem PBS (pH 7,4) in einem geeigneten Röhrchen auf ein Endvolumen von 2 ml einstellen.
HINWEIS: Aufgrund von Emulsionsverlusten an den Spitzen oder Wänden von Spritzen während der Zubereitung ein größeres Volumen vorbereiten, als für die Verabreichung vorgesehen ist. Ähnlich praktisch ist es, sich auf mehr als 1 Tier gleichzeitig vorzubereiten. - Die verdünnte IFA- und rMOG1-125-Mischung wird in die offene Spritze gegeben. Setzen Sie den Kolben vorsichtig ein, während ein loser Druck auf den gegenüberliegenden Kolben aufrechterhalten wird (Abbildung 3A).
- Emulgieren Sie das Inokum, indem Sie es von einer Spritze zur anderen treiben, indem Sie die Kolben hin und her schieben, bis es weiß und viskos ist (Abbildung 3B).
- Befestigen Sie eine 1 ml Luer Lock Spritze am offenen kurzen Arm des 3-Wege-Absperrhahns und füllen Sie ihn mit Inokum (Abbildung 3C). Verteilen Sie alle Inokum auf 1 ml Spritzen. Halten Sie es bis zur Injektion auf Eis. Verabreichen Sie die Mischung am Tag der Zubereitung.
7. Immunisierung
- Betäuben Sie die Ratte mit Isofluoran in einer Kammer (~ 2 min, gemischt mit Sauerstoff 2 L / min) und halten Sie dann die Anästhesie durch eine Maske (gemischt mit Sauerstoff 1,5 L / min) aufrecht.
- 200 μL Inokulum subkutan an der Schwanzbasis mit einer 21 G Nadel injizieren.
HINWEIS: Verabreichen Sie die Injektion langsam, da die Lösung viskos ist.
8. Bestimmung von Antikörpertitern
- Entnehmen Sie ~200 μL Blut 4 Wochen nach der Immunisierung, um die Anti-MOG-Antikörpertiter zu bestimmen.
- Beschichten Sie die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit MOG (5 μg/ml in PBS) und inkubieren Sie sie für 1 h bei 37 °C.
- Blockieren Sie die Platte mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 1 h bei Raumtemperatur.
- Die Platte mit Rattenserum (1:50) inkubieren und für 2 h bei 37 °C standardieren. Waschen Sie die Platte 3x mit 200 μL PBS/Polysorbat 20.
- Inkubieren Sie die Platte mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Antiratten-IgG-Sekundärantikörpern (1:10.000). Waschen Sie die Platte 3x mit 200 μL PBS/Polysorbat 20.
- Fügen Sie 100 μL Peroxidase-Substratlösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie sie für 20 - 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
- Messen Sie die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 405 nm und berechnen Sie den Antikörpertiter aus der optischen Dichte mit einer Standardkurve.
9. Intrazerebrale Zytokin-Injektion
- Stellen Sie die Länge der Anschlusskanüle (2 mm) ein. (Die Vorbereitungsschritte finden Sie in Abbildung 4.)
- Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit der Zytokinmischung (500 ng/μL TNF-alpha, 300 U/μL rekombinantes Ratten-IFN-gamma in sterilem PBS). Schließen Sie die Spritze an eine Anschlusskanüle an. Füllen Sie die Kanüle mit der Zytokinmischung. Vermeiden Sie Blasen.
- Montieren Sie die Spritze auf die programmierbare Spritzenpumpe und programmieren Sie sie so, dass sie 0,2 μL/min injiziert(Abbildung 5A). Starten Sie die Pumpe und halten Sie sie am Laufen, um eine Luftblasenbildung an der Spitze der Kanüle zu vermeiden.
HINWEIS: Die Einspritzgeschwindigkeit muss den Innendurchmesser der verwendeten Spritze berücksichtigen; Dabei muss der Spritzendurchmesser beim Pumpenaufstellen registriert werden. - Betäuben Sie die Ratte mit Isofluran in einer Kammer (~ 2 min, gemischt mit 2 L / min Sauerstoff) und halten Sie dann die Anästhesie durch eine Maske (gemischt mit 1,5 L / min Sauerstoff) aufrecht(Abbildungen 5B und 5C). Tragen Sie schmierende Augentropfen auf, da das Tier mindestens 30 Minuten lang betäubt wird.
- Entfernen Sie die Katheterkappe mit dem Einlass. Setzen Sie die Anschlusskanüle in den Katheter ein und schrauben Sie sie ein und ziehen Sie sie fest (Abbildungen 5D und 5E).
HINWEIS: Nicht zu fest anschnädiger, da dadurch die obere Spitze des Katheters zerstört wird. - Lassen Sie die Injektion 10 Minuten lang beginnen (das Gesamtvolumen der Injektion beträgt 2 μL). Stoppen Sie die Pumpe. Lassen Sie die Kanüle 20 Minuten im Katheter, damit das injizierte Volumen vollständig diffundieren kann.
- Schrauben Sie die Anschlusskanüle ab und entfernen Sie sie langsam, um einen Vakuumeffekt zu vermeiden.
- Befestigen Sie die Katheterkappe wieder mit dem Einlass und schrauben Sie sie. Lassen Sie das Tier sich von der Anästhesie in einem Käfig erholen.
Representative Results
Die kortikale Demyelinisierung konnte zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer Zytokininjektion durch Immunhistochemie für Proteolipidprotein (PLP) beurteilt werden (Abbildung 6). Abbildung 6A zeigt eine intakte PLP-Immunreaktivität am Tag 15 bei einem MOG-immunisierten Kontrolltier, das nur steriles PBS über den implantierten Katheter erhielt. Bereits am Tag 1 nach der Zytokininjektion konnte bei MOG-primeten Tieren eine Demyelinisierung nachgewiesen werden, allerdings nur in unmittelbarer Nähe des katheterisierten Bereichs (Abbildung 6B). Die PLP-Immunreaktivität bleibt im kontralateralen Kortex 1-tägige Postzytokininjektion intakt. An Tag 3 konnte ein allmählicher Anstieg des Verlustes der PLP-Immunreaktivität beobachtet werden, die sich im ipsilateralen Kortex ausbreitet (Abbildung 6C). Kontralaterale kortikale Demyelinisierung konnte auch an Tag 3 nachgewiesen werden (Abbildung 6D), ist jedoch eher auf den Bereich unter den Ankerschrauben beschränkt, möglicherweise aufgrund eines durch die Ankerschrauben verursachten Bereichs mit geringem Durchfluss von Interstitialflüssigkeit43. Das Fehlen einer ähnlichen Beobachtung bei den PBS-injizierten Kontrolltieren schließt die Möglichkeit einer traumainduzierten Demyelinisierung durch die Ankerschraube aus.
Zwischen den Tagen 9 - 15 betrifft die Demyelinisierung große Teile des Kortex beider Hemisphären (Abbildungen 6E, 6Fund 6G). Dies fällt mit einer Beobachtung langsamen Verhaltens zusammen, jedoch ohne eine statistisch signifikante Abnahme der motorischen Fähigkeiten in einem Rotarod-Test43. Die kortikale Demyelinisierung wird bis zu 30 Tage nach der Zytokininjektion in beiden Hemisphären (Abbildungen 6H und 6I) mit nur teilweiser Remyelinisierung aufrechterhalten. Abbildung 6J zeigt eine Quantifizierung des PLP-Verlustes in der kortikalen grauen Substanz nach der intrazerebralen Zytokininjektion. Es sollte beachtet werden, dass die PLP-Immunreaktivität nach Zeiträumen von mehr als 30 Tagen noch nicht beurteilt wurde; Dabei muss die sofortige Auflösung der Remyelinisierung, falls vorhanden, durch weitere Experimente beurteilt werden. Eine zweite Verabreichung der Zytokinmischung durch den implantierten Katheter 30 Tage nach der ersten Injektion führt zu einer ausgeprägten Hirnatrophie am 15. Tag (Abbildung 7).
Abbildung 1: Vorbereitung des Katheters. (A und B) Die Führungskanüle und die Dummykanüle (Katheterkappe mit Einlass) werden montiert und verschraubt. (C) Dann wird der Katheter mit Hilfe eines Skalpells auf 2 mm Größe geschnitten. Die mikroskopische Beobachtung zeigte, dass die Verwendung einer Schere zu diesem Zweck die kreisförmige Form der Kanülenspitze verzerrt und daher vermieden werden muss. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Implantation des Katheters. (A) Die Operation beginnt mit einem Längsschnitt und der Entfernung des Periosts. (B, C) Diese Tafel zeigt die Markierung der Stelle für den Katheter bei 2 mm posterior von Bregma und 2,4 mm seitlich rechts von der sagittalen Naht; sowie die Stellen für die Löcher, die für die drei Ankerschrauben mit einem angemessenen Abstand zum Katheter und Lambda vorgesehen sind. (D) Nach dem Bohren des Katheterlochs (0,5 mm Durchmesser, mit runder Bohrspitze) und der Löcher für die Ankerschrauben (1,3 mm Durchmesser mit verdrehter Bohrspitze) werden die Ankerschrauben angezogen. (E, F) Dann wird der Katheter eingeführt und der gesamte Aufbau mit polymerisierendem Dentalzement stabilisiert. (G) Die Wunde wird mit zwei oder drei Knoten vor und hinter dem Katheter genäht. B = Bregma; L = Lambda; C = Katheter; S1, S2 und S3 = Plätze für die Löcher für die drei Ankerschrauben. Die Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Herstellung der rMOG/IFA-Emulsion. (A) Die Mischung aus rMOG, PBS und IFA wird emulgiert, indem das Inokulum von einer Spritze zur anderen gedrückt wird, indem die Kolben hin und her geschoben werden, (B), bis es weiß und viskos ist. (C) Anschließend wird das Inokum für die Injektion auf 1 ml Spritzen verteilt. 5 μg rMOG werden in 200 μL PBS/IFA-Mischung verwendet, um eine Ratte subklinisch zu immunisieren; Aufgrund der Verluste an den Spitzen und Wänden der Spritzen während der Zubereitung sollte jedoch ein größeres Volumen vorbereitet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Vorbereitung der Anschlusskanüle. (A - D) Diese Paneele zeigen, wie ein Steckverbinder und ein Interner mit einer 2 mm großen Schablonenkanüle zusammengebaut werden. (E) Die Innenhaut wird mit Hilfe eines Skalpells (F) auf die gleiche Größe wie die Führungskanüle geschnitten und die Schabloneführung wird dann abschrauben. (G) Das andere Ende der Anschlusskanüle wird mit einer 20-g-Nadel an einer 1-ml-Spritze befestigt, die die Injektionsmischung enthält. Die Maßstabsbalken = 3 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Intrazerebrale Injektion. (A) Eine programmierbare Spritzenpumpe wird auf eine Injektionsgeschwindigkeit von 2 μL/min eingestellt, und die mit Zytokinmischung (oder sterilem PBS für die Steuerungen) gefüllte 1-ml-Spritze wird an der Pumpe montiert. (B) Das Tier wird zuerst in der Kammer mit 5% Isofluran mit einem Sauerstofffluss von 2 L/min betäubt und dann (C) wird die Anästhesie durch die Maske mit 2,5% Isofluran mit einem Sauerstofffluss von 1,5 L/min aufrechterhalten. (D) Die Katheterkappe mit dem Einlass (der Dummy-Kanüle) wird abgeschraubt und die Injektionskanüle wird durch den implantierten Katheter eingeführt. Da das Volumen der Injektion sehr gering ist, sollte der Prüfarzt vorsichtig sein, um Luftblasen an der Spitze der Kanüle zu vermeiden. Aus diesem Grund ist es wichtig, das Einsetzen zu starten, während die Pumpe in Betrieb ist und nur, wenn sich an der Spitze eine wachsende Flüssigkeitsblase befindet. Das zusätzliche Volumen geht sowieso nicht ins Gehirn, da es vor dem Einsetzen auf dem Katheter zusammenbricht. (E) Dann wird die Anschlusskanüle angezogen und die Pumpe wird für 10 minuten in Betrieb gelassen. Nach 10 Minuten Injektion wird die Pumpe gestoppt und die Kanüle wird für 15 - 20 Minuten drinnen gelassen, um die Diffusion des injizierten Volumens in die interstitielle Flüssigkeit zu ermöglichen. Die Maßstabsbalken = 5 cm, sofern nicht anders angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: PLP-Immunreaktivität in koronalen Hirnabschnitten. (A) Dieses Panel zeigt ein Kontrollgehirn (MOG-primed) mit einer PBS-Injektion (Tag 15), die nicht zu einer kortikalen Demyelinisierung führt. (B) Bereits am Tag 1 nach der Zytokininjektion ist eine Demyelinisierung im Katheterbereich erkennbar. (C) Ein breiterer Verlust der PLP-Immunreaktivität wird im ipsilateralen Kortex an Tag 3, (D) sowie auf der kontralateralen Seite beobachtet. Ein weit verbreiteter Verlust der PLP-Immunreaktivität wird in beiden Hemisphären am Tag 15 beobachtet, da (E) dieses Panel den ipsilateralen Kortex und (F) dieses Panel den kontralateralen Kortex zeigt. (G) Ein Überblick über beide Hemisphären wird gegeben, um den weit verbreiteten Verlust von PLP am Tag 15 zu zeigen. An Tag 30, wie (H) dieses Panel den ipsilateralen Kortex zeigt und (I) dieses Panel für kontralateralen Kortex zeigt, gibt es immer noch eine bemerkenswerte Demyelinisierung, aber auch einige remyelinierte Bereiche konnten beobachtet werden. (J) Dieses Panel zeigt die Quantifizierung der Demyelinisierung (PLP-Verlust in mm2/Hemisphäre). Für den PLP-Nachweis mit MS Anti-PLP mit einem Verdünnungsfaktor von 1:500 wurden 1,5 - 2 μm koronale Hirnschnitte verwendet. Die Abschnitte wurden mit Hämatoxylin für Zellkerne gegengefärbt. Detaillierte Informationen zur Immunhistochemie finden Sie unter Ucal et al. 43. Panel G und J wurden von Ucal et al. 43. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Hirnatrophie nach zweiter Zytokininjektion. (A) Dieses Panel zeigt ein Kontrollgehirn (MOG-grundiert) mit einer PBS-Injektion (Tag 15). (B) Am 15. Tag nach der ersten Zytokininjektion führt eine zweite Injektion innerhalb von 15 Tagen zu hirnschwund. Für den PLP-Nachweis mit MS Anti-PLP mit einem Verdünnungsfaktor von 1:500 wurden 1,5 - 2 μm koronale Hirnschnitte verwendet. Die Abschnitte wurden mit Hämatoxylin für Zellkerne gegengefärbt. Ausführliche Informationen zur Immunhistochemie finden Sie unter Blakemore37. Die Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Modifizierte Käfige, um die Katheterentfernung durch das Tier zu verhindern. In den Standardkäfigen befindet sich der Futterhalterraum auf dem Gitter näher am Käfigboden, wodurch ein riskanter enger Raum entsteht, der die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass sich der Katheter mit dem Gitter verheddert und dadurch entfernt. Um dies zu vermeiden, muss der Käfig modifiziert werden. Dieser enge Raum wurde mit einer transparenten Ebene blockiert, die die Beobachtung des Tieres ermöglichte. Das Futter muss in diesen modifizierten Käfigen im Käfig abgegeben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Unsere Methode verwendet DA-Ratten. Die Anpassung an Mäuse erfordert wahrscheinlich die Verwendung eines kleineren Katheters und Schrauben. Es sollte auch berücksichtigt werden, dass der Krankheitsverlauf, die Entzündungsreaktion und das Ausmaß der Demyelinisierung von dem abweichen können, was hier dargestellt wird, wenn eine andere Spezies / ein anderer Stamm verwendet wird. Solche Unterschiede wurden mit klassischen EAE-Modellen mit verschiedenen Mäusestämmen beobachtet. MOG92-106 von Rattenursprung führte beispielsweise bei A.SW-Mäusen zu primär progredienter oder sekundär progredienter EAE, während es bei SJL/J-Mäusen schubförmig-remittierende EAE induzierte46. Daher sollten Tiere der gleichen Sorte verwendet werden. Geschlechtsspezifische Unterschiede in der EAE-Manifestation wurden auch in verschiedenen früheren Studien berichtet24. Das Auftreten solcher Gender-Effekte ist für das hier beschriebene Protokoll durchaus zu erwarten, muss aber noch in weiteren Experimenten validiert werden.
Die intraperitoneale (IP) Verabreichung einer Anästhesiemischung, die 0,02 mg/ml Fentanyl, 0,4 mg/ml Midazolam und 0,2 mg/ml Medetomidin umfasst, wird für den chirurgischen Eingriff verwendet. Erwachsene männliche DA-Ratten mit einem Gewicht von 270 - 300 g benötigen etwa 0,4 - 0,6 ml dieser Mischung(d.h.~ 1,5 ml / kg), um eine Anästhesie von 60 - 90 minuten zu induzieren. Nach der Operation wird die Anästhesie durch eine subkutane Injektion eines Gegenmittels antagonisiert, das 0,07 mg / ml Flumazenil und 0,42 mg / ml Atipamezol in physiologischer Kochsalzlösung (0,9% NaCl) enthält. Eine Dosis von 1 - 1,5 ml/kg antagonisiert die Anästhesie innerhalb von 5 min. Alternativ können die Tiere bei einem physiologischen Auswaschen der Betäubungsmittel spontan aufwachen, aber in diesem Fall müssten die Tiere unter Beobachtung gehalten werden, bis sie bei vollem Bewusstsein sind.
Andere Anästhesieoptionen, die häufig für Tieroperationen verwendet werden, wie eine IP-Injektion von Ketamin und Xylazin47 oder Natriumpentobarbital48oder eine Inhalation flüchtiger Anästhetika wie Isofluoran49 und Halothan50,können ebenfalls für die hier vorgestellte Operation in Betracht gezogen werden. Es ist jedoch wichtig, ein Anästhetikum zu wählen, das die beabsichtigten nachgelagerten Eingriffe nicht stört.
Während der Immunisierung und intrazerebralen Zytokininjektion werden 5% Isofluran für die Anästhesie verwendet. Das hier beschriebene Modell wurde mit Ratten erstellt, und die aufgeführten experimentellen Details sind daher speziell auf die Ratte anwendbar. Die Katheterimplantationskoordinaten wurden ausgewählt, um die gleichzeitige Analyse möglicher Veränderungen der weißen Substanz (die Katheterspitze im Corpus callosum) zu ermöglichen. Während die Kathetereinführungsstelle in Bezug auf die anteroposteriore und laterale Position variiert werden kann, erfordert die Auswahl des zentralen Sulcus die Vermeidung von Schäden an der Sinus sagittalis superior.
Ein weiteres Merkmal des beschriebenen Verfahrens ist die äquivalente Demyelinisierung sowohl der ipsi- als auch der kontralateralen Hemisphären, die möglicherweise durch den Transport des injizierten Zytokingemisches in den Subarachnoidalraum durch den physiologischen Fluss der interstitiellen Flüssigkeit aus kortikalen Regionenresultiert 51. Der Injektionsmodus und nicht die Lage des Katheters verursacht daher eine Demyelinisierung in der gesamten Großhirnrinde, und die Wahl des rechten oder linken parietalen Kortex sollte daher in dieser Hinsicht unerheblich sein.
Das Protokoll verwendet einen 26-G-Katheter, der klein genug ist, um umfangreiche traumatische Verletzungen zu vermeiden, und groß genug, um eine erhöhte Verstopfungsrate der Katheterspitze über den langen Verlauf des Experiments zu vermeiden. Sicherlich verursachen die Implantation und das Vorhandensein des Katheters selbst eine astrozytische und mikroglialen Aktivierung, auch bei den Kontrolltieren, die nur die Katheterimplantation erhalten; Dies ist jedoch im Vergleich zu den zytokininjizierten Tieren gering. 43 Um Störungen bei späteren Analysen zu vermeiden, verwendeten wir MRT-kompatible Katheter aus Polyether-Ether-Keton (PEEK).
Eine ähnliche Tiefe der Demyelinisierung wird tatsächlich sowohl im ipsi- als auch im kontralateralen Bereich mit der vorgestellten Methode erzeugt. Dies bedeutet, dass die Kathetertiefe / -länge möglicherweise keine große Rolle im Muster und Ausmaß der Demyelinisierung im Kortex spielt. Daher könnte eine Modifikation der Katheterlänge in Betracht gezogen werden, um die katheterinduzierte Läsionsgröße zu reduzieren. Dennoch könnte eine deutlich kürzere Katheterlänge zu einer etwas weniger ausgeprägten kortikalen Demyelinisierung führen, während eine schlüssige Antwort nur durch Experimente erhalten würde, die speziell auf die Katheterlänge testen.
Ein Vorteil des Modells besteht darin, dass der implantierte Katheter die Prüfung potenzieller Therapeutika ermöglicht, die dem Kortex über den Katheter verabreicht werden, um eine Remyelinisierung am oder nach dem Höhepunkt der histologisch nachweisbaren kortikalen Demyelinisierung (Tag 15 oder später) zu ermöglichen, während dies in einer Vorbehandlungseinstellung nach der Immunisierung, aber vor der Zytokininjektion wäre. Die Entscheidung über den Zeitrahmen, in dem Therapeutika verabreicht werden, hängt daher von der jeweiligen Forschungsfrage und dem interessierenden Medikament ab.
Nach der Katheterimplantation ist es wichtig, die Tiere einzeln in den modifizierten (vorzugsweise hohen) Käfigen unterzubringen, um eine Katheterentfernung bis zum Ende der Studie zu vermeiden (Abbildung 8). Tiere können auch die Katheterkappe mit dem Einlass abschrauben, obwohl dies selten vorkommt. Die Tiere sollten täglich beobachtet und die entfernten Kappen durch frische ersetzt werden, um eine Verstopfung der Katheterspitze in Abwesenheit eines Einlasses zu vermeiden und eine genaue Abgabe in das Parenchym nach der intrazerebralen Injektion zu gewährleisten. Die Tiere werden frühestens 2 Wochen nach der Katheterimplantation immunisiert, um die Heilung und schließung der Blut-Hirn-Schranke zu ermöglichen.
Serum-Anti-MOG-Antikörpertiter sollten nach der Immunisierung gemessen werden. Ein Dosis-Wirkungs-Experiment zeigte, dass 5 μg MOG1-125 (in IFA) bei erwachsenen männlichen DA-Ratten innerhalb von 4 Wochen eine ausreichende Immunisierung boten. Ein Titer von 5.000 μg/ml und mehr wäre ausreichend, wird aber sicherlich von mehreren Faktoren abhängen, darunter das MOG-Präparat und der tierexperimentle Belastung und muss daher individuell bestimmt werden. Es ist wichtig, zu hohe Antigendosen zu vermeiden, die möglicherweise zu einem klassischen EAE-Phänotyp mit gelähmten Hintergliedmaßen bereits vor der Zytokininjektion führen.
Jedes Tier wird mit 5 μg rekombinantem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (rMOG1-125)immunisiert, emulgiert in 200 μL unvollständigem Freund-Adjuvans (IFA). Da ein Teil der Emulsion während der Zubereitung in der Spritze verloren geht, ist es ratsam, für jedes Tier mehr als diese Menge vorzubereiten. Wir verwendeten rekombinantes MOG (1-125 aus dem N-Terminus von Ratten-MOG), das in Escherichia coli exprimiert wurde und dann durch Chelatchromatographie bis zur Homogenität gereinigt, in 6 M Harnstoff gelöst und gegen PBS dialysiert wurde, um eine physiologische Zubereitung zu erhalten52,53. Es können aber auch handelsübliche MOG verwendet werden.
Andere Antigenpräparate wie MOG1-116,MOG35-55 oder PLP139-151 werden in verschiedenen EAE-Modellen verwendet, und es ist bekannt, dass Antigen- und Tierstammunterschiede in diesen Modellen unterschiedliche Krankheitsphänotypen induzieren20. Diese Antigenpräparate wurden nicht an DA-Ratten getestet und könnten, wenn sie bevorzugt zu rMOG1-125verwendet werden, einen Krankheitsphänotyp oder histologische Ergebnisse induzieren, die sich von dem unterscheiden, was hier vorgestellt wird.
Vor der intrazerebralen Injektion wird eine Verbindungskanüle von der gleichen Länge wie der Katheter vorbereitet. Dies kann durch Zusammenbau mit einem Schablonenkatheter und Schneiden auf die gleiche Größe (2 mm Länge) erfolgen (Abbildung 4). Es ist wichtig, dass die Anschlusskanüle während der Zytokininjektion luftblasenfrei ist - da das Injektionsvolumen nur 2 μL beträgt, wird selbst eine winzige Luftblase an der Kanülenspitze das Volumen der erfolgreich in das Gehirn abgegebenen Flüssigkeit signifikant reduzieren. Dies wird erreicht, indem die Pumpe am Laufen gehalten und die Kanüle nur dann eingesetzt wird, wenn ein wachsender Tropfen Injektionsflüssigkeit an der Spitze vorhanden ist. Nach dem Einsetzen der Kanüle wird der Stecker mit dem Katheter verschraubt, wobei ein übermäßiges Anfahren vermieden wird, um die obere Spitze des Katheters nicht zu beschädigen, was eine Zusammenfassung nach der Injektion erschwert. Eine Injektionsgeschwindigkeit von 0,2 μL/min wird verwendet, um injektionsinduzierte Traumata zu vermeiden. Darüber hinaus sorgt eine langsame Injektion, kombiniert mit einer Wartezeit von 20 Minuten nach der Injektion, für die Diffusion der injizierten Flüssigkeit in die interstitielle Flüssigkeit und einen effektiven Abfluss in den Liquor. Die Kanüle wird dann langsam entfernt, um einen Vakuumeffekt zu vermeiden.
Die berichtete Methode umfasst einen chirurgischen Eingriff und erfordert daher Personal, das in der Lage ist, stereotaktische Überlebensoperationen durchzuführen. Personal, das in direktem Kontakt mit den Tieren ist, sollte die entsprechenden Tierversuchskurse belegt haben. Der Rest des Protokolls kann von kompetenten Labormitgliedern durchgeführt werden.
Das Verfahren soll eine entzündungsbedingte Demyelinisierung der Großhirnrinde erzeugen und reproduziert nicht alle Merkmale der menschlichen MS(z.B.das Auftreten von fokalen entzündlichen Läsionen der weißen Substanz, die ein Kennzeichen der menschlichen MS ist).
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts für Biomedizinische Forschung der Medizinischen Universität Graz für ihre Hilfe und Zusammenarbeit sowie Christopher John Wrighton für das Korrekturlesen des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) | |||
| Fentanyl | Hameln pharma plus, Germany | as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml | |
| Midazolam | ERWO Pharma, Austria | 50039017 | 5 mg/ml |
| Medetomidin | Orion Pharma, Finland | as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml | |
| Flumazenil | Roche, Switzerland | 0.1 mg/ml | |
| Atipamezol | Orion Pharma, Finland | as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml | |
| 10% povidone-iodine complex | Mundipharma, Austria | ||
| Dental cement | Heraeus Kulzer, Germany | 6603 7633 | |
| Physiological saline solution | Fresenius Kabi, Austria | 0.9% NaCl | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Germany | P3813 | |
| Isofluorane | AbbVie, Austria | ||
| Lubricating eye drops | Thea Pharma, Austria | ||
| 70% EtOH | Merck, Germany | 1070172511 | Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v |
| 2.5% enrofloxacin | Bayer, Germany | Prophylactic antibiotics | |
| carprofen | Pfizer, USA | Painkillers, 50 mg/ml | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, Germany | P9416 | |
| Pentobarbital | Richter Pharma, Austria | pentobarbital sodium, 400 mg/ml | |
| Interferon gamma | PeproTech, USA | 400-20 | |
| Tumor necrosis factor alfa | R&D Systems, USA | 510-RT-050/CF | |
| rMOG1-125 | own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden | Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA | |
| Anti-MOG antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich, Germany | F5506 | |
| Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Germany | A9576 | |
| Peroxidase substrate solution | Vector Laboratories, USA | SK-45000 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments, USA | ||
| Catheters, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8IC315GPKXXC | |
| Dummy cannulas | PlasticsOne, USA | 8IC315DCNSPC | |
| Plastic screws, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8L080X093N01 | |
| Connector cannula | PlasticsOne, USA | 8IC313CXSPCC | |
| Screw driver with 2mm tip-size | |||
| Drill with flexible shaft extension | Proxxon, Germany | NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620, | |
| Drill bit, round, 0.5 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF310 104 001 001 009 | |
| Drill bit, twisted, 1.3 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF350 104 417 364 013 | |
| Scalpel | Braun, Germany | BB510 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools, Germany | 91003-12 | |
| Cotton tip applicator | Henry Schein Medical, Austria | 900-3155 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools, Germany | 14101-14, 14088-10 | |
| Surgical forceps | Fine Science Tools, Germany | 11002-12, 11251-35 | |
| Bulldog clamps | Fine Science Tools, Germany | 18050-35 | |
| Homoeothermic blanket | TSE systems, Germany | ||
| Infrared Lamp | Beurer, Germany | 616.51 | |
| Dental curing light | Guilin Woodpecker Medical, China | ||
| Absorbable suture | Johnson & Johnson, Belgium | V792E | |
| Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | AL-1000 | |
| Exam gloves | |||
| Surgical gown | |||
| Electric Shaver | Aesculap, Germany | GT420 | |
| Volatile anesthetic vaporizer | Rothacher Medical, Switzerland | CV 30-301-D | |
| Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer | Air Liquide, Austria | 19,113 | |
| Volatile anesthesia chamber | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0347 | |
| Anesthesia mask for rats | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0307-A | |
| 1 ml syringe | Codan, Denmark | REF 62.1612 | |
| 26 Gauge needle for injection | Braun, Germany | 4657683 | |
| 20 Gauge needle for cytokine injection and immunization | Braun, Germany | 4657519 | |
| Luer lock tip glass syringes | Poulten & Graf, Germany | 7.140-37 | |
| 3 way stopcock | Becton Dickinson, Sweden | 394600 | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, USA | 442404 | |
| Plate reader | Cole-Parmer, USA | EW-1396-00 | |
| 37°C incubator | Kendro, Germany | 50042301 | |
| Micropipettes | Gilson, USA | F167350 |
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