Summary
Nous présentons ici un protocole pour produire des Gram négatif Escherichia coli (e.coli) sphéroplastes et Gram positif Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastes pour visualiser clairement et rapidement caractériser interactions peptide-bactéries. Cela fournit une méthode systématique pour définir la membrane localisation et translocation des peptides.
Abstract
L’utilisation de la microscopie confocale comme une méthode pour évaluer les modèles de localisation de peptide au sein de bactéries est généralement inhibée par les limites de résolution des microscopes légers classiques. Comme la résolution d’un microscope donnée ne peut être facilement améliorée, nous présentons des protocoles afin de transformer le petit bâtonnet Gram-négatif Escherichia coli (e. coli) et Gram-positives Bacillus megaterium (b. megaterium) en plus, facilement imagés des formes sphériques appellent sphéroplastes ou protoplastes. Cette transformation permet aux observateurs de rapidement et clairement déterminer si les peptides se loger dans la membrane bactérienne (c.-à-d., localisation de membrane) ou traversent la membrane pour entrer dans la cellule (c.-à-d., translocation). Avec cette approche, nous présentons aussi une méthode systématique pour caractériser les peptides comme membrane de localisation ou de translocation. Bien que cette méthode peut être utilisée pour une variété de peptides actifs membrane et souches bactériennes, nous démontrent l’utilité de ce protocole en observant l’interaction de Buforin II P11A (BF2 P11A), un peptide antimicrobien (AMP), à e. coli sphéroplastes et b. megaterium protoplastes.
Introduction
Peptides antimicrobiens (ampères) ont attiré l’attention en raison de leur utilisation potentielle comme alternatives aux antibiotiques conventionnels1,2,3,4,5. Ampères tuent les bactéries soit translocation à travers la membrane cellulaire et en interaction avec des composants intracellulaires tels que les acides nucléiques ou de perméabiliser la membrane provoquer des fuites de cellule contenu6. Outre leur utilisation comme les antibiotiques, les ampères de translocation peut-être être adaptée pour les demandes de livraison de drogue parce qu’ils peuvent traverser sans interruption de la membrane cellulaire imperméable7,8. Nous, donc, chercher à comprendre les mécanismes fondamentaux d’AMP d’action pour jeter les bases pour leur utilisation dans la conception de médicaments.
Microscopie confocale offre un moyen d’évaluer les modèles de localisation des amplis fluorescent étiquetés dans des cellules bactériennes pour mieux comprendre leur mécanisme d’action9,10,11,12, 13 , 14. par marquage de la membrane des bactéries, on peut déterminer si un peptide fluorescent étiqueté se localise à la membrane ou l’espace intracellulaire d’une cellule bactérienne. Cependant, cette technique est limitée par la petite taille et la tige forme des bactéries, ce qui peut rendre difficile en raison des limites de résolution des microscopes lumière conventionnelles et l’orientation variable des bactéries sur la diapositive15d’imagerie.
L’objectif de la méthode présentée est de permettre d’améliorer la visualisation des modèles de localisation peptide fluorescent étiquetés à l’aide de la microscopie confocale. Visualisation est renforcée en tournant la petite, mince, en forme de bâtonnet Gram-négatif Escherichia coli (e. coli) et Gram-positives Bacillus megaterium (b. megaterium) bactéries dans des formes sphériques, élargies dénommé sphéroplastes (pour les souches Gram-négatifs) et protoplastes (pour les souches Gram positifs)16,17,18,19,20,21. Sphéroplastes et protoplastes sont plus faciles à l’image à cause de leur augmentation de la taille et leur forme symétrique, ce qui rend l’orientation d’une bactérie sur une lame non pertinents pour son imagerie. En outre, nous présentons une approche systématique pour analyser quantitativement les données de microscopie confocale afin de caractériser les amplis comme une membrane localisation ou de translocation. Application de ces méthodes rend plus facile à distinguer fluorescent étiqueté modèles de localisation de peptide. Les protocoles présentés ici peuvent servir à évaluer la localisation d’une variété de membrane active agents autres que les amplis, y compris les peptides de pénétration cellulaire.
Un avantage de cette technique est qu’il permet de mieux comprendre le mécanisme d’action des amplis sur le plan de cellule unique, qui peut révéler la hétérogénéité de cellule-à15, par opposition à d’autres essais de fluorescence communément utilisé pour identifier les mécanismes d’action des amplis, qui fournissent seulement en vrac estimations9,22,23,24,25. L’utilisation de sphéroplastes et de protoplastes afin d’évaluer l’entrée de cellule de AMP est notamment utile26 parce qu’ils sont plus physiologiquement pertinents15 que les autres modèles utilisés pour évaluer l’entrée de cellule, tels que les lipides vésicules24.
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Protocol
1. préparation de la solution
NOTE : Préparer des solutions décrites aux étapes 1,1 et 1,9 et 1,8 – 1.11 afin de produire des sphéroplastes d’e. coli et b. megaterium protoplastes, respectivement.
- Préparer 1 M Tris-Cl, pH 7,8 en dissolvant 10,34 Tris HCl et 4,17 g de Tris OH dans 50 mL de dH2O dans un flacon de 125 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
- Préparer la solution A (20 mM MgCl2, 0,7 M de sucrose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) en dissolvant 0,10 g MgCl2 (95,2 g/mol) et 11,98 g de saccharose (342.3 g/mol) à 25 mL dH2O dans une fiole de mL 125. Ajouter 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) et régler le volume à 50 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
- Préparer la solution B (10 mM MgCl2, 0,8 M de sucrose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) dissoudre 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) et 13,69 g de saccharose (342.3 g/mol) à 25 mL dH2O dans une fiole de mL 125. Ajouter 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) et régler le volume à 50 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
- Préparer 0,8 M de sucrose en dissolvant 13,69 g de saccharose (342.3 g/mol) dans 50 mL dH2O dans une fiole de mL 125. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
- Préparer la désoxyribonucléase 5 mg/mL j’ai (DNase j’ai) en dissolvant 0,015 g DNase I dans 3 mL de dH2O dans un ballon jaugé de 50 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané. Solution aliquote dans des microtubes et conserver à-20 ° C.
- Préparer l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 0,125 M, pH 8,0 en dissolvant disodium EDTA g 0,698 déshydrater (372.2 g/mol) dans 15 mL dH2O dans un flacon de 125 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
- Préparer 600 cephalexin µg/mL en dissolvant 0,03 g d’hydrate de la céfalexine (365.404 g/mol) dans 50 mL de dH2O dans un flacon de 125 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à 4 ° C.
- Préparer lysozyme de 5 mg/mL en dissolvant le lysozyme de 0,015 g dans 3 mL de dH2O dans un ballon jaugé de 50 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané. Solution aliquote dans des microtubes et conserver à-20 ° C.
- Préparer 3 % p/v Trypticase Soy Broth (TSB) en dissolvant les 30 g de BST dans 1 L de dH2O dans un flacon de 2 L. Partie aliquote de la solution dans des fioles contenant 25 mL ou 100 mL du BST pour être utilisé dans la préparation des sphéroplastes d’e. coli ou les protoplastes megaterium b. , , respectivement. Flacons d’autoclave pour stériliser le milieu liquide. TSB stérile peut être conservé à température ambiante ou 4 ° C.
- Préparer la solution C (1 M de sucrose, maléate de 0,04 M, 0.04 M MgCl2, pH 6,5) en dissolvant 34,23 g de saccharose (342.3 g/mol), l’acide maléique 0,46 g (116.07 g/mol) et 0,38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dans 100 mL de dH2O dans un ballon jaugé de 250 mL. Ajuster le pH à 6,5. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
- Préparez 200 mL de milieu de protoplaste en mélangeant 100 mL 3 % p/v du BST et 100 mL solution C dans une bouteille de verre de 1 L. Autoclave pour stériliser la solution et stocker à température ambiante.
2. préparation de la Culture au jour le jour
Remarque : Effectuez les articles 2-4 à l’aide des techniques appropriées de stériles. Si vous le souhaitez, une souche bactérienne peut contenir un plasmide de résistance aux antibiotique réduire la contamination potentielle. Si vous utilisez une souche avec la résistance aux antibiotique, ajouter les antibiotiques nécessaires aux étapes 2.1, 3.1, 3.2 et 4.1-4.4.
- Préparer une culture durant la nuit en choisissant une seule colonie de bactéries à l’aide d’un embout de la pipette stérile et de le placer dans un tube à culture 14 mL contenant de 2 à 3 mL de 3 % p/v du BST. Incuber à 37 ° C, et en agitant pendant 16 à 21 h.
3. préparation des sphéroplastes Gram négatif Escherichia coli
- Dans un ballon jaugé de 250 mL, diluer la nuit culture au 1/100 dans 25 mL de 3 % p/v TSB et incuber la solution bactérienne à 37 ° C, et en agitant pendant environ 2,5 h, jusqu'à ce que la solution a atteint une densité optique de 0,5 à 0,8 à 600 nm. Mesurer la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Dans un ballon jaugé de 250 mL, diluer cette culture 01:10 à 30 mL de 3 % p/v TSB et incuber à 37 ° C, et en agitant pendant 2,5 h en présence de 60 cephalexin de µg/mL (347,4 g/mol) pour produire des filaments unicellulaires d’environ 50 – 150 µm de longueur , qui sont observables sous un grossissement de X 1 000, à l’aide d’un microscope optique (Figure 1 b).
- Récolter les filaments en centrifugeant la solution bactérienne à x 1 500 g, 4 ° C pendant 4 min. décanter et éliminer le surnageant, réservant le culot.
- Laver les filaments en ajoutant doucement 1 mL de 0,8 M de sucrose, en veillant à ne pas déranger le culot. Incuber pendant 1 min et puis jeter le liquide surnageant sans déranger le culot.
- Ajouter 150 µL de 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µL du lysozyme de 5 mg/mL, 30 µL de 5 mg/mL DNase I, ainsi que 120 µL de 0,125 M EDTA dans leurs respectifs afin de la pastille et incuber la solution à température ambiante pendant 10 min.
- Ajouter 1 mL de solution A progressivement pendant 1 min dans la solution préparée dans 3.5 à l’aide d’une micropipette tandis que doucement, agitant la solution à la main. Incuber la solution pendant 4 min à température ambiante.
- Mettre 7 mL de la solution B de 4 ° C en deux tubes coniques 15 mL. Ajouter une quantité égale de la solution préparée en 3,6 millions à chacun de ces deux tubes. Centrifuger la solution à 1 500 g, 4 ° C pendant 4 min.
- À l’aide d’une pipette sérologique, retirez soigneusement tous sauf 1–2 mL du surnageant sans déranger le culot. Resuspendre le culot de pipetage doucement et descendre à l’aide d’une micropipette P1000. Examinez-la pour voir la formation de sphéroplastes en observant l’échantillon à un grossissement de X 1 000, à l’aide d’un microscope optique (Figure 1).
- Stocker les sphéroplastes à-20 ° C pendant une semaine ou jusqu'à ce qu’ils ont passé par 3 cycles de gel-dégel.
4. préparation des protoplastes de Gram positif megaterium b.
- Dans un ballon jaugé de 250 mL, diluer la nuit culture 1 : 1 000 dans 100 mL de 3 % p/v TSB et incuber la solution bactérienne à 37 ° C, tout en agitant pendant environ 4,5 h, jusqu'à ce que la solution a atteint une densité optique de 0,9–1.0 à 600 nm. Mesurer la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Versez la culture liquide dans deux tubes conique de 50 mL et centrifuger à 2 000 x g, 4 ° C pendant 10 min.
- À l’aide d’une pipette sérologique, jeter le surnageant de deux tubes coniques. Resuspendre chaque culot dans 2,5 mL de milieu de protoplastes et combiner les solutions remises en suspension dans un tube conique unique. Distribuer la solution combinée de remises en suspension dans un flacon de 125 mL.
- Ajouter 1 mL de lysozyme de 5 mg/mL et incuber pendant 1 heure à 37 ° C, et en agitant.
- Surveiller la croissance des protoplastes sous un grossissement de x 1 000, à l’aide d’un microscope optique, notant toute irrégularité, tels que les bactéries qui apparaissent comme des tiges gonflées au lieu de sphères (Figure 2). À l’aide d’une pipette sérologique, transvaser la solution dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 2 000 x g, 4 ° C pendant 10 min.
- Éliminer le surnageant et remettre en suspension l’extrait concentré dans 5 mL de milieu de protoplastes. Stocker des protoplastes à-20 ° C pendant une semaine ou jusqu'à ce qu’ils ont passé par 3 cycles de gel-dégel.
5. préparation de la Solution de Peptide et Membrane colorant pour l’imagerie
-
Solution de peptide
- Dans un tube à centrifuger enveloppé dans du papier d’aluminium, dissoudre 2 mg de FITC étiqueté BF2 P11A 800 µL dH2O. utilisation d’un peptide contenant au moins un résidu tryptophane afin de réaliser des mesures de concentration de protéine.
- Par spectrophotométrie, mesurer l’absorbance de la solution de peptide à 280 nm en triple exemplaire. Calculer la concentration de peptide en utilisant le coefficient d’extinction molaire pour le tryptophane (5 700/Mcm).
- Diluer la concentration de peptide dans dH2O à une concentration finale de 100 – 200 µM. entreposer dans un tube à centrifuger à-20 ° C enveloppé dans du papier d’aluminium pour protéger de la lumière.
-
Colorant de membrane
- Dans un tube à centrifuger, préparation d’un stock de 10 mM de di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) en dissolvant 5 mg de di-8-ANEPPS en 843.3 µL de DMSO. Conserver à 4 ° C, enveloppé dans du papier d’aluminium pour protéger de la lumière.
- Dans un tube à centrifuger, préparer 1 mL de 0,03 mM di-8-ANEPPS en ajoutant 3 µL de 10 mM di-8-ANEPPS à 997 µL DMSO. Stocker dans un tube à centrifuger à 4 ° C, enveloppé dans du papier d’aluminium pour protéger de la lumière.
6. visualisation des sphéroplastes d’e. coli et des protoplastes megaterium b. à l’aide de la microscopie confocale
- Pipetter 5 µL de sphéroplastes ou protoplastes sur une lame de verre revêtu de poly-L-lysine. Ajouter 2 µL de FITC étiqueté AMP (100 à 200 µM) à la diapositive et incuber pendant 3 min, abri de la lumière.
- Ajouter 1 µL de la membrane colorant di-8-ANEPPS (0,03 mM) dans la diapositive et incuber pendant 3 min, abri de la lumière. Couvrir avec une lamelle de verre et sceller avec le vernis à ongles.
- Allumer le laser confocal de microscope et argon. Ajuster le laser à argon pour 20 % de la puissance et de transmission de 20 %.
- Définissez les gammes de longueur d’onde d’émission de 499 – 532 nm et 670 – 745 nm pour le canal d’émission peptide marqué FITC et la membrane di-8-ANEPPS-étiqueté colorant d’émission canal, respectivement.
- Les protoplastes image ou sphéroplastes (Figure 1 et Figure 2) avec un objectif X 63. Utiliser des logiciels d’imagerie pour obtenir 8 bits, 512 x 512 composite z-empiler les images composées de 0,5 µm de tranches de l’intégralité des sphéroplastes ou des protoplastes.
Remarque : Prendre un examen attentif pour réduire l’émission cordeau tout en imagerie de sphéroplastes et de protoplastes. Voir la discussion pour plus de détails.
7. caractérisation de la localisation de l’AMP
- Ouvrez l’image composite z-pile dans les logiciels d’imagerie. Repérez la tranche du centre-la plupart des sphéroplastes ou protoplaste et placez une région circulaire d’intérêt (ROI) (0,3 µm de diamètre) sur la membrane (1 ROI), un au centre des sphéroplastes ou protoplaste (retour sur investissement 2) et un de sphéroplastes ou protoplaste à mesurer la fluorescence de fond (3 ROI) (Figure 5). Éviter d’inclure des pixels saturés. L’intensité de fluorescence à chaque ROI peut être calculée par le logiciel d’imagerie.
Remarque : Dans les instances lorsque peptide ne pas localiser à la totalité de la membrane, tirer les ROI 1 sur une surface de la membrane où le peptide est localisé. - Utiliser l’équation suivante pour déterminer le ratio d’intensité de fluorescence du peptide intracellulaire à l’intensité de fluorescence de peptide membrane :
Remarque : L’intensité de fluorescence en ROI 3 est soustraite d’intensités de fluorescence en 2 de ROI et ROI 1 pour tenir compte de la fluorescence de fond.
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Representative Results
En agrandissant les bactéries et en les rendant sphérique, nous pouvons facilement distinguer peptides localiser à la membrane bactérienne ou déplacer facilement à travers la membrane bactérienne. Les limites de résolution des microscopes lumière conventionnelles rendent difficile de distinguer si les peptides signaux proviennent de la membrane ou l’espace intracellulaire chez les bactéries normales parce que les signaux localisées dans la membrane seront semblent se chevaucher avec la espace intracellulaire (Figure 3 a). En revanche, la taille élargie des sphéroplastes (2 à 5 µm) et de protoplastes (2 à 3 µm) par rapport à des bactéries normales, qui sont habituellement seulement 1 µm de diamètre, se traduit par une résolution claire entre le marqueur de la membrane et l’espace intracellulaire, ce qui facilite distinguer la localisation de peptide (Figure 3 b).
Ici, les sphéroplastes et protoplastes servent à afficher le modèle de localisation de la FITC N-terminale étiqueté AMP BF2 P11A. Nous observons que FITC étiqueté P11A BF2 pour localiser à la membrane et translocation à travers la membrane cellulaire des sphéroplastes d’e. coli et b. megaterium protoplastes (Figure 4). Alors que le type sauvage BF2 a observé d’effectuer des transferts à travers les membranes de vésicules e. coli et les lipides, la mutation P11A est connue pour réduire cette translocation13,27,28. Nous avons utilisé un non-antibiorésistantes b. megaterium et ampicilline résistante Top 10 e. coli (pET45B) dans les données présentées. L' ampicilline résistante e. coli a été cultivé en présence de l’ampicilline (349.4 g/mol) à une concentration finale dans une solution de 25 µg/mL. Imagerie, suivant la démarche systématique énoncée à l’article 7, ROIs ont été tirés sur la membrane, l’espace intracellulaire et le fond (Figure 5 b). Le ratio d’intensité de fluorescence du peptide intracellulaire à l’intensité de fluorescence du peptide sur la membrane a été calculé pour chaque sphéroplastes ou protoplaste interagissant avec BF2 P11A en utilisant l’équation décrite dans la section 7.2. Figure 5 a montre la répartition de ce rapport pour tous les sphéroplastes et protoplaste a marqué. Les sphéroplastes et protoplastes a marqué en grande partie sont tombés en deux groupes, la majorité des sphéroplastes ou protoplastes ayant un ratio de moins de 0,3 ou supérieur à 1.
Étant donné les groupes distincts qui les ratios tombent, nous avons défini la localisation de peptide comme translocation lorsque le ratio calculé dans la section 7.2 était supérieur ou égal à 1. À l’inverse, localisation de peptide a été définie comme membrane localisation lorsque le ratio décrit dans la section 7.2 était inférieur à 1. Suite à cette méthode de cotation, nous avons observé une tendance de localisation de semblable pour BF2 P11A dans e. coli sphéroplastes et b. megaterium protoplastes avec BF2 P11A localisation à la membrane dans 71 % et 70 % des cas pour e. coli sphéroplastes et B. megaterium protoplastes, respectivement (tableau 1).
Figure 1 : Images représentatives d’Escherichia coli. (A) e. coli serpent d’e. coli bactéries (B) et (C) e. coli sphéroplastes. Des images ont été prises à un grossissement de 100 X. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images représentatives de b. megaterium. (A) b. megaterium bactéries et (B) b. megaterium protoplaste. Des images ont été prises à un grossissement de 100 X. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images représentatives de b. megaterium. (A) b. megaterium cellule bactérienne et (B) b. megaterium protoplaste marquées avec le marqueur de membrane di-8-ANEPPS. Images de la z-pile intermédiaire sont affichées à 100 X (A) et 63 grossissement X (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Sphéroplastes représentant e. coli et b. megaterium protoplastes interagissant avec FITC marqués BF2 P11A. (A) affichage d’e. coli sphéroplastes BF2 P11A localisation à la membrane. (B) montrant des sphéroplastes e. coli BF2 P11A translocation à travers la membrane. (C) affichage de protoplastes de b. megaterium BF2 P11A localisation à la membrane. (D) affichage de protoplastes de b. megaterium BF2 P11A translocation à travers la membrane. E. coli sphéroplastes et b. megaterium protoplastes sont marqués avec la membrane marqueur di-8-ANEPPS (rouge) et FITC étiqueté P11A BF2 (vert). Images de la z-pile intermédiaire sont affichées à un grossissement de X 63. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : analyse des modèles de localisation de peptide de. (A) Distribution du ratio d’intensité de fluorescence intracellulaire (retour sur investissement 2) à l’intensité de la fluorescence membranaire (1 ROI) après soustraction du fond ((retour sur investissement 2-ROI 3) / (ROI 1-ROI 3)) pour e. coli sphéroplastes et b. megaterium les protoplastes étiquetés avec BF2 P11A (B) e. coli sphéroplastes interagissant avec FITC étiqueté P11A BF2. Circulaire régions d’intérêt (ROI) 0,3 µm de diamètre dessinée sur l’espace intracellulaire de membrane (ROI 1) (2 de retour sur investissement) et fond (3 ROI). L’intensité de la fluorescence du peptide a été quantifiée dans chaque ROI et la fluorescence de fond a été comptabilisée en soustrayant l’intensité de fluorescence en 3 ROI de l’intensité de fluorescence en ROI 1 et 2 de retour sur investissement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Souche bactérienne | Lol sphéroplastes ou protoplaste | Localisation de membrane % | Translocation % |
| E. coli | 84 | 71 | 29 |
| B. megaterium | 70 | 70 | 30 |
Tableau 1 : le modèle de localisation du BF2 P11A interagissant avec E. coli sphéroplastes et b. megaterium protoplastes.
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Discussion
Les protocoles présentés ici rendent possible pour les chercheurs d’obtenir plus rapidement grandes tailles d’échantillon d’images bactériennes parce que les bactéries sphériques, élargies sont beaucoup plus faciles à repérer, orienter et l’image. Cette capacité accrue pour recueillir des données est utile à plusieurs égards. Tout d’abord, elle permet une analyse quantitative plus systématique des schémas de localisation de peptide. Alors que les tendances qualitatives peuvent démontrer de plus petits ensembles d’images, seulement un ensemble de grands échantillons d’images de haute qualité révèlent plus nuancée des tendances dans les modèles de localisation, tels que le pourcentage de cellules où un peptide translocation versus se localise à la membrane. Aussi, la possibilité de mieux résoudre la fluorescence interne de la localisation de membrane rend plus facile effectuer des études afin d’évaluer la rapidité peptides interagissent avec les cellules bactériennes, ainsi que la façon dont les modèles de localisation évoluent avec le temps temps. La résolution améliorée permet également aux chercheurs d’examiner les tendances dans la localisation de peptide qui ne sont pas possibles avec les plus petites bactéries. Par exemple, dans certains de nos sphéroplastes observées et des protoplastes, peptides semblent localiser des sections spécifiques de la membrane, c'est-à-dire les signaux de peptide ne pas former un anneau complet et cohérent autour de la bactérie et au lieu de montrer certains ponctuée l’étiquetage. Dans d’autres cas, peptides ne devront pas être distribués entièrement uniformément à l’intérieur de la membrane bactérienne, c'est-à-dire, le peptide signaux ne pas remplir complètement l’espace intérieur de la bactérie. Alors que nous n’avons pas poursuivi ces tendances dans notre analyse de la conjoncture, compte tenu de ces tendances de localisation devient possible lorsque l’imagerie sphéroplastes et protoplastes au lieu de cellules bactériennes standards. Ces avantages s’appliquerait également à déterminer la localisation des peptides, autres que les amplis, tels que les peptides de pénétration cellulaire. Sphéroplastes et protoplastes produites avec ces approches peuvent aussi être utilisées pour les expériences sans imagerie qui bénéficient de l’augmentation de la taille cellulaire, comme le patch clamp électrophysiologie mesures18,19.
Un microscope confocal à balayage de laser a été utilisé dans le développement de notre protocole d’imagerie, mais il est essentiel d’optimiser les paramètres pour chaque système d’imagerie spécifique. Cela inclut la sélection d’un ensemble de paramètres qui maximisent la détection de la fluorescence de colorant peptide et de membrane, tout en minimisant le cordeau de la teinture de membrane dans le canal d’émission de peptide et de peptide FITC marqués dans de la membrane canal d’émission. Cordeau de peptide dans le canal d’émission de la membrane a été évité en sélectionnant une plage de longueur d’onde pour le canal d’émission de la membrane qui n’inclut pas une partie du spectre d’émission du FITC. Cordeau de la teinture de membrane, di-8-ANEPPS, dans le canal d’émission du peptide a été plus difficile à éviter, car le spectre d’émission des di-8-ANEPPS entre en conflit avec la majorité du spectre d’émission du FITC. Spécifique au présent protocole, cordeau de la teinture de membrane dans le canal d’émission du peptide peut entraîner la caractérisation fausse des amplis comme membrane localisée. On peut déterminer si le cordeau de cette nature se produit par imagerie sphéroplastes ou protoplastes qui sont étiquetés exclusivement avec de la teinture de la membrane et de vérifier si la fluorescence est visible dans le canal d’émission du peptide. Divers paramètres d’imagerie, y compris la gamme de longueur d’onde utilisée pour définir le canal d’émission de peptide et les valeurs de gain et d’offset, peuvent être systématiquement testés afin de déterminer un ensemble de paramètres qui minimise le cordeau. Une fois établi un ensemble de paramètres, il est essentiel d’évaluer si l’imagerie donne forte détection du signal de fluorescence lorsque sphéroplastes ou protoplastes marqués par agent de peptide et de membrane sont utilisés. Grâce à cette approche, nous avons réussi à établir des paramètres d’imagerie qui réduit au minimum l’effet de la cordeau tout en maximisant la détection de la fluorescence des AMP marqué FITC et la membrane teignent di-8-ANEPPS. Plus précisément, nous avons trouvé que l’émission cordeau de la teinture de membrane dans le canal de peptide a été minimisé en utilisant des gammes de longueur d’onde d’émission de 499 – 532 nm (peptide) et 670 – 745 nm (membrane), et lorsque le gain a été ajusté pour être ≤800 volts (V) (peptide) et ≤900 V (membrane) et le décalage a été ajusté à ≤ -10,0 % (peptide, membrane).
Bien que nous nous sommes concentrés sur les e. coli et b. megaterium, les protocoles présentés pourraient être adaptés pour produire des sphéroplastes ou des protoplastes de nombreuses différentes souches bactériennes. Par exemple, nous avons été en mesure de produire avec succès des protoplastes de Bacillus subtilis qui étaient de 1 à 2 µm de diamètre, en utilisant le protocole décrit dans la section 4, et des adaptations du protocole pourraient être apportées à optimiser davantage la taille. La capacité d’observer peptide modèles de localisation dans les bactéries Gram-négatives et Gram positifs est particulièrement utile pour l’étude des amplis parce que les différences dans la structure de la paroi cellulaire entre ces deux catégories de bactéries susceptibles d’affecter l’interaction ampères avec membranes cellulaires. Cependant, de nombreuses études d’imagerie des amplis à ce jour portent uniquement sur des souches d’e. coli de modèle et, par conséquent, peuvent ne pas refléter le comportement des peptides avec des souches de bactéries Gram-positives.
Sphéroplastes et protoplastes se distinguent des bactéries normales, surtout en l’absence d’une paroi cellulaire externe et par conséquent peut-être pas de bons modèles pour toutes les questions expérimentales. Par exemple, la membrane externe des bactéries Gram-négatives s’est avérée agir comme un tamis moléculaire de plus grandes molécules29. Peptides plus gros, donc, peuvent être en mesure d’effectuer des transferts en sphéroplastes quand ils ne le ferait pas chez les bactéries normales. En outre, des études détaillées de l’interaction de l’AMP avec la paroi cellulaire de bactéries, la membrane externe et la membrane cytoplasmique ne peuvent être effectuées à l’aide de sphéroplastes et protoplastes. Par exemple, les travaux récents du labo Weisshaar a utilisé d’imagerie pour noter les positions plus précises du peptide dans les mécanismes CM15 et mélittine action30,31. Cependant, notre approche, telle que décrite ici, ne nécessite pas la mise en œuvre de la microfluidique en instrumentation de microscopie afin d’atteindre la résolution requise31. Bien que les travaux antérieurs ont montré que les sphéroplastes sont viables21,32, ils néanmoins ont probablement des différences physiologiques et métaboliques des bactéries « normales » qui pourraient potentiellement modifier les interactions membrane dans certains cas. En outre, parce que nous n’avons pas évalué la viabilité des populations de sphéroplastes, on ne peut distinguer entre un peptide qui est facilement capable d’effectuer des transferts à travers la membrane cellulaire d’une cellule vivante contre un peptide qui peut seulement effectuer des transferts à travers un mort ou cellules mourantes. Malgré ces différences, nous avons vu des modèles de localisation dans e. coli sphéroplastes pour nombreux amplis qui sont conformes aux mécanismes connus d’action15et nos résultats pour BF2 P11A avec b. megaterium protoplastes présentées ici semble pas compatible avec d’autres observations pour ce peptide13,27,28. La composition de la membrane des sphéroplastes et protoplastes est aussi certainement plus physiologiquement pertinente que les mélanges typiques utilisés dans d’autres systèmes de modèle, tels que les vésicules lipidiques. En résumé, compte tenu de la résolution augmentée et la facilité de l’imagerie donné sphéroplastes et de protoplastes, nous croyons qu’ils sont des modèles utiles pour visualiser la membrane principes actifs, tels que SAP, dans une gamme de souches bactériennes.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne sont déclarés.
Acknowledgments
Recherche a été financée par l’Institut National des allergies et maladies infectieuses (NIAID-NIH) prix R15AI079685.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
References
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