En roman enda animaliska motorisk funktion spårningssystem med enkla, lättillgängliga programvara

Summary

Den aktuella studien syftade till att automatisera kvantifiering av motoriska brister hos råttor. Den inledande utvärderingsmodellen bedömer motor förlust till följd av en intracortical mikroelektrod implantation i motor cortex. Vi rapporterar om utveckling och användning av en algoritm för spårning som använder lätt att anpassa, enkel och lättillgänglig kodning programvara.

Abstract

Vi har nyligen visat att implantera intracortical mikroelektroder i den motoriska corteces råttor resulterar i omedelbar och varaktig motor underskott. Motoriska funktionsnedsättningar kvantifierades manuellt genom ett öppet fält rutnät test för att mäta den grov motorik och en stege-test för att mäta den fina motorik. Här diskuterar vi en teknik för automatiserad kvantifiering av de video-inspelade tester med vår anpassade Capadona beteendevetenskaplig analys videosystem: rutnät och stege Test eller BVAS. Att utnyttja enkel och lättillgänglig kodning programvara (se Tabell för material), detta program möjliggör spårning av ett enda djur på både öppna fältrutnätet och stege testerna. I öppna fältrutnätet spårning, kod tröskelvärdena video för intensitet, spårar positionen för råttan under 3 minuters testet rutnät och analyserar sökvägen. Därefter beräknar och returnerar mätningar för den totala tillryggalagda, den högsta hastighet som uppnås, antalet vänster - och högerhänta varv och det totala antalet rutnätets linjer korsas av råtta. I stege spårning, koden igen tröskelvärden videon för intensitet, spårar förflyttning av råtta över stegen och avkastning Beräknad mätningar inklusive den tid det tog råttan att korsa stegen, antalet tass glider inträffar under planet för den stege stegpinnar och förekomsten av fel på grund av stagnation eller återföringar. Vi föreställer oss att den BVAS framkallat här kan användas för analys av motorisk funktion i en mängd olika tillämpningar, inklusive många skada eller sjukdom modeller.

Introduction

Det finns många etablerade metoder för att bedöma både funktionella och beteendemässiga motor och kognitiva funktionsnedsättningar^1,2,3. Några av de mer vanligt sysselsatta metoderna inkluderar tester fina motorik via paw placering, kliva och lem samordning på en stege test⁴, testa grov motorik och stress beteende via öppet fält rutnät testet^{5 ,6}, och testning av rädsla, depression och förtvivlan via Tvingad simma test^7,8 eller rotor stav⁹. Emellertid, många av dessa metoder åberopa mänskliga forskare till ”Poäng” djuret eller att bedöma dess prestanda subjektivt. Behovet av en subjektiv mänskliga bedömning kan bromsa generation och analys av data, samt presentera möjligheten för en avsiktlig eller oavsiktlig påverkan av forskning bias i studien¹⁰. Ytterligare, subjektiva bedömning av data presenterar också risken för felaktig datarepresentation, genom glömska, dålig motivation, felaktig utbildning eller vårdslöshet¹¹.

Vi har nyligen rapporterat användning av både ett öppet fält rutnät test och en stege test hos råttor som implanteras med intracortical mikroelektroder^12,13. På grund av nya i slutsatserna i dessa studier, började vi genast anställa dem och ytterligare funktionell testning i många pågående studier i laboratorium. I väntan på oavsiktliga mänskliga-genererade variabilitet som följd av en ökning av antalet subjektiva utvärderarna, och att förbättra analys genomströmning, avsåg vi för att skapa en automatiserad, datorstödd program till Poäng beteendemässiga testning, och kraftigt begränsa risken för fel.

Här rapporterar vi om utvecklingen av BVAS. BVAS använder dator analys för att betyg ett öppet fält rutnät och en stege-proven som mätvärden av grov och fin motorik, respektive. Resultaten kan användas för att klarlägga möjliga motorik underskott orsakas av skada eller sjukdom, oavsett skada eller sjukdom modell. Analys-koder kan anpassas till kontot för förändringar i behavioral testutrustning eller Poäng olika mätvärden av motorisk funktion. Därför kan BVAS implementeras i många applikationer, bortom vår avsedda användning eller den avsedda användningen av dem för närvarande anställd av andra laboratorier.

Observera att öppet fält rutnät och stege testerna kräver videoinspelning. Varje test kommer därför kräva en videokamera [1080 p, minst 15 bilder per sekund (fps)], en laptop och ett utrymme för att lagra videodata. För båda testerna, placera kameran i en centrerad position, vilket möjliggör hela apparaten ska synas på ramen. Förankra kameran på ett stativ eller byggnadsställningar så att det inte rör sig under testningen. Hålla videobildrutan så nära kanter parallell med kanterna på testning apparaten som möjligt. Var noga med samma personal slutföra alla tester och rummet är väl upplyst med en temperatur-kontrollerad system. Använd samma utrymme för alla djur i hela loppet av testning, med minimala ändringar till rummet. Spannmål eller Bananchips göra bra belöningar att uppmuntra djuren att slutföra beteende tester.

Protocol

Alla förfaranden och djurvård praxis godkändes av och utförs i enlighet med Louis Stokes Cleveland institutionen av veteraner frågor medicinska Center institutionella djur vård och användning kommittén. Beteendemässiga testning protokollet följer tidigare publicerade arbete^12,13.

1. beteendemässiga testning: Filma uppgifterna

Obs: Här, djuren testades i 8 veckor för att upptäcka eventuella kroniska beteendeförändringar. Studievaraktigheten är beroende av den ansöka/skada/sjukdom modell som används för att studera.

1. Öppna fältprovning av rutnät
   Obs: Testet rutnät har en 1 m² med 40 cm väggar och byggdes internt. Botten är uppdelad i nio rutor via som ljust färgad tejp (figur 1A). För användningen av de automatiserade BVAS är det viktigt att färgen på linjen och rutnätet kontrast med råttan. Här användes vita Sprague Dawley-råttor; Således, grid bakgrunden målades svart, och linjerna skapades med ljusa rosa band.
   1. Testa djuren 2 x per vecka för alla tester inklusive veckan innan börjar studien för att skapa en baslinje-Poäng för användning i senare beräkningar.
   2. Ren all testning utrustning med en klor koldioxid-baserade steriliserande i början av varje test session och mellan varje djur.
   3. Ta djuren till rummet för testning och tillåta dem att anpassa sig till utrymme för 20 min före start prövningar.
   4. Börja filma och placera djuret i centrum av rutnätet, vänd bort från forskaren att börja testet rutnät.
   5. Låt djuret att köra fritt i 3 min medan video spelas från ovan.
   6. Stoppa inspelningen när 3 min tid är slut och tillbaka djuret till dess buren. Rengöra nätet med en klor koldioxid-baserade steriliserande, ta hand fullt torka ytorna innan testning. Testa varje djur 1 x per session.
2. Stege testning
   Obs: Testet stege byggdes in-house och består av två akryl sidoväggar, varje 1 m i längd, ansluten med 3 mm diameter stegpinnarna fördelade med 2 cm mellanrum (figur 2). Djuren behöver en vecka av stege utbildning innan du börjar den officiella tester. Föreligger ingen skillnad mellan utbildning och test protokoll. Observera att utbildningen inte behöver bli filmade.
   1. För användning med BVAS, täck väggen bakom stegen med en svart affisch styrelse och avgränsa nivån på stegpinnarna, start och mållinjen med ljusa tejp för att skapa en kontrast med de vita råttorna.
   2. Testa djuren 2 x per vecka för alla tester inklusive veckan innan börjar studien för att skapa en baslinje-Poäng för användning i senare beräkningar.
   3. Ren all testning utrustning med en klor koldioxid-baserade steriliserande i början av varje test session och mellan varje djur.
   4. Ta djuren till rummet för testning och tillåta dem att anpassa sig till utrymme för 20 min före start prövningar.
   5. Placera djuret i en rent tillfällig bur innan stege testning.
      Obs: En tillfällig bur är en kortsiktig bur att hålla djuret medan djurets buren används i slutet av stege. Det finns ingen ålder bias som alla djur som används i studien är samma ålder och komplett provning under samma tidsperiod. Den kontroll som används här är naiva djur som aldrig fått kirurgi.
   6. Ställ apparaten stege upp till span två burar; start buren är en ren bur, och slutet buren är djurets levande bur, ett incitament att slutföra körningen.
   7. Placera kameran på ett stativ, centrerad på längden på stegen. Utvidga stativ så linsen på kameran är på höjden av stege stegpinnarna. Placera kameran så att stegpinnarna är exakt i linje med objektivet eftersom detta är viktigt för slip upptäckten algoritmen i BVAS koden.
   8. Starta videoinspelningen och låt råttan att påbörja körningen genom att hålla sina främre tassar över första ringd av stege. Låt djuret att flytta till stege utan hjälp.
   9. Låt djuret att flytta från startlinjen till mållinjen i sin egen takt under inspelningen. Avsluta videoinspelningen och ta bort djuret från stegen när djuret har slutförts kör.
   10. Överväga kör en misslyckad kör om djuret vänder eller förblir stillastående för 20 s. slutet videoinspelning och ta bort djuret från stegen om djuret inte kör. Tilldela en straff Poäng för misslyckade körningar som motsvarar den långsammaste tiden registreras under före kirurgi baslinjen testningen.
   11. Säkerställa att varje djur genomgår 5 körningar per test dag och ge dem en 1 min viloperiod mellan varje försök.
       Obs: I denna studie, djuren var testade 2 x per vecka i 8 veckor. Tidsramen är dock upp till bedömning av forskaren.

2. lagring och namngivning av filer

Obs: BVAS koden använder särskilt utsedda video fil och mapp namngivning konventioner, så att videor kan tillförlitligt tolkas och analyseras ordentligt. Olika namngivningskonventioner stöds för närvarande inte. Efter slutförandet av en test session sparas videofilen i standardplatsen under ett standardnamn.

1. Enskilda video namngivning
   1. Namnge varje video med djurets beteckning för alla rutnät testning videor.
   2. Samla 5 stege videor per test session för varje djur. Välj alla fem videor och Byt namn på den första videon, med hjälp av djurets beteckning. Till exempel om djurets namn är ”C1NS”, filerna heter ”C1NS (1)” ”, C1NS (2)” ”, C1NS (3)”, osv
2. Lagring mapp namngivning
   1. Ta videor nu uppkallad efter varje djur och placera filerna i egen lagringsmapp. Namnge mappen enligt följande: ”TestingWeek_TestMode_MM_DD_YY”.
      Obs: om till exempel den här mappen rymmer den första veckan i rutnätet videor och filmades den 1 januari^st, 2018, mappen håller dessa filmer heter ”Week1_GridTest_01_01_18”.
   2. Placera denna specifikt namngiven mapp i en annan mapp som kommer att beteckna den större studien som denna uppsättning av experiment tillhör.
      Obs: Det finns ingen namnkonventioner för mappen träd systemet för att hålla studier och tester lägen organiserade. Systemet väljer bara en enda mapp är mappen holding videor namnges i steg 2.2.1.
3. Kalkylblad skapas
   1. Använda en utanför kalkylbladsprogram (se Tabell för material), skapa en ny tom kalkylbladsfil för att lagra data för varje undersökning och provning-läge.
      Obs: Det finns inga krav på namngivning eller lagring läge för den här filen. Varje studie kräver två kalkylbladsfiler för användning med systemet, en för rutnät testning och en för stege testning. Lämna dessa filer tom för nu.
   2. Kontrollera dessa kalkylbladsfiler inte är öppna på alla datorer medan BVAS körs.
      Obs: Om BVAS försöker öppna en kalkylbladsfil som redan är öppen, kommer detta resultera i ett fel.

3. system Installation

Obs: BVAS byggdes och testades på PC operativsystem och utnyttjar Runtime komponenter från enkla och lättillgängliga kodning programvara. Andra systemkonfigurationer stöds för närvarande inte.

1. Installera senaste BVAS versionen
   1. Kör installationsprogrammet genom att dubbelklicka på installationssymbolen märkt 'BVASX. XXinstaller'. ”X.XX” är det aktuella versionsnumret, för närvarande 'BVAS3.30installer'.
      Obs: Detta är programvara med öppen källkod. Kontakta motsvarande författare för den senaste versionen.
   2. Följ den på skärmen instruktioner för att installera BVAS.
      Obs: Installationsprogrammet kontrollerar systemet för rätt version av programvaran (t.ex., MATLAB Runtime) och om det inte finns, det kommer att installera programvara från internet.
   3. En gång installerat, starta programmet genom att klicka på den 'BVAS.exe' -fil.

4. systemanvändning

1. Öppna programmet
   1. Dubbelklicka på ikonen BVAS program att ta upp BVAS huvudmenyn vilket gör följande alternativ: 'Grid analys', 'Ladder analys', 'Ladder granskning' eller 'Quit'.
      Obs: Det finns också en rullgardinsmenyn i det övre vänstra hörnet märkt 'E-postinställningar' (figur 3A).
2. E-postinställningar
   1. Klicka på 'E-postinställningar' droppa-ned menyn och välj 'ändra e-destination' först.
   2. Ange en önskad e-postadress för att få uppdateringar om analysen och välj 'OK'. Välj 'Avbryt' du kan inte ändra e-post Sparad för tillfället.
   3. Klicka på knappen 'Skicka testa e-post' för att skicka ett testmail till den e-post som är sparade i systemet. Nära den 'Email sände!' fönster pop-up betecknar testets slutförande.
3. Öppna fält rutnät Test analys
   1. Välj 'Grid analys' huvudmenyskärmen.
   2. Se till att knappen märkt 'Enda Video/hela sessionen/ritdata' visar hela sessionen för att slutföra analysen på en hel uppsättning tester session videor.
   3. Använda knappen '...' bredvid rutan för övre ingång för att bläddra i filsystemet för att hitta filen för videor att analysera. Välj mappen märkt i stil diskuteras i steg 2.2.1.
   4. Utnyttja den... knappen bredvid rutan för lägre input för att bläddra i filsystemet för att markera den kalkylbladsfil som att lagra data.
      Obs: Observera att samt att mata ut data till en kalkylbladsfil ska fullständig sökväg data för varje video lagras i en datafil (.mat) i samma katalog som innehåller de videor som valdes i steg 4.3.3.
   5. Kontrollera växlingsknappen som nämns i steg 4.3.2 anges till 'Enda Video' för att slutföra analysen på en enda video.
   6. Utnyttja den... knappen bredvid rutan för övre ingång för att bläddra i filsystemet för att hitta filen i videon för att analysera.
   7. Utnyttja den... knappen bredvid rutan för lägre input för att bläddra i filsystemet för att välja en katalog att spara datafilen (.mat) som resulterar från den enda video analysen.
      Obs: Datafilen ska namnges efter den video som är uppkallad efter djuret.
   8. Välj 'Utdata' på växlingsknappen som nämns i steg 4.3.2. att mata ut data från ett tidigare analyserade rutnät video. Exempel på detta plottade data visas i siffror 1B och 1 C.
   9. Utnyttja den... knappen bredvid rutan för övre ingång för att bläddra i filsystemet för att välja en tidigare skapad grid videodata fil. Välj 'gå!' skapa figuren tomt och data.
      Obs: Denna funktion skapar också en textfil, heter samma och ligger i samma katalog som datafilen som har djuret run data i den.
   10. När båda nödvändiga filer har lokaliserats, Välj 'gå!' att börja den video analysen. Observera att knappen 'återgå' nyinvigs den översta menyn och knappen 'Quit' stänger programmet helt. Välj 'Debug Display' växlingsknappen för att visa en visuell representation av spårning algoritmen (siffrorna 3 c och 3D).
   11. Välj 'gå!' att starta analysprocessen. Granska bilder av varje video på skärmen granskare. Använd knapparna 'Nästa' och 'föregående' sida om det finns fler än fem videor.
   12. För att få upp en manuell markering-menyn, Välj knappen 'Redigera' om det finns inga gröna linjer eller den gröna linjen verkar inte vara i rätt torget runt området provning. Redigera hörnen, markera knappen 'Redigera hörn'.
       Obs: Ändras knappen 'Nästa bildruta' representativa bilden till nästa bildruta av videon i fråga. Välj knappen 'Nästa bildruta' om ramen automatiskt blockeras eller ofokuserad.
   13. Följ instruktionerna till höger av representativa bilden du välja området provning och tryck 'Enter' för att slutföra urvalsprocessen.
       Obs: De valda gröna linjerna nu visas på den representativa bilden.
   14. Välj 'gjort' Spara valet och återgå till skärmen granskare.
   15. Välj knappen 'gjort' center för att starta processen fullständig analys när rutnätet för varje video är korrekt vald. Tillåta programmet att köra och efter avslutad, en framgång prompt visas.
       Obs: Den fullständiga analysen i en session av videor kan ta lite tid, ca 10 min per djur.
4. Stege test analys
   Obs: Protokollet för inledande stege test analys är mycket liknande till det protokoll som beskrivs i steg 4.3.10–4.3.15. De anmärkningsvärda skillnaderna före dessa steg är följande:
   1. Välj 'Ladder analys' från menyn längst upp för att öppna menyn stege analys.
   2. Visa de två alternativen på växlingsknappen, 'Enda Video' och 'Hela sessionen' (figur 3B).
   3. Med 'Hela sessionen', Välj övre ingång... för att välja mappen med stege videor heter i steg 2.2.1.Select lägre... för att välja en katalog att spara en mapp med data från stege videor att granska senare.
   4. Om 'Enda Video' väljs, Välj en video fil med övre... knappen och ett läge samma som steg 4.4.3.
   5. Välj 'gå!' att starta analysprocessen och uppdra skärmen stege test område granskare.
   6. Följ steg 4.3.10–4.3.15 på samma sätt för stege som för rutnätet. Tillåta programmet att köra och efter avslutad, en framgång prompt visas.
      Obs: Om något går fel under analysen, en email är sände till den epostadress som angetts i steg 4.2.2. Efter avslutad analys av något slag, är en avslutad email sände till samma mejladress.
5. Stege Bildgranskning
   Obs: Följande protokoll är att granska tidigare analyserade stege videor för att bekräfta eventuella fel och paw följesedlar. Observera, kalkylbladsfiler för en stege korsning inte genereras Visa förrän 'Ladder Bildgranskning' (steg 4.5.1–4.5.5) är klar.
   1. Från huvudmenyn, Välj 'Ladder Bildgranskning'. Detta tar upp skärmen stege granska fil Välj.
   2. Markera toppen... för att välja mappen i datafilerna.
      Obs: Filerna sparas på den plats som valts i steg 4.4.2 och namnges i följande format: ”M1_D1_Y1 stege Video Session HH_MM M2_D2_YYYY”. M1, D1 och Y1 är datum för sessionen analyseras. ”Stege Video Session” läser ”enda videoanalys” om bara en enda video analyserades. HH_MM och M2_D2_YYYY är tid och datum som granskning sessionen startades.
   3. Välj längst ner... för att välja den kalkylbladsfil som skapats för studien.
   4. Välj 'gå!' att starta manuell granskningsprocessen.
   5. Visa menyn automatiskt öppnade stege data granskare. Om en slip upptäcks, använda den 'Nästa bildruta' och 'Sista bildrutan' knapparna för att kontrollera någon konsekutivt inspelade bildrutor om tillgängligt.
   6. Utnyttja slip växlingsknappen för att beteckna vad foten av råtta har halkat. Lämna växlingsknappen på 'No Slip' om detektion är ett falskt positivt. Klicka på 'Spara/Fortsätt' för att gå vidare till nästa upptäckt (figur 2A).
   7. Vid fel, Använd växlingsknappen för att beteckna om misslyckandet beror på återföring (där råttan vände under körning) eller stagnation (där råtta inte gick att slutföra körningen i tid).
   8. Klicka på 'Spara/Fortsätt' för att gå vidare till nästa upptäckt. Senaste upptäckt, klicka på 'Spara/Fortsätt' för att slutföra analysen och spara data till kalkylbladsfilen valt tidigare. Avvisa meddelandet om slutförande.
      Obs: När översynen är klar, döps mappen som granskades ”RECENSERADE M1_D1_Y1 stege Video Session HH_MM M2_D2_YYYY”.

5. output Data-analys

1. Grid kalkylbladsfil
   1. Leta upp skapade data i kalkylbladsfilen från varje rutnät video.
      Obs: Kolumnerna är vänster till höger enligt följande: djur namn, datum för testet, vecka studienummer, total sträcka rest, total tid stannade, maximal hastighet uppnåtts, just vänder, vänster vänder och rutnätslinje passerar (figur 1D).
   2. Använd dessa mätvärden för att kvantifiera brutto motor prestanda och skapa jämförelse tomter mellan djur och tidpunkter.
2. Stege kalkylbladsfil
   1. Söka efter skapade data i kalkylbladsfilen från varje stege video efter misslyckandet och tass slip granskning.
      Obs: Kolumnerna är vänster till höger enligt följande: kör nummer 1 – 5, vecka av studienummer, djur namn, datum för test, kör typ (antingen framgång eller misslyckande), tid av kör för framgångar, procent slutförande, paw följesedlar på varje tass, och felmoder. Kolumnen tid är tomt för ett misslyckande och kolumnen fel läge läser antingen återföring eller stagnation (figur 2B).
   2. Använd dessa mätvärden för att kvantifiera den fina motor prestandan och skapa jämförelse tomter mellan djur och tidpunkter.

Representative Results

Efter de metoder som presenteras här, råttor slutförts öppna fältrutnätet och stege tester 2 x per vecka. Data analyserades med hjälp av BVAS såväl manuellt med ett stoppur av utbildad och nybörjare recensioner. De resultat som presenteras är ett genomsnitt av de veckovisa råpoäng från ett enda icke-implanterade kontroll djur över en 8 veckors studie där vecka ”0” motsvarar baslinjen testning. Notera fanns inga tester under vecka 1 eftersom detta var resten veckan för kirurgi djuren. Eftersom rutnätet öppet fält är testade 1 x per dag, stegen är testade 5 x per dag, och det finns två testning dagar per vecka, det finns ett urval av 16 studier för öppen fältrutnätet medan det finns 80 prövningar för stege test i samma 8 vecka tidsperiod.

BVAS vs. manuell analys:
För att bekräfta konsekvens av BVAS systemet och verifiera den mot manuell analys, jämfördes resultaten för rutnätslinjer korsade och stege överfart till manuell resultaten från tre sakkunniga granskare (n = 3) som en ”gold standard”. Nybörjare (n = 7) också granskade uppgifterna både manuellt och med hjälp av BVAS. För validering, varje granskare undersökte samma en dag av experiment för ett djur (grid testning = en video/rättegång; stege testning = fem oberoende studier). Resultaten för öppet fält rutnät testet visade att expert recensioner var mer konsekvent än nybörjare recensioner var (en variansen för 0 kontra en variansen för 17,1, respektive), men när du använder BVAS, det fanns noll variansen för både expert och novis användare ( Figur 4 A). likaså resultaten för stege testet visade att expert recensioner var mer konsekvent än nybörjare recensioner var (~3.5x större: en varians av 0,120 kontra en varians av 0.414, respektive), men när du använder BVAS, det fanns igen noll variansen för både expert och novis användare (figur 4B).

Därför, där möjligt, beteende mätvärden för både öppet fält rutnät och stege testa var kvantifieras manuellt av samma expert användare och jämfört med de resultat som genererats med BVAS. Här utvärderades resultaten från alla inkluderade djur under hela varaktigheten av experimenten. Alla fel rapporteras som en standard standardfel (SEM) såvida rapporterade annars. Skillnaden mellan de två metoderna varierade från ett genomsnitt på 0,64 ± 0,06 s för stege test och 3,56 ± 0,53 linjer för rutnät testet. Den genomsnittliga skillnaden för öppet fält rutnät testet under loppet av 8 veckor mellan de två metoderna var 11.13 ± 3,03%. Den genomsnittliga skillnaden för stege testet under loppet av 8 veckor mellan de två metoderna var 9.05 ± 1,07 procent. Procentuella skillnaden mellan de två metoderna beräknades följande ekvation 1.

Ekvation 1:

Obs även för stege testa timing, manuella datainsamlingen är bara exakt 1 s (som kan ändras baserat på den enhet som används för att hålla tid), medan BVAS är exakt mot inversen av bildhastigheten för den video som granskas. Om videon är filmad på 15 bilder per sekund, är exempelvis BVAS data exakt till 1/15^{: e} sekund.

Öppna fältet rutnät test:
Efter tidigare publicerade protokoll^12,13, djur tilläts att köra fritt i ett öppet fält rutnät test för 3 min att mäta deras grov motorik och stress beteende. Den video som spelats in under testningen analyserades med hjälp av BVAS för att kvantifiera de råa noter för den högsta hastigheten, det totala avståndet, hur många stödlinjerna korsade och andelen högersvängar som uppnåtts av djur (figur 5). Dessa data är endast ombud för ett djur, sågs trender under loppet av studien av ökad maximal hastighet uppnås, ökad total tillryggalagd sträcka, och ett ökat antal stödlinjer korsat. Föga förvånande, jämfört med varandra, det totala avståndet reste, och den totala stödlinjer som korsade hade en stark positiv korrelation. Jämföra den manuella kvantifieringsgränsen till BVAS stödlinje kvantifiering visat jämförbara resultat (bild 5C). För denna särskilda djur svävade andelen högersvängar i hög grad mellan 40% och 50% (figur 5D). Notera har mätvärden för den totala tillryggalagd sträcka, maximal hastighet och vända riktning kunnat kvantifieras manuellt, och representerar en annan extra funktion av automatiserade BVAS programmet.

Stege-test:
Som tidigare rapporterats^4,14slutfördes stege testning för att mäta samordnat grepp och fina motorik. Den video som spelats in under testningen analyserades med hjälp av BVAS för att kvantifiera råpoäng för tid att korsa och antalet tass följesedlar (figur 6). I detta djur fanns det en nedåtgående trend i tid att korsa stegen, följt av en ökning av tid börjar runt vecka 4. Jämföra den manuella kvantifieringsgränsen till BVAS avslöjade korsning tid kvantifiering jämförbara resultat(figur 6). Eftersom djuret presenteras var en icke-kirurgisk kontroll, var tass följesedlar sällan, och jämförbara i antal mellan vänster och höger tass (figur 6B).

Figur 1 : Exempel på öppet fält rutnät testresultat. (A) denna panel visar den beteendemässiga testning 1 m² öppna testning med en svart bakgrund och rosa rutnätslinjer. (B) Detta är ett exempel på en tomt på en enda djurets 3-min rutnät kör. Detta djur gjorde en krets i rutnätet och sedan förblev mestadels stilla för resten av tiden. Den röda O och x betecknar där den tur upptäckt algoritmen upptäcks en vänster (O) eller en rättighet (X) Stäng. (C) Detta är en andra exempel på en tomt på en enda djurets 3-min rutnät kör. Detta djur var mycket aktiv under hela 3-min testning. Den röda O och x betecknar där den tur upptäckt algoritmen upptäcks en vänster (O) eller en rättighet (X) Stäng. (D) Detta är ett exempel på utdata i datafilen för de två körningar sett i paneler B och C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Exempel på en stege data reviewer skärm. (A) denna panel visar stege data reviewer skärm, komplett med en skärmdump som visar den stege provuppställning. Den här skärmen är där användaren kommer att bekräfta upptäckta följesedlar och misslyckanden. Detta exempel visar ett positivt upptäckta höger tass-slip. (B) Detta är ett exempel på utdata i datafilen för stege kör som undersöktes i panel A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Exempel på BVAS analys skärmar. (A) denna panel visar huvudmenyn i BVAS. Observera de fyra knapparna längs botten och E-postinställningar nedrullningsbara menyn i det övre vänstra hörnet. (B) Detta är ett exempel på en fil val av skärm, i detta fall för stege video analys. (C) Detta är ett exempel på en debug analys viewer för en grid test video. Detta visar den upptäckt algoritmen under analysen av ett rutnät test. (D), denna panel visar ett exempel på en debug analys viewer för en stege test video. Detta visar den upptäckt algoritmen under analysen av en stege test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 : Exempel på expert och nybörjare testresultat. Dessa paneler visar resultaten av en manual och en BVAS expert och novis testning för (A) hur många stödlinjerna korsade på öppet fält rutnät test och (B) tid att korsa på stege testet. För båda testerna visade resultaten att expertanvändare hade en lägre varians än nybörjare för manuell analys, medan använder BVAS resulterade i noll varians, oavsett den användare expertisen. Standardavvikelsen är rapporterade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 : Representativa öppna fält rutnät testresultat. Dessa paneler visar representativa öppet fält rutnät testresultat för ett icke-implanterade kontroll djur för (A) högsta hastighet uppnås, (B) totalen tillryggalagda, (C) det totala antalet stödlinjerna korsade och (D) den procentandel av högersvängar som gjorts av djuret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 : Representativa stege testresultat. Dessa paneler visar representativa stege testresultat för en icke-implanterade kontroll djur för (A) tid att korsa stege, och (B) antalet av höger - och vänster-framsidan-tass följesedlar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den mest kritiska delen av protokollet att säkerställa en stark analys är konsekvent inspelningen. Om filmerna är väl upplysta och filmade på rätt position som diskuteras i det första avsnittet i protokollet, kommer systemet att kunna göra en exakt analys. Som med någon bild-bearbetningen problem, blir det arbete i förbehandling efterbehandling mer exakt och enkel. Som sådan, innebär se till att de apparater och djur är väl upplyst under testningen och några skuggor eller andra rörelse i ramen hålls till ett minimum BVAS kan fungera på en högre nivå av noggrannhet.

Det protokoll som presenteras här kan användas för att effektivt och reproducibly analysera resultaten från både grov och fin motorik testning i gnagare via ett öppet fält rutnät och en stege test. Dessutom minskar det risken för mänskliga fel eller partiskhet i analysprocessen eftersom dataanalys slutförs i hög grad av egen fungerande datorn utan någon användarindata. På grund av denna funktion, kan BVAS systemet användas med samma nivå av noggrannhet av både expert och novis användare. BVAS programmet är egenkontroll, lätt att genomföra och billig att använda. Ytterligare, koden kan anpassas att passa forskarens enskilda behov. Till exempel öppet fält rutnät koden kan användas för att analysera en mängd mätvärden inklusive totala tillryggalagd sträcka, maximal hastighet uppnås, och numrera av vänster och höger visar, och sannolikt kunde modifieras enkelt för spårning i en vatten-labyrint eller tvingas simma t fråga. Ytterligare ändringar kan göras till koden för varierande rumsbelysning, skillnader i rutnätet och stege Linjefärg och skillnader i djurens färg. Även testning apparaten och BVAS koden presenteras här var avsedd för deras användning i studier på råtta, förväntar vi oss att antingen kunde skalas upp eller ned för att användas med olika stora djur, även om detta inte har verifierats hittills.

Som med alla tester och data analys av beteende, är det viktigt att så mycket som möjligt under hela studien och efterföljande analyser. Även om det presenteras BVAS minskar all tillit till människors input för dataanalys, kan mänskliga varians komma spelar in med forskaren arbetar med djur och hanterar de förfarande¹⁵. Dessutom kan förändringar i test läge¹⁶ eller bostäder och djurhållning villkorar¹⁷ också påverka resultaten. Medan BVAS kan uppdateras till konto för belysning och kameravinkel, kan faktorer såsom lukter, personal eller kost endast redovisas vid tidpunkten för studien. Forskare bör därför vidta försiktighet att förbli lika konsekvent som möjligt i djurförsök och boendeförhållanden, testa personal och analytiska metoder, bland annat.

BVAS är roman på grund av dess sammansatta detektionssystem. Varje bildruta i videon är passerade flera bildfilter att skapa binära masker alla kalibrerad för att leta efter råttan i ramen. Varje möjligt råtta form är sedan betygsatt av systemet på dess sannolikhet att råttan. Denna värdering faktorer i storlek, antalet filter formen upptäcks på, och den senaste kända platsen och förutspådda platsen för djuret baserat på den föregående banan. Detta gör för en stark djur identifiering som kan lösa de flesta problem som uppstår baserat på skuggor och förändringar i belysningen. Till skillnad från nuvarande kommersiellt tillgängliga djur spårningssystem, denna metod kräver inte några ändringar till djuret att göra den mer synlig och använder en enda standard-hastigheten webbkamera för videoinspelning. Systemets BVAS är också en förbättring över konventionella manuellt kvantifierade beteende testning eftersom alla mätvärden som är utdata mäts objektivt från videor. En kvantifierad beteendemässiga studie kommer att ha några subjektivitet i naturen som forskaren bestämmer vad som utgör en tass slip eller rutnät linje kors.

Systemet kräver en något specifika inställningar att fungera till dess fulla kapacitet. Det är möjligt att anpassa systemet till förändringar i apparaten, kräver för närvarande vissa kunskaper i dator kodning för att redigera koden. Med vissa kodning flyt görs felsökning lätt eftersom felet märka e-post inkluderar en full fel information avläsning. Om de videor som matas in i systemet inte är i perfekt upplösning eller ram takt (1080 p, 15 fps), är användaren skärpt via ett varningsmeddelande. Detta kommer påverka riktigheten i systemet, men det kan fortfarande köras på lägre upplösning videor. Eventuella belysning eller skugga problem som orsakar ett fel under analysen kommer att leda till en dynamisk felmeddelande som skickas till den angett e. Användaren kan sedan använda debug betraktaren att titta på den bildruta för bildruta analysen för att förstå vad problemet uppstod. Felmeddelandet innehåller också ett fel rapportera, så om det är en kodning problem, det kan åtgärdas enkelt.

I framtiden kan BVAS systemet kunna anpassas ytterligare utan någon kunskap om syntaxen från kodning programvara. Tillägg av en spårning alternativ-menyn kan tillåta användaren att välja färg på raderna djur och rutnät helt enkelt och bekvämt. Stege testet spårning kommer också att öka noggrannheten med möjliga tillägg av en kaskad objekt detektor i koden och en bättre stege belysning rigg till åtfölja stege testet och filmar apparater. Därför förväntar vi oss att BVAS systemet beskrivs här lätt kan genomföras i en array av beteendemässiga och motoriska funktion arbetsuppgifter spänner över ett brett utbud av sjukdom och skada modeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rats, male, 201-225 g	Charles River	CD
Webcam HD Pro c920	Logitec	960-000764
Excel	Microsoft	N/A
Matalb 2017a, Computer Vision System Toolbox	Mathworks	N/A
Open field grid test	Made in-house at Case Western Reserve University	N/A
Ladder test	Made in-house at Case Western Reserve University	N/A