Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att övervaka montering och demontering av mjältbrand toxin använder biolayer interferometry (BLI). Efter montering/demontering på biosensor ytan, de stora proteinkomplex frigörs från ytan för visualisering och identifiering av komponenter av komplex med elektronmikroskopi och masspektrometri, respektive.
Abstract
In vivo proteiner ingår ofta i stora makromolekylärt komplex där bindande specificitet och dynamik i slutändan diktera funktionella utgångar. I detta arbete, är pre-endosomal mjältbrand toxin monterade och övergick till den komplexa endosomal. Första, N-terminala domänen för en cystein mutant dödlig faktor (LFN) är kopplad till en biolayer interferometry (BLI) biosensor genom disulfide koppling i en optimal orientering, tillåta skyddande antigen (PA) prepore att binda (Kd 1 nM). Den optimalt orienterade LFN-PAprepore komplexa sedan binder till lösliga kapillär morfogena gen-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), vilket resulterar i en representativ mjältbrand pre-endosomal komplex, stabil vid pH 7,5. Detta sammansatta komplex utsätts sedan för försurning (pH 5,0) företrädare för sent endosome miljön i övergången mellan den PAprepore in i membran som infogas pore tillståndet. Detta PApore tillstånd resulterar i en försvagad bindning mellan CMG2 receptorn och den LFN-PApore och en betydande dissociation av CMG2 från övergången pore. Thio-fastsättning av LFN till biosensor ytan vändas lätt om av Ditiotreitol. Minskning på BLI biosensor ytan frigör den LFN-PAprepore-CMG2 ternära komplex eller syran övergick LFN-PApore komplex till mikroliter volymer. Släppta komplex är då visualiseras och identifieras med hjälp av elektronmikroskopi och masspektrometri. Dessa experiment visar hur att övervaka kinetiska församling/disassemblyen av specifika proteinkomplex etikett-fri BLI metoder och utvärdera strukturen och identitet av dessa BLI monteras komplex av elektronmikroskopi och massa spektrometri, respektive, med hjälp av lätt-till-replikera sekventiell förfaranden.
Introduction
Att identifiera och förstå specificitet reglerar protein komplex sammansättning i vivo är av extrem intresse för biokemiska forskare. Stora heterogena protein aggregat är normen snarare än undantaget. Denna uppfattning stöds av spektroskopiska övervakning i vivo församling, isolera komplex med mildare cell störningar tekniker, utvärdera produkter från affinitet-baserade reningsmetoder och visualisera dem med hög upplösning Kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM). För att förstå kontroll av församlingen specificitet inom cellen, måste forskarna rutinmässigt isolera, identifiera och slutligen karakterisera dessa dynamiska montering/isärtagning strukturer. Det mest använda molekylära verktyget för att identifiera komponenterna i dessa församlingar ofta kräver antikroppsbaserade immunoprecipitation, som förlitar sig på att upprätthålla komplexa stabilitet under cell störningar. Olika kopplade analysmetoder har nyligen utvecklats för att fånga komplex från cellprover med mikroflödessystem baserat tillvägagångssätt, såsom ytan plasmon resonans (SPR). Efter avlägsnande från SPR ytor, dessa prover analyserades av matrix-assisted laser desorption/jonisering tid flygning (MALDI-TOF)1,2. Främja denna metod med lättare protokoll tillåter forskare att visualisera och validera förutspådda komplex som förekommer i den cellulära miljön. Eftersom SPR är ett mikrofluidik-baserat system, uppstår problem ofta från aggregerade formation. Kringgå detta problem kräver provspädning, vilket i sin tur kan minska koncentrationen ansvarig biologiska komplex integritet.
En relativt nyligen avancemang i etikett-fri teknik är utvecklingen av den biolayer interferometry (BLI) system3. Dessa särskilda ljus-baserade reflektans system replikera eller bästa emulera, SPR bindande och kinetiska resultat till en bråkdel av kostnaden3,4 särskilt om enda kanal enheter som används. BLI mäter förändringar i reflekterat ljus interferensmönster mellan ett referensskikt (kontroll) och den biolayer ytan (experimentell). Den resulterande förändringen i fas mäts i realtid som en kinetic och kvantitativa avläsning5. Biosensor ytan, som innehåller specifika immobilisering kemiska sammansättningar, överförs fysiskt mellan lösningar, i motsats till buffert förändringar genom mikroflödessystem metoder i SPR, för mätning via våglängd fas omläggningar. Massöverföring effekter hindras av agitera lösningen. Till skillnad från SPR är dessa system ganska användbart för att värdera komplex från rå biologiska prover. Parametern fysiska mätt under BLI experiment främst beror på en förändring i massa eller tjocklek på biosensor ytan som resulterar från protein komplex montering eller demontering.
Dessa fiber optic biosensorer är lätt att använda och relativt billiga. En av de framväxande användbara aspekterna av BLI är lättköpt avlägsnande av nyligen monterade proteinkomplex från ytan. En nyligen tillämpning av denna metod får vårt laboratorium att iaktta realtid kineticsen av storskaliga pH inducerad protein struktur ombildning av komponenten mjältbrand toxin skyddande antigen (PA) som prepore (PAprepore) övergått till dess pore (PApore) form. Denna övergång biosensor spets verifierades med hjälp av elektronmikroskopi (EM)6. Borttagning av komplex från biosensor ytor undviker större volym utspädningseffekter ofta påträffas när släppa komplex från chip ytor när du använder mikrofluidik system.
I det nuvarande arbetet, är mjältbrand toxin komplex monteras och demonteras på biosensor ytan och sedan släppt i mikroliter volymer. De resulterande komplexa komponenterna valideras ortogonalt med EM och masspektrometri (MS).
Protocol
1. montering av definierade makromolekylärt komplex på Biolayer Interferometry (BLI) Biosensor ytor
-
Montering av prepore mjältbrand toxin komplexa på en PDEA-modifierade amine reaktiva biosensor yta
- Återfukta en Amin reaktiva andra generationen (AR2G) BLI biosensor tips i 250 µL av vatten i tio minuter.
- Programmera steg tider, som anges i tabell 1, på programvara styra BLI enheten (se Tabell för material).
- Börjar det BLI som drivs av nedsänkning biosensor spetsen i 250 µL vatten för 30 s att mäta en första originalplanen biosensor tjocklek och densitet.
- Aktivera biosensor genom nedsänkning spetsen i 250 µL 50 mM NHS (N-hydroxysuccinimide) och 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) i 7 minuter.
- Fördjupa den aktiverade biosensor i 50 mM PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) upplöst i 0,1 M Borat buffert (pH 8,5) i 5 minuter för att generera en aktiverad thiol-reaktivt yta.
- Fördjupa den aktiverade thiol-reaktivt biosensor i 250 µL av lösning innehållande 100 nM E126C LFN i 10 mM natrium acetat pH 5.0, 100 mM NaCl, buffert i 5 minuter.
- Fördjupa den LFN spetsen i 50 mM L-cystein, 1 M NaCl, 0.1 M natriumacetat, pH 5.0, för 4 minuter, för att släcka eventuella återstående reaktiva gratis thiol-reaktiva grupper.
- Fördjupa den kylda LFN spetsen i 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 2 minuter att upprätta buffert baslinjen.
- Fördjupa den kylda LFN spetsen i 0,5 µM skyddande antigen prepore (PAprepore), 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 5 minuter att skapa den LFN-PAprepore komplex.
- En gång PAprepore associeras, ta bort spetsen från PAprepore lösningen och doppa spetsen i 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 30 sekunder för att tvätta bort eventuella icke-specifikt bunden PAprepore.
- Fördjupa den LFN-PAprepore komplex i 0,5 µM CMG2 receptor (utan transmembrana domänen), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, i 5 minuter.
- Fördjupa den LFN-PAprepore -CMG2 komplex i 50 mM Tris, 50 mM NaCl i 30 sekunder för att tvätta bort eventuella obundna CMG2 till formuläret pre-endosomal komplex.
- För EM analys, släppa den LFN-PAprepore-CMG2 komplex från biosensor spetsen av nedsänkning spetsen i 5 µL av 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, inuti en PCR-tub.
- För tandem MS analys av peptiderna från komplexet, släppa den LFN-PAprepore-CMG2 komplex från biosensor spetsen av nedsänkning i biosensor i 5 µL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (keratin-fri), 25 mM hjorthornssalt pH 8,0 inuti en PCR-röret . Detta utförs på en olika biosensor än det som användes för EM analys.
-
Montering av pore mjältbrand toxin komplexa på PDEA-modifierade amine reaktiva biosensor yta
- Om du vill visa anläggningen efter pH övergången, utför steg 1.1.1-1.1.12 i föregående avsnitt för att generera den LFN-PAprepore-CMG2 komplexet.
- Fördjupa den biosensor spetsen i en 10 mM acetat pH 5.0 i 5 minuter för att inleda övergången av den PAprepore PApore övergång. Denna övergång indikeras genom att öka amplitud (cirka 0,2 nm) följt av en större amplitud nedgång som antas vara väsentlig eller komplett receptor dissociation beror på minskade affinitet.
- Sänk ner LFN-PApore tip i 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8,0, i 30 sekunder för att tvätta bort sura buffert.
- För EM analys provet, fördjupa biosensor spetsen i en lösning som innehåller 1,25 mM miceller (2,5 mM MSP1D1, 25 mM Na-cholate, 162,5 mM POPC) i 5 minuter för att förhindra aggregering i lösning efter disulfid släppa.
- För EM analys, släppa den LFN-PApor -Micelle komplex från biosensor spetsen av nedsänkning spetsen i 5 µL av 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl inuti en PCR-tub.
- För tandem MS analys av peptiderna från komplexet, release LFN-PApoore komplex (ingen micelle) från biosensor spets av nedsänkning i biosensor i 5 µL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (keratin-fri), 25 mM hjorthornssalt pH 8,0 inuti en PCR röret. Detta utförs på en olika biosensor än det som användes för EM analys.
2. visualisera och validera släppt makromolekylära församlingar från BLI biosensorer med negativa fläcken elektronmikroskopi
- Glow ansvarsfrihet ett kol-belagd Cu 300 rutnät. Typiska glöd ansvarsfrihet inställningar är 0.38 mBar stabil atmosfär trycket, negativa 15 mAmps, 20 sekunder, sedan avluftning med luft.
- Säkert rutnät mellan ett par rena pincett.
- Pipettera 4 µL av utgivna komplexa prov i PCR-röret på rutnätet och tillåta adsorption för 60-talet.
- Wick bort resterande vätska med ett filterpapper kil.
- Fläcken rutnätet av pipettering 5 µL av 0,75% 0.02 micron filtreras uranyl formate och fuktspridande bort överflödigt bets efter 5 sekunder. Tillåta grid torka i rumstemperatur.
- Visa färgas provet nät använder ett transmissionselektronmikroskop.
3. identifiering av kompletta Pre-endosomal mjältbrand Toxin komplexa (LFN-Paprepore-CMG2) och övergått komplexa (LFN-Papore utan CMG2) med hjälp av masspektrometri.
- Späd prover som är släppta till 20 µL och inkubera i 1 timme.
- Tillsätt 2 µL av 55 mM iodoacetamide, 25 mM hjorthornssalt, pH 8,0 och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur i mörkret (täckt med aluminiumfolie).
- Späd provet med 100 µL av 25 mM hjorthornssalt, pH 8,0, att minska guanidin hydroklorid koncentrationen under 1 M.
- Tillsätt 5 µL sekvensering grade modified trypsin på 20 ng/µL och inkubera vid 37 ° C under natten.
- Tillsätt isättika till en slutkoncentration på 5% att minska pH till < 3, sedan sänka volymen till 10 µL i vakuum koncentrator.
- Överför peptid lösningen till provet plattan på autosampler för den nLC 1200 uHPLC.
- Ladda 5 µL peptid lösningen på en uHPLC reversed phase-kolonn monterad på jonisering scenen av MS.
- Tvätta kolonnen med 15 µL 0,1% myrsyra med en högsta hastighet av 5 µL/min och maximalt tryck på 800 psi.
- Eluera peptider från omvänd fas C18 kolonnen med en flödeshastighet av 350 nL/min under en 90 minuters period med en linjär övertoning på 5% till 40% av lösningsmedel B i A + B (lösningsmedel A: 0,1% myrsyra, lösningsmedel B: 95% acetonitril med 0,1% myrsyra).
- Analysera eluerande peptider på linje med tandem MS.
- Ställ in jonisering källan till 2500 volt och ion överföring temperaturen till 250 ° C.
- Driva masspektrometer under automatisk kontroll att skannar kontinuerligt en MS följt av så många tandem maskinförare som möjligt i en 3 s period, använda CID och en normaliserad kollision energi 35.
- Identifiera peptid- och komponenter med standardmetoder. För detta arbete utfördes två uppsättningar av peptid- och analys.
Representative Results
Förmågan att övervaka och kontrollera monteringen av stora makromolekylärt komplex är ett avgörande steg mot att förstå den specificitet och funktionalitet i stora Biomolekylär församlingar. Resultaten av de metoder som presenteras häri visar lätthet med vilken stora proteinkomplex (> 150 kDa massa) kan monteras med biolayer interferometri, samtidigt övervaka kinetik och amplituden av församlingen. Unik kompakt beskaffenhet biosensor ytan möjliggör montering analys utvidgas genom att släppa monterade komplex i små microvolumes. Dessa microvolumes kan användas för att visualisera den ursprungliga fysiska strukturen av de komplex som använder EM och kontrollera identiteten på de komplexa komponenter med MS. En schematisk översikt över hela den här processen visas i figur 1.
En nyckelfaktor för framgångsrika montering och kontroll av makromolekylära komplex på biosensor ytan innebär rätt orientering av proteinet inledande utsäde. Detta säkerställer att protein-protein interaktioner webbplatser tillgängliga, inte koalisera blockerade och optimalt placerade från biosensor yta. I figur 2visas rätt orientering av mjältbrand toxin komplexa uppnås med hjälp av ett specifikt konstruerade N-terminala fragment av dödlig faktor (LFN) så LFN-PAprepore bindningsstället placeras alltid motsatsen till biosensor kovalent fastsättning webbplats6,7. Den efterföljande uppbyggnaden av komplexet med bindningen av PA till den LFN BLI biosensor följt av lösliga CMG2 bindning till PA i slutändan skapar en translokation behöriga mjältbrand toxin komplexa.
BLI sensogram spårningen är en realtid läsa av amplitud ändringarna på grund av särskilda tillägg av mjältbrand toxin komponenter när de läggs in på biosensor. Figur 3 visar en representativ trace parat med en modell av anläggningen förutspådde att bilda vid det steget i processen. Den första ökningen är LFN lastning på spetsen. Efter släcka och baslinje, PAprepore binder sedan till LFN följt av tillägg av lösliga CMG2 receptor vilket resulterar i monterade pre-endosomal komplex av LFN-PAprepore-CMG2. För att gå framåt mot sena endosome miljön, utsätts hela komplexet en lågt pH puls (pH 5,0) som försvagar den receptor bindande, så att prepore övergång till dess utökade membran införas pore konformation. 6 Sensogram spår av försurning steget visas i figur 4. Den initiala ökningen eller 'spik' i amplitud är sannolikt de por filändelse6 som måste ske före minskningen i den CMG2 receptorbindning. Större amplitud nedgången är troligen betydande eller komplett receptor dissociation på grund av minskad affinitet. Tidigare arbete i detta laboratorium anges CMG2 bindande till de helt utdragen PApore är försumbara i förhållande till CMG2-PAprepore interaktion6. Dessutom sensogram kinetiska tracen, observerats i alla sensograms av LFN-PAprepore-CMG2 övergångar till LFN-PApore med en pH-droppe, är reproducerbara över flera körningar.
Före och efter försurning frigörs enkelt biosensor fäst komplexen för visualisering av negativa fläcken EM och identifiering av MS (diagram 5). Representativa komplex från EM resultaten visas i figur 6. Pre-endosomal prov rutnät, Visa tätheter överensstämmer med intakt ternära komplex bestående av LFN-PAprepore-CMG2. Efter försurning komplexa rutnät, Visa PA övergått för att pore och solubilized av micelle integration med inga uppenbara CMG2 täthet.
Identitet av den före och efter försurning komplex kontrollerades av MS. En databas där sekvenserna av PA, P13423; LFN, P15917; och CMG2, P58335 ingick i en bakgrund av en mus proteiner databas härstammar från NCBInr databasen. Bara proteinerna av intresse erhölls från denna första databas sökning, med följande aminosyra täckning för ternära och binära komplexen: 54% och 22% för PA, 36% och 6% för LF och 43% för CMG2, respektive (CMG2 var inte upptäcks på det binära komplexet). För att maximera protein aminosyra täckning, utfördes en andra peptid och protein identifiering med hjälp av en protein databas som innehåller endast de tre proteinerna av intresse. Pre-endosomal MS prover innehöll peptider från alla tre toxin komponenter med 60,46%, 67.97% och 54,15% täckning för LFN, PA och CMG2, respektive (figur 7). Post-endosomal resultat, visas i figur 8, innehöll endast peptider från LFN och PA (57.41 och 67,79% täckning, respektive). Bristen på CMG2 i post-endosomal proverna överensstämmer med observerade BLI nm minskningen under pore bildandet.
Figur 1. Schematisk översikt för analys av proteinkomplex monterat på och isolerade från BLI biosensor med EM och MS. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. Biosensor aktivering: första steget i orientering specifika sammansättning på BLI biosensor. E126C dödlig faktor N-terminala domänen, (LFN) är kopplad via en thio-koppling skapar korrekt inriktad PAprepore bindande gränssnittet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Övervakning mjältbrand toxin montering och demontering med BLI: sensogram visar amplituden ändringar som en funktion av tid på grund av särskilda tillägget av mjältbrand toxin komponenter när de läggs in på den biosensor som börjar med LFN lastning (steg 4 i (Se tabell 1). PAprepore är sedan lastas på ytan följt av tillägg av lösliga CMG2 receptor. Monterade pre-endosomal komplex består av en LF-PAprepore- CMG2. För att gå framåt mot sena endosome miljön, montera hela funktionella mjältbrand toxin utsätts för en lågt pH puls (pH 5,0) som försvagar den receptor bindande, så att prepore övergång till dess utökade membran införas pore konformation. Exponering av membranet spanning pore är bekräftade och solubilized genom tillsats av miceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. BLI sensogram av CMG2 release: spår av försurning steget Visa en inledande ökning eller 'spik' i amplitud följt av en större amplitud nedgång som sannolikt pore bildandet och receptor dissociation, respektive. Vertikala streckade röda linjerna anger början av ett nytt steg. Sensograms justeras på den fetstil prickad röd linje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Analysera proteinkomplex monterat på och isolerade från BLI biosensor med EM och MS: Biosensor bifogade komplex är enkelt släppte in 5 µL buffert innehållande DTT för visualisering av negativa fläcken EM och identifiering av MS. vänligen klicka här att Visa en större version av denna siffra.
Figur 6. Visualisering av proteinkomplex med EM: Pre-endosomal prov rutnät, Visa tätheter överensstämmer med intakt ternära komplex bestående av LFN-PAprepore-CMG2. Post-endosomal komplexa rutnät, Visa PA övergått för att pore och solubilized av micelle med inga uppenbara CMG2 täthet. Modeller av förutsedd komplex (vänster sida) är på samma skala som enskilda partiklar visas. Partiklar färglagd med förutspådda protein (baserat på storleken på EM densitet) visas nedanför varje partikel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Verifiering av proteinkomplex med MS: Pre-endosomal MS prover innehöll peptider från alla tre toxin komponenter med 60,46%, 67.97% och 54,15% täckning för LFN, PA och CMG2, respektive. Peptider detekteras med en falsk upptäckten hastighet (FDR) lika med eller högre än 5% visas i gult, FDR lika eller högre än 1% visas i grönt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Verifiering av proteinkomplex med MS: Post-endosomal prover innehöll peptider från LFN och PA (57.41 och 67,79% täckning, respektive), men inte CMG2. FDR lika eller högre än 5% visas i gult, FDR lika eller högre än 1% visas i grönt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Tid (s) | Beskrivning |
| 1 | 30 | Första originalplanen |
| 2 | 420 | Aktiveringen |
| 3 | 300 | Aktiveringen |
| 4 | 300 | LFN lastning |
| 5 | 240 | Cystein spärr |
| 6 | 120 | Baslinjen |
| 7 | 300 | PAprepore föreningen |
| 8 | 30 | Baslinjen |
| 9 | 300 | CMG2 föreningen |
| 10 | 30 | Baslinjen |
| 11 | 300 | Sura övergången |
| 12 | 30 | Baslinjen |
| 13 | 300 | Micelle föreningen |
Tabell 1. Steg gånger för singel BLI springa till församlingen mjältbrand toxin komplexa. Observera att baslinjer är att tvätta bort obundna protein från föregående steg eller fastställa en ny buffert baslinje.
Discussion
Denna demonstration visar hur makromolekylära komplexa bildande kan enkelt övervakas med hjälp av biolayer interferometri, visualiseras med hjälp av EM och verifierat med MS, alla med microvolumes i en kort tidsperiod. Strukturella montering och observerade komplex Följ biologiskt relevanta förutsägelser, ytterligare validering av denna kombinerade metod. Som nämnts i resultatavsnittet, kräver nyckelelementet för montering framgång rationellt bakåtkompilerade cystein mutagenes att säkerställa att de komplexa protein-protein gränssnitt är korrekt orienterade från biosensor yta.
Tidigare system har använt BLI och MS-tekniker för att utvärdera Proteinbindningen av två och tre del-system samt integritet receptorbindning uttryckt protein, men, i båda fallen, utvecklades inte metoder för att utnyttja tandem EM/MS närma sig8,9. Endast andra interferometri systemet som kombinerade MS analys för att karakterisera interaktioner var en dual-polarisation interferometry10. Tyvärr, detta system är inte längre tillgängliga för allmänt bruk. Som nämnts i inledningen, har förekommit ett antal studier som slutförts där prover var bildas på SPR-liknande biosensor ytor och bort från MS analys. Ingen av dessa exempel resulterade i komplex visualiseras med hjälp av EM.
Begränsningarna i denna sekventiell metod kan vara många men är lösbara. För inledande immobilisering och därför foundation steg församling, skulle en bristande kunskap om de strukturella interaktion ytorna säkerligen hämmar framsteg associerade med övervakning första montering faser. Bristen på strukturinformation kan åtgärdas genom att utforma en konstruerad foundation konstruera var bifogad kemier (e.g. sulfhydryl biexponentiellt för disulfid kopplingar / hans-taggade positionering) kan flyttas till olika regioner inom kärnan system för montering. När det gäller mjältbrand toxin komplexa var det tur att LFN bunden till PAprepore struktur är tillgängliga11. Rationell placering av bakåtkompilerade cystein var lokaliserad till regionerna borta från PAprepore bindande ansiktet. Med cystein länkage kemier är det att föredra att inga andra reaktiva cysteines är närvarande på protein ytan.
Det finns olika kemiska sammansättningar med bifogad fil som kan användas till ingenjör bestämd koppling webbplats på en proteinets ytor. En av de mest populära särskilda bilagorna innebär positionering en biotin biexponentiellt på ett specifikt definierade läge på protein yta12. Tyvärr, biotin bindning till en streptividin eller avidinen belagda ytor är ganska tight. Återföring av bindande interaktionen är inte enkelt. Användning av en konstruerad His-tag på N - eller C-terminalen och det efterföljande lätthet fastsättning Ni-NTA ytor är en mer universell tillämpning av affinitet immobilisering. Naturligtvis, är en av förbehåll för engineering montering fastsättning webbplatser med hans-taggade system kravet att N - och C-termini av proteinet kärna församling fortsätter att exponeras och separeras så att bilagan är lätt. Som med alla församling processer, måste gränssnittet interaktion av proteinet kärna församling vara tillgängliga som komplex sammansättning fortskrider.
Kanske är den vanligaste oro att använda biosensor ytan kemiska sammansättningar icke-specifik bindning. Streptividin tips är ofta en källa till betydande icke-specifik bindning effekter. Disulfid kopplade biotin kan användas till att förlösa mycket specifika komplex lämnar bakom minskad S-biotin länkaget tätt bundna till immobiliserade streptividin biosensorer13. Det finns andra reversibla kemiska sammansättningar blir tillgängliga såsom iminoboronates och till en lesser grad ketoamide14. Detta fält är för närvarande underutvecklade, men det finns stort intresse av ytterligare utveckla reversibel kovalent protokoll för att undvika ej åsyftade läkemedel toxiska effekter som ofta åtföljer användningen av kovalent riktade läkemedelsutveckling.
En begränsning av med EM för att visualisera komplex är tolkning, särskilt i fall där strukturerna för de församlade komplex inledningsvis inte är kända. Rumsliga placeringen av komponenter inom ett odefinierat monterade makromolekylärt komplex kan identifieras med monoklonala antikroppar (mAb) som specifika kinetiska och strukturella markörer. Till exempel när det bildas ett komplex, kan monoklonala antikroppar läggas som binder till specifika komponenter. Denna metod används ofta i EM för att identifiera specifika komponenter inom stora sammanställningar15. En annan begränsning är relaterad till storleken på anläggningen, har visserligen instanser där definitionen symmetrisk församlingar så litet som 70 kDa (GroES heptamer) är enkelt matchas med negativa fläcken EM. Monterade komplex som analyseras av EM är vanligtvis i storleksintervallet ~ 100 Å i diameter eller ovan. Nyligen dock proteiner så liten som 20 kDa har lösts och låg upplösning strukturer har erhållits vid användning av superior färgning metoder16.
För MS analys, kan ökad känslighet av nuvarande MS instrumentering nivån i femtomolar (attomoles) i vissa fall öka känsligheten för BLI upptäckt. Det är mycket tänkbart att protein signaler som visar en minimal men repeterbara ökning amplituder kommer att resultera i identifiering av proteinet i fråga. Dessutom medför sondera protein-protein interaktioner med en partner ansluten biosensor och den andra i cellulära miljö i praktiken en rening och därefter lättare identifiering av nybildade komplexet. En begränsning som kan observeras med de nuvarande mycket känsliga MS-system är att proteinet av intresse kanske inte i databasen, men denna observation är sällsynta (t.ex. proteom från sällsynta arter). Om sekvenserna av proteinerna av intresse är kända, löses enkelt problemet genom proteinernas amino syran ordnar i en bakgrund protein databas (som beskrivs i detta arbete i avsnittet protokoll). En annan potentiell begränsning av metodik resultaten från motståndet av ett protein till trypsinolysis. Trypsin matsmältningen är vanligtvis standardmetoden för bottom-up-protein identifiering. Proteiner kan dock resistenta mot trypsin om de saknar Arg och Lys rester eller tillgång till dessa restprodukter begränsas av vikta struktur. Dessa begränsningar är löst, respektive genom att använda alternativ eller en kombination av proteaser eller inklusive ett utspelas reagens (urea eller guanidin HCl, som anges i 1.1.14 och 1.2.6) innan enzymatisk nedbrytning.
Möjliga utbyggnader av denna metod inkluderar tillåter användaren att följa och identifiera cellulära församlingen komplex från rå cellulär lysates. Det visar tester för monteringskomponenter i koncentrerad cellulära extrakt är lätt att utföra med hjälp av biolayer interferometri förfaranden. Till skillnad från vanliga mikroflödessystem baserade metoder som är benägna att igensättning och känsliga för aggregering, kan metoden BLI användas för att direkt fördjupa biolayer sensor tips i rå extrakt att potentiellt montera specifikt komplex direkt från dessa koncentrerade oren prover. När monterade, är det helt genomförbart att använda specifika antikroppen sonder som en uppföljning av systemet BLI att ytterligare identifiera och kvantifiera även misstänkta komponenter i cellulär extrakt som identifierades med hjälp av metoden microvolume MS. Igen, viktigaste här är att använda definierade, korrekt orienterade core proteiner som specifika affinitet sonder.
Möjligheten att Visa prepore för att pore övergångsprocessen kinetically med BLI kommer att vara mycket användbara i att identifiera potentiella ”anti toxin” småmolekylära hämmare av de protein-övergångar som specifikt fungera under sena endosomal, lågt pH (5,0) villkor. Detta pH inducerad prepore till pore övergången hämmas i närvaro av fällbara stabilisator (osmolytes) såsom glycerol eller sackaros, och således ger starkt stöd för att utveckla särskilda riktade fällbara stödben som hindrar PApore bildandet. Detta särskilda tillvägagångssätt undviker och ersätter råolja aggregation-baserade analyser där pH sjunker leda till protein nederbörd. Denna sistnämnda metod, leder även om det är bra för primära prescreening metoder, ofta till falskt positiva resultat där specifika föreningar hämmar aggregationen snarare än faktiska molekylär övergångarna.
Nedströms observationerna av strukturen och identifiering av de enskilda monterade komponenterna inom små microvolume prover kan också vara användbar för att bekräfta potentiella blyföreningar. Detta kan tillämpas i fall där antingen specifika församlingen stabilisering eller destabilisering är målet resultatet. Denna kinetiska/struktur/identifiering parallell strategi är användbar för direkt bekräftar giltigheten av misstänkta bly sammansatta effektorer församling och fungerar som en rimlig sekundära screening steg eller medellång genomströmning tillvägagångssätt.
Cryo-EM är en användbar teknik för att studera Atom Detaljer av makromolekyl komplex i olika stadier av församlingen. Före förbereda cryo-EM prover, är det viktigt att först kontrollera en beredning innehåller någorlunda ren homogen komplex med negativa fläcken EM. De verk som presenteras häri visar montering av proteinkomplex på BLI biosensor ytor, frisläppandet av dessa komplex för EM visualisering, och identifiering av dessa komponenter med hjälp av MS. Denna särskilda metod av kontrollerade montering och release kan vara användbart i genererar mycket specifika protokoll som förbättrar homogen sekventiell provberedning för negativa fläcken EM, ett nödvändigt steg som måste påvisas innan avancera till Cryo-EM. För att få låg upplösning 3D-strukturen, skulle bara 30-50 partiklar av anläggningen utföra en konisk tilt serie (70 olika 2D-bild visningar per partikel) förutsatt att det finns orientering mångfald (flera olika vyer).
Med avseende på förbättring av MS metoder, fortsätter framsteg inom känslighet och minskning av provvolymen att förbättras. Nano flöden och Ultra högtryck vätskekromatografi tillsammans med utvecklingen av masspektrometrar med snabb tull cykel, ökad känslighet och upplösningsförmåga. Senaste införandet av den orbitrap masspektrometer, i synnerhet den senaste versionen (orbitrap Fusion Lumos och dess förväntade efterträdare den Orbitrap Fusion Lumos 1M) samt sökalgoritmer kraftigt underlätta denna process.
Den nuvarande metoden följer den kinetiska montering och demontering av mjältbrand toxin komponenter använder etikett-fri BLI metoder och utvärderar struktur och identitet av dessa komponenter med EM och MS, respektive. Användning av en enkel enda kanal BLI system tillsammans med rutin negativ färgning EM analys och elementära MS tekniker är mer än tillräcklig för att karakterisera en monteringsprocessen.
Disclosures
Inga upplysningar vid denna tid.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds av Madison och Lila Self Graduate Fellowship (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC biomedicinsk forskning utbildning Program (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), KU överbrygga medel och den Biomolecule interaktion teknik Center (BITC) Grant ( CT och MTF). Författarna vill tacka Barbara Fegley KUMC Electron Microscopy kärna för hjälp med TEM bild förvärv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA) | GE Lifesciences | BR100058 | |
| 0.5 mL black microtubes | Sigma-Aldrich | Z688304-500EA | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457C-25mg | |
| Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å | ThermoFisher Scientific | 164561 | |
| Acetic acid glacial | Fisher | A38SL-212 | |
| Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips | Forte Bio | 18-5092 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher | A643-500 | |
| Anotop 10 syringe filter, 0.02um | GE Lifesciences | 6809-1002 | |
| BLItz System | Pall Forte Bio | 45-5000 | |
| Boric acid | Fisher Scientific | 10043-35-3 | |
| Capillary Morphogenic Gene-2 | Protein produced and purified in-house | ||
| Carbon coated Cu 300 grid | Electron Microscopy Sciences | CF300-CU-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT25 | |
| Formic acids | JT Baker | 0129-01 | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505-100G | |
| Iodoacetamide | MP-BioMedicals,LLC | 100-351 | |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JEOL | ||
| L-cystiene hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | C121800-5G | |
| Lethal Factor N-terminal domain | Protein produced and purified in-house | ||
| MS software version 2.2 | ThermoFisher Scientific | ||
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 090M14531V | |
| Orbitrap Fusion Lumos | ThermoFisher | ||
| PCR tubes | ThermoFisher Scientific | AB-0620 | |
| Pelco easiGlow glow discharge cleaning system | Ted Pella, Inc | 91000 | |
| Protective Antigen prepore | Protein produced and purified in-house | ||
| Qualitative filter paper circles | Fisher Scientific | 09-795C 5 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sequest HT search engine | ThermoFisher Scientific | ||
| Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | BP334-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium cholate | Sigma-Aldrich | C1254-100G | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Uranyl formate (UF) | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
| Xcalibur | ThermoFisher Scientific | OPTON-30487 |
References
- Bellon, S., Buchmann, W., Gonnet, F., Jarroux, N., Anger-Leroy, M., Guillonneau, F., Daniel, R. Hyphenation of surface plasmon resonance imaging to matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry by on-chip mass spectrometry and tandem mass spectrometry analysis. Analytical Chemistry. 81, 7695-7702 (2009).
- Kim, Y. E., Yi, S. Y., Lee, C. S., Jung, Y., Chung, B. H. Gold patterned biochips for on-chip immuno-MALDI-TOF MS: SPR imaging coupled multi-protein MS analysis. The Analyst. 137, 386-392 (2012).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377, 209-217 (2008).
- Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Analytical Biochemistry. , 172-180 (2009).
- Pall. BLI Technology. , Available from: http://www.fortebio.com/bli-technology.html (2018).
- Naik, S., Brock, S., Akkaladevi, N., Tally, J., McGinn-Straub, W., Zhang, N., Gao, P., Gogol, E. P., Pentelute, B. L., Collier, R. J., Fisher, M. T. Monitoring the kinetics of the pH-driven transition of the anthrax toxin prepore to the pore by biolayer interferometry and surface plasmon resonance. Biochemistry. , (2013).
- Akkaladevi, N., Hinton-Chollet, L., Katayama, H., Mitchell, J., Szerszen, L., Mukherjee, S., Gogol, E., Pentelute, B., Collier, R., Fisher, M. Assembly of anthrax toxin pore: Lethal-factor complexes into lipid nanodiscs. Protein Science. 22, 492-501 (2013).
- Jin, H., Cantin, G. T., Maki, S., Chew, L. C., Resnick, S. M., Ngai, J., Retallack, D. M. Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens. Protein Expression and Purification. 78, 69-77 (2011).
- Yamniuk, A. P., Edavettal, S. C., Bergqvist, S., Yadav, S. P., Doyle, M. L., Calabrese, K., Parsons, J. F., Eisenstein, E. ABRF-MIRG benchmark study: Molecular interactions in a three-component system. Journal of Biomolecular Techniques. , 101-114 (2012).
- Moore, J. D., Perez-Pardo, M. A., Popplewell, J. F., Spencer, S. J., Ray, S., Swann, M. J., Shard, A. G., Jones, W., Hills, A., Bracewell, D. G. Chemical and biological characterisation of a sensor surface for bioprocess monitoring. Biosensors & Bioelectronics. 26, 2940-2947 (2011).
- Feld, G. K., Thoren, K. L., Kintzer, A. F., Sterling, H. J., Tang, I. I., Greenberg, S. G., Williams, E. R., Krantz, B. A. Structural basis for the unfolding of anthrax lethal factor by protective antigen oligomers. Nature Structural & Molecular Biology. 17, 1383-1390 (2010).
- Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Site-Specific Protein Labeling: Methods and Protocols. , 171-184 (2015).
- Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry. Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).
- Bandyopadhyay, A., Gao, J. Iminoboronate-based peptide cyclization that responds to pH, oxidation, and small molecule modulators. Journal of the American Chemical Society. 138, 2098-2101 (2016).
- Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding. The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).
- Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research. Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).
