Protokollet som presenteras här tillåter reproduktion av en utbredd grå materia demyelination av båda när halvklot i vuxna manliga Dark Agouti råttor. Metoden består av intracerebral implantation av en kateter, subklinisk immunisering mot myelin oligodendrocyte glykoprotein och intracerebral injektion av en proinflammatorisk cytokinblandning genom implanterad kateter.
Multipel skleros (MS) är den vanligaste immunmedierade sjukdomen i centrala nervsystemet (CNS) och leder gradvis till fysisk funktionsnedsättning och död, orsakad av vita materia organskador i ryggmärgen och lillhjärnan, samt av demyelination i grå materia. Medan konventionella modeller av experimentell allergisk encefalomyelit är lämpliga för undersökning av cellmedierad inflammation i ryggraden och cerebellar vit fråga, misslyckas de med att ta itu med grå materia patologier. Här presenterar vi det experimentella protokollet för en ny råtta modell av när demyelination tillåter undersökning av patologiska och molekylära mekanismer leder till när skador. Demyelinationen framkallas av en immunisering med låg dos myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) i en ofullständig Freunds adjuvans följt av en kateter-medierad intracerebral leverans av proinflammatoriska cytokiner. Katetern möjliggör dessutom flera omgångar av demyelination utan att orsaka injektionsinducerat trauma, liksom intracerebral leverans av potentiella terapeutiska läkemedel som genomgår en preklinisk undersökning. Metoden är också etiskt gynnsam eftersom djursmärta och ångest eller funktionshinder är kontrollerade och relativt minimala. Den förväntade tidsramen för genomförandet av hela protokollet är cirka 8-10 veckor.
MS är en immunmedierad, inflammatorisk sjukdom i CNS, som främst skadar myelinark, men leder så småningom till axonal förlust och permanenta neuronal skada. MS är den vanligaste immunmedlade sjukdomen i CNS med en uppskattad prevalens på cirka 2,3 miljoner människor över hela världen, enligt National MS Society1, och utgör en stor personlig och socioekonomisk börda. Medelåldern för sjukdomen är 30 år och leder till förlust av produktiva år genom att orsaka allvarlig funktionsnedsättning. MS är för närvarande obotlig, och de nuvarande behandlingsmetoderna syftar till att hantera symtomen under ett akut återfall i skovvis förlöpande MS och att ändra sjukdomsförloppet för att minska återfallsfrekvensen genom immunmodulerande terapi2,3. Inget behandlingsalternativ har ännu visat sig vara effektivt för de progressivatyperna 4, med undantag för en nyligen genomförd klinisk studie av B-cells utarmningsbehandling, som visade sig vara effektiv i en undergrupp av primära progressiva MS (PPMS) patienter med aktiv inflammation5. Flera potentiellagenetiska 6 och miljömässigariskfaktorer 7 har identifierats, men ms etiologi är fortfarande okänd.
MS kännetecknas av stora inflammatoriska demyelinating plack i, och diffusa skador på, den vita frågan8,9. Focal organskador har associerats med en omfattande T-cells medierad attack, oligodendrocyte förstörelse, reaktiva astrogliosis och axonal degeneration, vilket leder till en motor neuron nedgång. Grå materia demyelination och atrofi har fått erkännande som ytterligare histopatologiska funktioner i sjukdomen9,10,11. Den senare har föreslagits att bidra till neurologisk dysfunktion och kognitiv nedgång hos patienter12,13. Tre mönster av när demyelination har utmärkts, nämligen i) leukocortical, sammanhängande med vit fråga organskador (34%), ii) små, perivaskulära (16%), och iii) subpial (50%). Till skillnad från focal vit fråga organskador, dessa grå fråga organskador har rapporterats sakna en T-cells medierad attack och kännetecknas istället av en förbättrad microglial aktivering, apoptos och neuronal förlust12.
Hittills har det inte varit möjligt att rekapitulera mänskliga MS i en enda djurmodell, till stor del på grund av sjukdomens komplexitet. En mängd olika MS djurmodeller, var och en simulera olika aspekter av sjukdom patogenes och progression har istället utvecklats14,15. Nuvarande djurmodeller efterliknar tre olika sjukdomsprocesser: i) fokala inflammatoriska lesioner, ii) diffus vit materia skada och iii) diffusa grå materia patologi.
Djurstudier av MS white matter plack har mestadels utförts i modeller av gnagare encefalomyelit (EAE). Försöksdjur immuniseras aktivt med en emulsion som innehåller ett myelinantigen [vanligtvis myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG)16,17, myelin basprotein (MBP)18, eller proteolipidprotein (PLP)19], tillsammans med en komplett Freunds adjuvans (CFA)20. Sjukdomen kan också passivt induceras genom en adoptivöverföring av myelinspecifika T-celler21. Sjukdomskursen beror på kombinationen av antigen/musstam som används. MOG35-55 i C57BL/6, till exempel, resulterar i en monofasisk kronisksjukdom 22, medan PLP139-151 hos schweiziska Jim Lambert (SJL) möss leder till en skovvis-remittering sjukdom kurs23 på ett könsspecifikt sätt24. Råtta MOG35-55, vidare, inducerar en encefalitogen T-cellsrespons, medan human MOG35-55 inducerar B-cellsberoende inflammation i C57BL/6 möss25. Olika EAE-modeller ger ett utmärkt verktyg för att studera cellmedierad inflammation främst i ryggmärgen och lillhjärnan, men förhjärnstrukturer som cortex, corpus callosum och subkortikala strukturer förblir i stort sett skonade26. Varken diffus vit materiaskada eller grå materia demyelination replikeras dessutom tillräckligt i EAE-modellerna26,27. När demyelination i samband med aktiv EAE-induktion har rapporterats i marmosets28,29 och i vissa Lewis råtta sub stammar, i det senare fallet tillskrivas de rådande kombinationerna av MHC klass I och klass II isotyper och alleler30.
Cuprizone modell31 är ett användbart verktyg för att studera diffusa vit materia demyelination och grå materia patologi med en omfattande demyelination av när, sub-cortical32, och hippocampal33 regioner, liksom corpus callosum34 och caudate putamen35. Cuprizonförgiftning, som i princip resulterar i metabolisk stressinducerad apoptos av oligodendrocyterna, efterliknar vissa egenskaper hos de kortikala demyelinating organskador av MS hjärnor såsom en microglia aktivering, astrogliosis och en relativ brist på infiltrera perifera immunceller. Bristen på neuronal apoptos och thalamic atrofi, liksom fullständig upplösning av demyelination med en robust remyelination observeras vid upphörande av kost cuprizonetillskott 32, dock begränsa cuprizon berusning användning som en preklinisk MS modell. Giftig demyelination kan också induceras genom en fokal injektion av lysolecithin eller ethidiumbromid i de vitamateriaorganen 36,37, men dessa metoder används sällan. Giftiga demyelinationsmodeller är särskilt lämpliga för analys av de komplexa mekanismerna för remyelination, såsom kravet på oligodendrocyt stamceller och astrocyter38,39. Detaljerad information om EAE och berusningsmodeller finns i två senaste recensioner15,40.
Cytokin-inducerad demyelination utvecklades ursprungligen för att studera spinal vit fråga organskador i EAE41. Senare modifierades det för att studera när grå materia patologier i MS. Dark Agouti (DA) eller Lewis råttor först primeras av en subklinisk immunisering med MOG1-12542,43 eller MOG1-11644 i en ofullständig Freunds adjuvans (IFA). Till skillnad från klassiska EAE-modeller uppvisar dessa primade djur inte kliniska symtom på fokala inflammatoriska lesioner i ryggmärgen. Istället uppnås ett inflammatoriskt svar och demyelination i hjärnan därefter genom en intracerebral administrering av en proinflammatorisk cytokinblandning [tumörnekrosfaktor alfa (TNFα) och interferon gamma (IFNγ)] när djuren har uppnått en stabil titer av anti-MOG antikroppar i blodet.
Studier av Merkler et al. 42 och Gardner et al. 44 har visat effekten av en subpial när demyelination induktion genom en subklinisk MOG immunisering och en intratrahera eller subarachnoidal cytokin injektion. Den rapporterade varaktigheten av demyelinationen var dock alltför kort-en fullständig remyelination inträffade i 14 dagar eller mindre, vilket begränsar fönstret för eventuella farmakologiska intervention testning. Båda modellerna använder dessutom en traumatisk injektion modus, som i sig kan orsaka en injektion trauma och en blod-hjärnbarriär (BBB) nedbrytning och därmed leda till en okontrollerad rekrytering av inflammatoriska celler i parenkym. Båda studierna visade dessutom demyelination som är begränsad till ett begränsat område, i den ensidiga cortex, eller i närheten av platsen för cytokin injektion.
För att övervinna dessa begränsningar implanterade vi en kateter i rätt parietal cortex av DA råttor, med kateterspetsen belägen strax ovanför corpus callosum. För att möjliggöra en fullständig återhämtning av BBB-integriteten tilläts djuren en viloperiod på 2 veckor efter kateterimplantationen. Därefter var råttorna subkliniskt immuniserade med 5 μg rekombinant MOG1-125 i IFA. Efter uppnåendet av en stabil anti-MOG antikroppstiter efter cirka 4 veckor injicerades 2 μL cytokinblandning via katetern inom 10 minuter med hjälp av en programmerbar sprutpump. Detta förfarande framkallade en utbredd när demyelination av både ipsi- och kontralateral cerebrala halvklot i 15 dagar, med en partiell remyelination cirka 30 dagar post-cytokin injektion43. Flera demyelination faser kan dessutom framkallas genom upprepad administrering av pro-inflammatoriska cytokiner genom katetern, och globala hjärnan atrofi, en gemensam egenskap hos progressiva MS subtyper45, kan induceras så tidigt som efter den andra demyelination fas43. Viktigt är att den implanterade katetern också kan användas för att testa farmakologiska ingrepp.
Protokollet som beskrivs nedan ger en detaljerad förklaring av de experimentella stegen för en reproducerbar generation av utbredd när demyelination i båda cerebrala halvklotet av DA råttor med hjälp av en intracerebral kateter.
Vår metod använder DA råttor. Anpassningen till möss kommer sannolikt att kräva användning av en mindre kateter och skruvar. Man bör också komma ihåg att sjukdomsförloppet, det inflammatoriska svaret och omfattningen av demyelination kan skilja sig från vad som presenteras här om en annan art / stam används. Sådana skillnader har observerats med klassiska EAE-modeller med olika stammar av möss. MOG92-106 av råtta ursprung, till exempel, resulterade i primära progressiva eller sekundära progressiva EAE i A.SW möss, medan det inducerade skovvis-remittering EAE i SJL/J möss46. Djur av samma stam bör därför användas. Könsskillnader i EAE-manifestationen har också rapporterats i olika tidigare studier24. Förekomsten av sådana könseffekter kan mycket väl förväntas för det protokoll som beskrivs här, men det återstår att validera i ytterligare experiment.
Intraperitoneal (IP) administrering av en bedövningsmedel blandning bestående av 0,02 mg/mL fentanyl, 0,4 mg/mL midazolam och 0,2 mg/mL medetomidine används för kirurgiskt ingrepp. Vuxna manliga DA råttor som väger 270 – 300 g kräver cirka 0,4 – 0,6 ml av denna blandning(dvs.~ 1,5 mL / kg) för att inducera en anestesi som varar 60 – 90 min. Efter operationen retar anestesin genom en subkutan injektion av ett motgift bestående av 0, 07 mg/ml flumazenil och 0, 42 mg/ml atipamezole i fysiologisk saltlösning (0, 9% NaCl). En dos på 1 – 1,5 ml/kg retar upp anestesin inom 5 min. Alternativt kan djuren tillåtas vakna spontant på en fysiologisk tvättning av bedövningsmedel, men i så fall skulle djuren behöva hållas under observation tills de är fullt medvetna.
Andra anestesialternativ som ofta används för djuroperationer, såsom en IP-injektion av ketamin och xylazin47 eller natriumpentobarbital48, eller inandning av flyktiga bedövningsmedel som isofluoran49 och halotan50, kan också övervägas för den operation som presenteras här. Det är dock viktigt att välja ett bedövningsmedel som inte stör de avsedda ingripandena nedströms.
Under immuniseringen och intracerebral cytokininjektion används 5% isofluran för anestesin. Modellen som beskrivs här fastställdes med hjälp av råttor, och de experimentella detaljerna som anges är därför särskilt tillämpliga på råttan. Kateterimplantationskoordinaterna valdes för att möjliggöra samtidig analys av eventuella förändringar av vit materia (kateterspetsen i corpus callosum). Medan kateter insättningsstället kan varieras med avseende på anteroposterior och laterala läge, kräver valet av centrala sulcus undvikande av skador på den överlägsna sagittala sinus.
En annan egenskap hos den beskrivna metoden är motsvarande demyelination av både ipsi- och kontralaterala halvklot, eventuellt till följd av transport av den injicerade cytokinblandningen till det subarachnoid utrymmet genom det fysiologiska flödet av interstitiell vätska från när regioner51. Injektionsläget, och inte kateterns placering, orsakar därför demyelination i hela hjärnbarken, och valet av höger eller vänster parietal cortex bör därför vara oväsentligt i detta avseende.
Protokollet använder en 26 G kateter, som är tillräckligt liten för att undvika omfattande traumatisk skada och tillräckligt stor för att undvika en ökad hastighet av igensättning av kateterspetsen under experimentets långa gång. Visst orsakar implantationen och närvaron av katetern själv en astrocytisk och mikroglial aktivering, även hos kontrolldjur som endast får kateterimplantationen; Detta är dock mindre jämfört med de cytokinin injicerade djuren. 43 För att undvika störningar i efterföljande analyser använde vi MR-kompatibla katetrar av poly-eter-eter-keton (PEEK).
Ett liknande djup av demyelination skapas faktiskt i både ipsi- och kontralaterala regioner med den presenterade metoden. Detta innebär att kateterdjupet/längden kanske inte spelar någon större roll i mönstret och omfattningen av demyelination i cortex. Därför kan en ändring av kateterlängden övervägas för att minska katetern-inducerad lesion storlek. En betydligt kortare kateterlängd kan dock orsaka en något mindre uttalad närdelination, medan ett avgörande svar endast skulle erhållas genom experiment som specifikt testar kateterns längd.
En fördel med modellen är att den implanterade katetern möjliggör testning av potentiella terapier som administreras till cortex via katetern för att tillåta remyelination vid eller efter toppen av histologiskt detekterbar när demyelination (dag 15 eller senare), medan detta i en förbehandlingsinställning skulle vara efter immuniseringen men före cytokininjektionen. Beslutet om tidsramen för när terapier skulle administreras kommer därför att bero på den särskilda forskningsfrågan och det läkemedel som är av intresse.
Efter kateterimplantation är det viktigt att förvara djur singlar i de modifierade (helst höga) burarna för att undvika kateterborttagning till slutet av studien (figur 8). Djur kan också skruva loss kateterlocket med inloppet, även om detta sällan händer. Djuren bör observeras dagligen och borttagna lock bör ersättas med färska, för att undvika kateterspetsblockering i avsaknad av ett inlopp och för att säkerställa en korrekt leverans till parenkymen efter intracerebral injektionen. Djuren immuniseras tidigast 2 veckor efter kateterimplantationen för att möjliggöra läkning och stängning av blod- hjärnbarriären.
Serum anti-MOG antikroppstitrar bör mätas efter immuniseringen. Ett dos-respons experiment visade att 5 μg MOG1-125 (i IFA) gav tillräcklig immunisering inom 4 veckor hos vuxna manliga DA råttor. En titer på 5 000 μg/ml och högre skulle vara tillräcklig, men kommer säkert att bero på flera faktorer, inklusive MOG-preparatet och djurstammen och måste därför bestämmas individuellt. Det är viktigt att undvika alltför höga antigendoser som kan resultera i en klassisk EAE fenotyp med förlamade bakben redan före cytokininjektionen.
Varje djur immuniseras med 5 μg rekombinant myelin oligodendrocyte glykoprotein (rMOG1-125)emulgerat 200 μL ofullständig Freunds adjuvans (IFA). Eftersom en del av emulsionen går förlorad i sprutan under preparatet, är det lämpligt att förbereda mer än denna mängd för varje djur. Vi använde rekombinant MOG (1-125 från N-ändstationen av råtta MOG), som uttrycktes i Escherichia coli och sedan renades till homogenitet genom kelatkromatografi, upplöst i 6 M urea och dialyserad mot PBS för att erhålla ett fysiologisktpreparat 52,53. Kommersiellt tillgänglig MOG får dock också användas.
Andra antigenpreparat, såsom MOG1-116,MOG35-55 eller PLP139-151 används i olika EAE-modeller, och skillnader mellan antigener och djurstammar är kända för att inducera distinkta sjukdoms fenotyper i dessamodeller 20. Dessa antigenpreparat testades inte hos DA-råttor och, om de används i stället för rMOG1-125, kan inducera en sjukdom fenotyp eller histologi resultat skiljer sig från vad som presenteras här.
En anslutnings cannula samma längd som katetern är beredd före intrakraniell injektion. Detta kan göras genom att montera den med en mallkateter och skära den till samma storlek (2 mm lång) (Figur 4). Det är viktigt att anslutningsballen är luftbubblafri under cytokininjektionen – eftersom injektionsvolymen bara är 2 μL, även en liten luftbubbla vid kanylspetsen kommer att avsevärt minska volymen av vätskan som framgångsrikt levereras in i hjärnan. Detta uppnås genom att hålla pumpen igång och sätta i kanylen endast när en växande droppe injektionsvätska finns på spetsen. Efter kanylinsättningen skruvas kontakten fast i katetern samtidigt som övertätning undviks för att inte skada kateterns övre spets, vilket gör det svårt att kapslar om efter injektionen. En injektionshastighet på 0,2 μL/min används för att undvika injektionsinducerat trauma. Dessutom säkerställer en långsam injektion, i kombination med en väntetid på 20 minuter efter injektionen, diffusionen av den injicerade vätskan i mellansidesvätskan och en effektiv dränering i CSF. Kanylen avlägsnas sedan långsamt för att undvika vakuumeffekt.
Den rapporterade metoden inkluderar kirurgiskt ingrepp och kräver därför att personalen kan utföra stereotaktisk överlevnadskirurgi. Personal som är i direkt kontakt med djuren borde ha gått lämpliga djurförsökskurser. Resten av protokollet kan utföras av kompetenta labbmedlemmar.
Metoden är avsedd att producera inflammation-utlöst demyelination av hjärnbarken och reproducerar inte alla funktioner i mänskliga MS(t.ex.förekomsten av focal inflammatoriska vit materia organskador, som är ett kännetecken för mänskliga MS).
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka all personal vid Institute of Biomedical Research vid Medical University Graz för deras hjälp och samarbete, liksom Christopher John Wrighton för korrekturläsning av manuskriptet.
Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) | |||
Fentanyl | Hameln pharma plus, Germany | as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml | |
Midazolam | ERWO Pharma, Austria | 50039017 | 5 mg/ml |
Medetomidin | Orion Pharma, Finland | as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml | |
Flumazenil | Roche, Switzerland | 0.1 mg/ml | |
Atipamezol | Orion Pharma, Finland | as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml | |
10% povidone-iodine complex | Mundipharma, Austria | ||
Dental cement | Heraeus Kulzer, Germany | 6603 7633 | |
Physiological saline solution | Fresenius Kabi, Austria | 0.9% NaCl | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Germany | P3813 | |
Isofluorane | AbbVie, Austria | ||
Lubricating eye drops | Thea Pharma, Austria | ||
70% EtOH | Merck, Germany | 1070172511 | Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v |
2.5% enrofloxacin | Bayer, Germany | Prophylactic antibiotics | |
carprofen | Pfizer, USA | Painkillers, 50 mg/ml | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich, Germany | P9416 | |
Pentobarbital | Richter Pharma, Austria | pentobarbital sodium, 400 mg/ml | |
Interferon gamma | PeproTech, USA | 400-20 | |
Tumor necrosis factor alfa | R&D Systems, USA | 510-RT-050/CF | |
rMOG1-125 | own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden | Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA | |
Anti-MOG antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka |
Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich, Germany | F5506 | |
Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Germany | A9576 | |
Peroxidase substrate solution | Vector Laboratories, USA | SK-45000 | |
Stereotactic frame | David Kopf Instruments, USA | ||
Catheters, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8IC315GPKXXC | |
Dummy cannulas | PlasticsOne, USA | 8IC315DCNSPC | |
Plastic screws, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8L080X093N01 | |
Connector cannula | PlasticsOne, USA | 8IC313CXSPCC | |
Screw driver with 2mm tip-size | |||
Drill with flexible shaft extension | Proxxon, Germany | NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620, | |
Drill bit, round, 0.5 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF310 104 001 001 009 | |
Drill bit, twisted, 1.3 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF350 104 417 364 013 | |
Scalpel | Braun, Germany | BB510 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools, Germany | 91003-12 | |
Cotton tip applicator | Henry Schein Medical, Austria | 900-3155 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools, Germany | 14101-14, 14088-10 | |
Surgical forceps | Fine Science Tools, Germany | 11002-12, 11251-35 | |
Bulldog clamps | Fine Science Tools, Germany | 18050-35 | |
Homoeothermic blanket | TSE systems, Germany | ||
Infrared Lamp | Beurer, Germany | 616.51 | |
Dental curing light | Guilin Woodpecker Medical, China | ||
Absorbable suture | Johnson & Johnson, Belgium | V792E | |
Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | AL-1000 | |
Exam gloves | |||
Surgical gown | |||
Electric Shaver | Aesculap, Germany | GT420 | |
Volatile anesthetic vaporizer | Rothacher Medical, Switzerland | CV 30-301-D | |
Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer | Air Liquide, Austria | 19,113 | |
Volatile anesthesia chamber | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0347 | |
Anesthesia mask for rats | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0307-A | |
1 ml syringe | Codan, Denmark | REF 62.1612 | |
26 Gauge needle for injection | Braun, Germany | 4657683 | |
20 Gauge needle for cytokine injection and immunization | Braun, Germany | 4657519 | |
Luer lock tip glass syringes | Poulten & Graf, Germany | 7.140-37 | |
3 way stopcock | Becton Dickinson, Sweden | 394600 | |
96-well plate | Thermo Fisher Scientific, USA | 442404 | |
Plate reader | Cole-Parmer, USA | EW-1396-00 | |
37°C incubator | Kendro, Germany | 50042301 | |
Micropipettes | Gilson, USA | F167350 |