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Developmental Biology

Réversion chimique des cellules souches pluripotentes humaines classiques à un état semblable au naïf avec une puissance améliorée de différenciation multilignée

Published: June 10, 2018 doi: 10.3791/57921
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons un protocole pour la reversion chimique efficace, rapide et en vrac de classiques pluripotentes humaines lineage-amorcé des cellules souches (hPSC) dans un état de préimplantation épiblaste comme pluripotentes naïve epigenomically stable. Cette méthode se traduit par l’expression des gènes de lignée-amorcé une baisse et une amélioration marquée dans la différenciation multilignée dirigée à travers un vaste répertoire des lignes classiques hPSC.

Abstract

Naïve des cellules souches pluripotentes humaines (N-hPSC) avec une fonctionnalité améliorée peut avoir un large impact en médecine régénérative. Le but du présent protocole est revenir efficacement les cellules souches pluripotentes humaines lineage-amorcé, conventionnel (hPSC) maintenus sous conditions soit sans chargeur ou alimentation dépendant à une pluripotence naïve comme avec une fonctionnalité améliorée. Cette méthode de réversion naïf chimique emploie le facteur inhibiteur de leucémie classique (LIF), GSK3β et MEK/ERK inhibition cocktail (FRV-2i), additionné de seulement un inhibiteur de la tankyrase XAV939 (LIF-3i). FRV-3i revient hPSC traditionnelle à un état stable pluripotentes adoptant biochimiques, transcription et des fonctionnalités épigénétiques de l’épiblaste avant l’implantation humaine. Cette méthode de FRV-3i nécessite la manipulation de la culture de cellule minimale et est hautement reproductible dans un vaste répertoire de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des lignées de cellules souches (hiPSC) exempt de transgene humaines pluripotentes induites. La méthode FRV-3i ne nécessite pas une ré-amorçage étape avant la différenciation ; N-hPSC peuvent être différenciés directement avec des rendements très élevés et de maintenir caryotypique et épigénomique stabilités (y compris aux imprimés loci). Afin d’accroître l’universalité de la méthode, hPSC classique sont tout d’abord cultivé dans le cocktail de FRV-3i additionné de deux autres petites molécules qui potentialisent la protéine kinase A (la forskoline) et sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) signalisation (FRV-5i). Cette brève étape adaptation de FRV-5i considérablement améliore l’expansion clonale initiale des hPSC classique et leur permet d’être naïf-revenue par la suite avec FRV-3i seul en grandes quantités, ce qui éviterait la cueillette/subcloning rare N-hPSC colonies plus tard. HPSCs LIF-5i-stabilisé sont maintenus par la suite en FRV-3i seuls sans avoir besoin de molécules anti-apoptotiques. Plus important encore, réversion FRV-3i améliore nettement la pluripotence fonctionnelle d’un vaste répertoire de classique hPSC en diminuant leur expression de gène lineage-amorcé et effacement de la variabilité de l’interligne de différenciation dirigée communément observé parmi les lignes de hPSC indépendants. Caractérisations représentatives de N-hPSC LIF-3i-revenue sont stratégies fournis et expérimentales pour les comparaisons fonctionnelles de hPSC isogénique dans lineage-amorcé vs. naïve comme États sont décrits.

Introduction

Le système de culture 2i (inhibiteur de la MEK/ERK et GSK3β) a été développé pour améliorer les cultures des cellules souches embryonnaires (mESC) hétérogènes axée sur le sérum de souris à un état fondamental uniform de pluripotence s’apparente à l’épiblaste préimplantatoire souris1. Cependant, 2i ne supporte pas le maintien stable de pluripotentes humaines les cellules souches (hPSC) lignes2. Les différents complexes petites molécules, additionné de facteur de croissance et les approches transgéniques ont récemment été rapportés pour capturer putativement similaires naïve comme pluripotentes moléculaire indique2. Toutefois, nombre d’Etats « naïve-like » a aussi créés avec ces méthodes exposées caryotypique instabilité, épigénomique défauts (par exemple, la perte globale de l’empreinte génomique parentale) ou affaiblies potentiel de différenciation.

En contraste, le cocktail de triple inhibition chimique de GSK3β, ERK et signalisation de la tankyrase et facteur inhibiteur de leucémie (LIF-3i) était suffisant pour que la réversion naïve comme stable d’un vaste répertoire de classiques hPSC lignes3. FRV-3i-revenue naïve hPSC (N-hPSC) maintenu caryotypes normaux et ont augmenté leurs expressions de gènes de l’épiblaste préimplantatoire humaine naïve spécifiques (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). FRV-3i reversion conférée aussi hPSC avec un éventail de caractéristiques moléculaires et biochimiques particulières à la pluripotence mESC comme naïve qui inclus STAT3 phosphorylée de signalisation accrue, diminution de la phosphorylation de ERK, global 5-méthylcytosine CpG l’hypométhylation, déméthylation CpG génome dans les cellules souches embryonnaires (CSE)-promoteurs de gènes spécifiques et l’utilisation dominante de renforceur du OCT4 distale. Par ailleurs, en comparaison avec d’autre naïve des méthodes de réversion qui ont abouti à aberrantly hypométhylés imprimé locus génomiques, N-hPSC LIF-3i-revenue étaient dépourvues de perte systématique d’imprimés motifs CpG ou d’expression de l’ADN méthyltransférase (par exemple, DNMT3B DNMT1, DNMT3A,)3.

Une culture de FRV-3i directe d’un large éventail de classiques cellules de souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC) cultivées sur des mangeoires ou des conditions E8 chargeur atteint retour rapide et en vrac à un État épiblaste naïf. Toutefois, direct FRV-3i naïf reversion peut être inefficace dans certaines lignées hPSC classiques instable en raison les variabilités de génomiques et de la lignée-amorcé inhérentes découlant issus des milieux donneur génétiquement diversifiés.

Ainsi, pour accroître l’utilité de la méthode FRV-3i, une optimisation progressive a été développée et est présentée ici, qui permet de réversion naïf universel avec presque n’importe quel CSEh classique ou libres transgène hiPSC ligne cultivées sur les mangeoires. Cette méthode de réversion naïf universalisé emploie une étape transitoire culture initiale en hPSC classique qui complètent le cocktail FRV-3i avec deux autres petites molécules (FRV-5i) qui potentialisent la protéine kinase A (la forskoline) et sonic hedgehog (sHH) ( signalisation de Purmorphamine). Un passage initial de hPSC classique en FRV-5i adapte à ultérieure stable FRV-3i réversion en grandes quantités. Adaptation de FRV-5i initiale augmente significativement la prolifération clonale initiale seule cellule des hPSC classique cultivée sur E8 ou mangeoires (avant leur adoption subséquente de stable et continue en FRV-3i seul). Lignes hPSC conventionnel adaptés tout d’abord à un passage en FRV-5i tolèrent subséquentes en vrac clonale passage des naïfs-revenue des cellules dans des conditions de FRV-3i, qui élimine la nécessité pour la récolte et subcloning de rares colonies stables, ou l’utilisation systématique de molécules anti-apoptotiques ou inhibiteurs de protéine associée à Rho kinase (ROCK).

La méthode FRV-3i a été avec succès employée stablement développer et maintenir un vaste répertoire de > 30 lignes hPSC classiques indépendants et génétiquement diversifiée pour > 10 – 30 passages à l’aide de deux méthodes de dissociation non enzymatique ou enzymatique, et sans preuve d’induction de chromosomiques ou d’anomalies épigénomique, y compris les anomalies à l’imprimé locus. En outre, séquentiel FRV-5i/FRV-3i culture est la méthode la réversion seule naïve qui a jusqu'à présent été signalée qui améliore la pluripotence fonctionnelle d’un vaste répertoire des lignes conventionnelles hPSC en diminuant leur expression de gène lineage-amorcé et considérablement améliorer leur potentiel de différenciation multipotentes. Le FRV-3i naïf reversion méthode efface l’inhérente interligne de variabilité de la différenciation des lignes conventionnelles, apprêtée à la lignée hPSC et aura une grande utilité de l’application en médecine régénératrice et de thérapies cellulaires.

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Protocol

Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées conformément aux directives de protection des animaux et les protocoles approuvés par la Johns Hopkins School d’Institut de médecine de soins des animaux et le Comité d’utilisation (IACUC).

1. préparation de le fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) pour Feeder-dépendante conventionnel (CSEh moyen/MEF) ou naïf-rétabli (FRV-3i moyen/MEF) hPSC Culture

  1. Acheter ou préparer des fournitures de basse-passage internes de mangeoires MEF de CF1 ou CF1 x DR4 hybride E13.5 des embryons de souris suivant les protocoles publiés4.
    1. Cryopréserver des cultures MEF passage bas (p1-p2) avant (pour l’entreposage à long terme) ou après (pendant 6 mois) l’irradiation et le magasin dans l’azote liquide comme décrit plus haut4.
    2. Irradier (5 000 rad) en vrac MEF élargi sous p5 en utilisant un γ - ou X-ray-irradiateur et préparer des aliquotes à 1,5 x 106 cellules par flacon pour stockage de courte durée (moins de 6 mois) à-80 ° C dans un congélateur ultra basse température.
    3. Plaque entre 1,2 x 106 (fraîchement irradiés non cryoconservés) et 1,5 x 106 (irradié cryoconservés) MEF par une plaque de 6 puits gélatinisée pour la préparation des cultures de l’alimentation, comme décrit ci-dessous.
  2. Préparer enduit de gélatine 6 puits stériles imprégnées de culture tissulaire plaques en ajoutant 1,5 mL de solution stérile de gélatine 0,1 % à chaque puits dans une armoire de sécurité biologique.
  3. Enduit de gélatine incuber à 37 ° C pendant au moins 1 h ou toute la nuit dans une étuve de laboratoire CO2 .
  4. Le lendemain, décongeler le passage bas (p. ex., P2 à P4) cryoconservés DMSO et irradié (5 000 rad) MEF selon les étapes indiquées ci-dessous.
    Remarque : Non irradiées MEF devrait également être décongelé, élargi et irradié immédiatement avant son utilisation.
  5. Placer une aliquote MEF cryoconservée dans un bain-marie à 37 ° C. Après décongélation, stériliser le tube avec de l’éthanol et diluer immédiatement le cryoprotecteur DMSO au moins 10 fois avec moyen de force expéditionnaire des marines (tableau 1) au sein d’une cabinet de biosécurité (par exemple transfert 1 mL de DMSO-MEF aliquote dans 9 mL de milieu de force expéditionnaire des marines dans un stérile de 15 mL conique).
  6. Centrifuger les cellules de force expéditionnaire des marines dilués à 200 x g pendant 5 min en tube conique stérile de 15 mL.
  7. Dans une armoire de biosécurité, aspirer et jeter le surnageant acellulaire et Resuspendre le culot dans un milieu MEF frais 1 à 2 mL.
  8. Doucement, jeter la solution de gélatine et ajouter 2 mL de MEF remis en suspension dans le milieu MEF dans chaque puits d’une plaque de 6 puits gélatinisée, tel qu’indiqué ci-dessus. Cellules de numération MEF et plaque 1,2 x 106 (fraîchement irradiés non cryoconservés) ou 1,5 x 106 (irradié cryoconservés) MEF par une plaque gélatinisée 6 puits.
    Remarque : Toutes les plaques de culture cellulaire qui sont transférés de l’incubateur à CO2 à la biosécurité du cabinet peuvent être essuyées délicatement avec du papier arrosée à l’éthanol mais ne devraient pas être vaporisés directement sur avec la solution d’éthanol à 70 % pour éviter la diffusion de l’éthanol dans les puits.
  9. Incuber les plaques MEF à 37 ° C durant la nuit dans une étuve de laboratoire CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide) pour permettre la fixation, avant de les utiliser.

2. en vrac à la stabilisation des Cultures conventionnelles hPSC d’ultérieures Reversion naïf avec une étape d’Adaptation brève FRV-5i

  1. Valider toutes les lignes conventionnelles hPSC pour possession d’un caryotype normal par G-bande, avant le retour de début FRV-5i/FRV-3i.
    NOTE : Réversion FRV-3i des lignes haut-passage hPSC classiques (p. ex.., P > 40 – 50) doit être évitée, car ces cultures peuvent abriter déjà aberrations génomiques qui peuvent nuire aux stable, efficace et en vrac FRV-3i reversion d’amorcée, pistolets hPSC lignes.
  2. Maintenir et développer les cultures conventionnelles hPSC avec des caryotypes normaux validés dans un système de culture axée sur le MEF (tel que décrit dans la Section 1), ou d’un système de culture sans chargeur (selon la préférence de l’enquêteur).
    Remarque : Les deux chargeur dépendant hPSC/MEF cocultures (p. ex., CSEh moyen (tableau 1) additionné de 4 à 10 ng/mL bFGF) ou sans alimentation (e.g., E8 5 ou mTSER 6 médias (conformément aux instructions du fabricant sur méthodes de vitronectine enduit plaques) sont compatibles avec réversion de naïf en bloc en utilisant le système de FRV-5i/FRV-3i/MEF (Figure 1). Méthodes non enzymatiques sont préférés pour le passage des hPSC classique avant de les préparer à la réversion. Les formulations de médias FRV-5i et FRV-3i ne contiennent pas d’antibiotiques ou antifongiques. Règles de fonctionnement standard de stérilité armoire de biosécurité et d’entretien doivent être rigoureusement respectées pour éviter toute contamination bactérienne ou fongique.
  3. Pour le MEF-basé système de culture, préparer mangeoires MEF dans la plaque de 6 puits gélatinisée tel que décrit dans la Section 1 au moins un jour avant le passage des cultures FRV-5i-adaptées classiques hPSC.
  4. Après que les cultures conventionnelles hPSC ont atteint environ 50 % confluence (c.-à-d. 3-5 jours après l’ensemencement initial), remplacer le milieu de culture de CSEh standard avec support LIF-5i (2 mL par puits ; Le tableau 1).
    Remarque : Effectuez ces étapes dans une armoire de sécurité biologique.
  5. Culture et maintenir conventionnel hPSC/MEF pendant 2 jours en FRV-5i dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide). Changer le support LIF-5i quotidiennement afin des pour adapter pour leur adoption subséquente et la réversion stable en FRV-3i.
  6. Sinon, pour les cultures libres Chargeur conventionnels (p. ex., en E8), la culture hPSC en FRV-5i nuit seulement avant passage le lendemain matin.
    NOTE : Cultures FRV-5i et FRV-3i peuvent tous deux maintenus avec atmosphérique (21 % O2) ou physiologiques (5 % O2) oxygène niveaux dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide).
  7. Avant le passage, placer les plaques de culture dans une enceinte de sécurité biologique, laver hPSC classique FRV-5i-adapté une fois avec du PBS et ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire dans chaque puits. Incuber 5 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 et triturer doucement avec une pipette dans une suspension monocellulaire dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
    NOTE : Tampons de dissociation Non enzymatique peuvent aussi retenir pour la préparation de cellules individuelles pour le passage.
  8. Recueillir la suspension de cellules dans un milieu de CSEh (au moins 2 fois dilution) en un tube conique stérile de 15 mL et triturer doucement les cellules de pipetage pour obtenir une suspension monocellulaire.
  9. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min, aspirat/jeter le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire en 1 à 2 mL de milieu FRV-5i dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellule automatique.
  10. Laver la plaque MEF pré plaquée deux fois avec du PBS (2 mL par puits dans les plaques 6 puits) et distribuer 1 – 2 x 106 cellules (en moyenne 2 mL FRV-5i) sur 1 puits de la plaque de la MEF de PBS à la chaux.
  11. Ajuster et optimiser la densité des ensemencements initiaux pour chaque ligne de hPSC individuel à être naïf-inversée, comme peuvent l’efficacité peut être très variable. Placer la plaque dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide).
    Remarque : L’utilisation systématique des réactifs anti-apoptotiques n’est pas recommandée pour la plupart des lignes de hPSC avec cette méthode. Le système FRV-5i améliore déjà grandement l’efficacité re-électrodéposition clonale initiale en vrac des lignes classiques hPSC. Toutefois, une utilisation ponctuelle d’inhibiteur de ROCK (5 – 10 μM Y-27632) peut accroître l’efficacité de re-électrodéposition clonale initiale FRV-5i des cultures conventionnelles hPSC dans le premier passage pour certaines lignes instable hPSC lignée-amorcé avec la propension des spontanée différenciation.
  12. Si à partir de cultures sans conducteur (p. ex., E8), directement transférer un bien de la hPSC conventionnelle dissocié adapté en FRV-5i dans un irradié bien plaqué MEF (c.-à-d., passage de 1:1).
  13. Le lendemain, agiter doucement la plaque à lever toutes les cellules non inscrits, aspirer le milieu (lavage de PBS est facultatif) et les remplacer par 2 mL de milieu de FRV-5i. Effectuez cette étape dans une armoire par jour pendant 3 à 5 jours ou jusqu'à ce que les cellules sont confluents de 60 à 70 % (Figure 1) prévention des risques biotechnologiques. Placer la plaque dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide).

3. à long terme entretien et l’Expansion des N-hPSC dans un milieu FRV-3i

  1. Après la première adaptation de FRV-5i, le passage des cultures ultérieures de FRV-3i stables tous les 3 – 4 jours dans une placard de la biosécurité, ou lorsque les cultures deviennent confluente de 60 à 70 % (Figure 1).
    NOTE : FRV-3i cultures nécessitent un entretien rigoureux et permettant aux cultures de N-hPSC atteindre la densité de confluence/cellulaire élevée de culture prolongée (p. ex.., > 4 jours) diminue l’efficacité re-électrodéposition clonale subséquente et favorise la spontanée différenciation.
  2. Dans une armoire de biosécurité, jetez le milieu de culture et laver chaque puits de cultures FRV-5i/FRV-3i en ajoutant doucement 2 mL de PBS. Jeter les PBS et ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire. Incuber 5 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide).
  3. Recueillir la suspension cellulaire, ajouter CSEh moyen (sans inhibiteurs ou facteurs de croissance (tableau 1) ; dilution au moins 2 fois) pour récupérer tous les hPSC et triturer doucement les cellules de pipetage pour obtenir une suspension monocellulaire. Transférer la suspension dans un tube conique stérile de 15 mL.
  4. Centrifuger à 300 g pendant 5 min et aspirer/jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans un milieu FRV-3i. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellule automatique.
  5. Plaque ~ 2 x 105 cellules / puits sur le MEF irradié dans la plaque de 6 puits gélatinisée pour passage systématique des cultures FRV-3i. Pour les cultures initiales FRV-5i-adaptées, plaque une densité au départ plus élevée (4 x 105 cellules/puits) avant le premier passage en FRV-3i/MEF.
  6. Re-plaque et distribuer hPSC LIF-5i-adapté sur frais lavés à PBS irradiés MEF chargeur plaques (préparé la veille comme indiqué ci-dessus) dans le milieu du FRV-3i. Remplacer le support LIF-3i quotidiennement.
  7. Passage N-hPSC moins 4 – 7 continue en vrac des passages dans le FRV-3i moyen avant l’utilisation du N-hPSC dans des études fonctionnelles ou cryoconservation. Noter le nombre de passages de N-hPSC dans les deux classiques ou support LIF-3i.
    NOTE : Réversion FRV-3i haut-passage (p. ex. > p40) lignes conventionnelles, lignée-amorcé hPSC n’est pas recommandé. Un effort devrait être fait pour rétablir les lignes conventionnelles hPSC au plus bas passage possible qu’ils soient disponibles. En outre, l’utilisation de hPSC LIF-3i-revenue ayant subi un traitement supérieur à 10 passages FRV-3i n’est pas recommandée pour des études fonctionnelles, puisque ces cultures N-hPSC pourraient contenir de clones caryotype anormal en raison de la sélection de la culture de cellules clonales prolongée. Frais FRV-5i/FRV-3i réversions des lignes de basse-passage hPSC conventionnelle doivent être effectuées pour des études fonctionnelles, si les stocks de N-hPSC avec < 10 passages en FRV-3i ne sont pas disponibles.

4. cryoconservation et le dégel du FRV-3i-revenue N-hPSC

  1. Développez dévulcanisation N-hPSC au moins 5 à 7 passages en FRV-3i, comme indiqué plus haut, avant utilisation dans les études fonctionnelles ou cryoconservation à long terme. Noter le nombre de passages dans des conditions classiques et dans des conditions de FRV-3i sur chaque flacon cryopréservé.
    NOTE : Excès de FRV-3i-revenue N-hPSC ne pas utilisé pour des tests fonctionnels peuvent être cryoconservés à chaque passage, mais le gel des passages inférieurs de réversion après (par ex.., < p3) peut entraîner dans les pauvres ou très variable de récupération après décongélation.
  2. Dans une armoire de biosécurité, aspirer le milieu de culture, laver les cellules dans du PBS (2 mL / puits), aspirer les PBS et dissocier des colonies hPSC dans des cellules individuelles à l’aide de la solution de détachement cellulaire (1 mL / puits). Placer la plaque pendant 5 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide). Diluer la solution de détachement cellulaire avec le médium de FRV-3i (2 fois), recueillir des hPSC dans une conique stérile de 15 mL, centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min et Resuspendre le culot dans FRV-3i moyen (1 à 2 mL par puits-équivalent). Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellule automatique.
  3. Centrifuger le N-hPSC dans le milieu du FRV-3i (x 200 g pendant 5 min) et remettre en suspension les cellules dans une enceinte de sécurité biologique dans la solution de congélation (tableau 2), avec une densité d’au moins 1 x 106 cellules/mL.
  4. Cellules de transfert dans les tubes cryogéniques de stockage à long terme et placez dans un récipient de ralentir au point de congélation. Laisser les échantillons de geler pendant la nuit dans un congélateur à-80 ° C.
  5. Le lendemain, transvaser le cryovials dans un congélateur d’azote liquide pour le stockage à long terme.
  6. Pour la décongélation, placez la cuvette congelée dans un bain d’eau de 37 ° C pendant environ 2 min. stériliser le flacon (c.-à-d., pulvérisation d’éthanol), transfert de hPSC à une conique stérile de 15 mL et diluer lentement le milieu de CSEh en 10 fois plus de cellules (tableau 1) additionné de 5 μM de Protéine associée à Rho (ROCK) inhibiteur de la kinase Y-27632 dans une hotte de sécurité biologique stérile du cabinet.
  7. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min. Dans une armoire de biosécurité, jetez acellulaire surnageant et Resuspendre le culot dans FRV-3i additionné (1 à 2 mL) inhibiteur de ROCK 5 μM Y-27632.
    Remarque : Exclusion de Y-27632 donne mauvaise efficacité de récupération après décongélation (Figure 2).
  8. Transférer les cellules dégelées resuspendues dans le FRV-3i/ROCK inhibiteur sur les puits de PBS-lavé MEF-plaqué. Cryoconservé FRV-3i cultures à une densité de 1 x 106 cellules par flacon. Chacun de ces flacons sur les mangeoires dans un puits d’une plaque de 6 puits gélatinisé décongeler.
  9. Le lendemain, commencer régulièrement FRV-3i foisonnement moyen sans inhibiteur de la kinase Rho.

5. chargeur suppression pour la collecte d’échantillons de N-hPSC

  1. Pour préparer des cultures d’échantillons de FRV-3i/MEF (ou CSEh/MEF conventionnelle) (c'est-à-dire, pour l’expression des gènes (p. ex., RT-PCR quantitative, microarrays) ou des analyses de protéines (p. ex., Western blot), appauvrissent FRV-3i cultures de mangeoires MEF à l’aide Magnétique activé cellule Tri (MACS) avec un anticorps anti-TRA-1-81 enduit microbilles selon le protocole du fabricant.
  2. Vous pouvez également utiliser la méthode suivante d’électrodéposition avant simple pour épuiser les cultures des mangeoires, tel que décrit ci-dessous.
  3. Sous une hotte de sécurité biologique stérile du cabinet, jeter le surnageant acellulaire, laver le culot avec 2 mL de PBS stérile par puits. Détacher les cultures de FRV-3i/MEF adhérentes à l’aide de la solution de détachement cellulaire (1 mL/puits). Incuber pendant 5 min dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide). Recueillir des hPSC dans une conique stérile de 15 mL. Lavage 2 fois CSEh en médium, cellules de transfert dans le stérile de 15 mL conique et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
  4. Dans une armoire de biosécurité, réactiver chaque puits de cellules FRV-3i/MEF dissociée dans 2 mL de milieu FRV-3i et transférer directement sur un nouveau puits d’une plaque de 6 puits qui a été fraîchement revêtue avec de la gélatine de 0,1 %.
  5. Incuber les cellules hPSC LIF-3i/MEF pendant 1 h à 37 ° C dans un incubateur à CO2 (5 % de CO2, atmosphère humide). Recueillir les cellules non adhérentes avec une pipette dans un nouveau tube conique. Doucement, ajouter 2 mL de milieu de CSEh dans chaque puits et agiter pour recueillir le reste des cellules non adhérentes.
    NOTE : La majorité de la MEF irradié attachera à la plaque gélatinisée en 1 h, laissant la majorité de la hPSC en suspension.
  6. Mélanger et centrifuger de cellules à 300 g pendant 5 min. laver dans du PBS. Le culot cellulaire Snap-congélation dans l’azote liquide après centrifugation, ou alternativement une nouvelle suspension pastilles dans un tampon de lyse qui est compatible avec l’analyse en aval de protéines ou d’acides nucléiques (Figure 2B).
  7. Effectuer des caractérisations de FRV-3i hPSC lignes avec un contrôle conventionnels apprêté hPSC isogéniques correspondant.
    NOTE : En raison de la variabilité intrinsèque entre et au sein des cultures apprêtées, contrôles pertinents sont préparés à un correspondant validant en culture ou avant retour naïf. Des protocoles détaillés et des matériaux pour en aval par immunofluorescence bioimaging, flow cytometry, Western Blot, l’expression des gènes (les tests de RT-PCR et les microarrays), études de méthylation (tache de dot, CpG méthylation microarray), OCT4 proximale et distale enhancer prédominance journaliste dosages et signalisation inhibiteur dosages sont fournis ailleurs3.

6. poster naïf réversion : Validation de l’intégrité génomique et rétention des empreintes Parental de N-hPSC LIF-3i-revenue avant utilisation dans des essais fonctionnels

  1. L’écran des cultures conventionnelles, apprêté hPSC départ pour possession d’un caryotype normal (par exemple, avec analyse de coloration Giemsa-bande à l’aide de méthodes publiées 7) avant d’entamer la réversion FRV-5i/FRV-3i.
    NOTE : Ceci est pour éliminer les populations de hPSC conventionnelles qui peuvent abriter des altérations génomiques anormales qui peuvent conduire à un avantage en survie sélective artéfactuelles dans des conditions de FRV-3i clonales.
  2. Pour des résultats optimaux, fraîchement revenir classique hPSC cultures à un État naïf avec FRV-3i plusieurs semaines avant leur utilisation dans les études fonctionnelles ou réalisé de différenciation.
    NOTE : Routine prolonge la culture « entretien » dans des conditions de FRV-3i pendant plus de 10 passages suivants naïf réversion n’est pas recommandée. Expansion systématique et l’entretien de lignées de CSEh et hiPSC est souhaitable à l’aide de systèmes de culture traditionnelle (p. ex., E8, ou MEF/CSEh moyen avec bFGF).
  3. Évaluer après dévulcanisation lignes N-hPSC pour le maintien de la normale caryotypes 5 – 7 passages après réversion FRV-3i (e.g., avec bande Giemsa coloration analyse7, ou toute autre méthode de choix).
  4. Évaluer toutes les lignes de N-hPSC rétablies pour le maintien de l’empreinte génomique parentale normale par une analyse de méthylation de l’ADN de choix (p. ex., protocoles pour analyse microarray ADN CpG d’empreintes parentales en FRV-3i-revenue N-hPSC sont fournis ailleurs3 ) après 5 à 10 passages de réversion FRV-3i.

7. post naïf réversion : Protocole expérimental Lignes directrices pour des dosages quantitatifs de différenciation dirigée à l’aide de N-hPSC LIF-3i-revenue

  1. Utiliser directement les FRV-3i N-hPSC dans des protocoles établis différenciation dirigée sans manipulations de la culture de cellules supplémentaires.
    NOTE : Ré-amorçage (c.-à-d., conversion N-hPSC retour des conditions classiques amorcées avant leur utilisation dans des essais de différenciation dirigée) n’est pas nécessaire avec la méthode FRV-3i et n’est pas recommandé.
  2. Pour contrôler les effets du dosage et interligne de variabilité dans le test fonctionnel des lignes individuelles hPSC, effectuer une validation croisée les puissances de la différenciation de la lignée spécifiques en utilisant des protocoles de différenciation indépendante avec au moins trois hPSC lignes dérivé des antécédents génétiques indépendantes (c.-à-d., hiPSC dérivé de donateurs multiples et les CSEh).
  3. Pour les comparaisons fonctionnels, mis en place frère cultures, au nombre de passage équivalente et de la même ligne de hPSC (isogéniques) parallèlement à la traditionnelle lignée-amorcé et FRV-3i-revenue hPSC. Culture hPSC isogéniques amorcée/naïve frères dans leurs médias respectifs (e.g., E8 vs. LIF-3i) et en même temps de différencier à l’aide de protocoles identiques de différenciation et matériaux, afin d’éliminer tout biais expérimental (Figure 4).
  4. Pour isogéniques amorcée vs naïve hPSC comparaisons, ajuster et optimiser la densité des ensemencements initiaux pour chaque série de tests de différenciation individuelle.
    NOTE : Les protocoles détaillés pour progénitrices neurales, endoderme définitif et hémato-endothéliales différenciation dirigée de N-hPSC LIF-3i-revenue sont fournis ailleurs 3. FRV-3i-revenue N-hPSC ont plus robuste capacité de prolifération et de différenciation dans les essais de différenciation dirigée que hPSC conventionnel. N-hPSC nécessite généralement une plus faible concentration d’ensemencements initiaux que le hPSC classique, et contrairement à leur hPSC conventionnel apprêté homologues, ne nécessitent pas l’utilisation de réactifs anti-apoptotiques pour améliorer leur survie clonale suite enzymatique digestion lors d’essais de différenciation.

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Representative Results

Ce protocole optimise efficace comme naïve reversion avec FRV-3i dans les deux cultures de hPSC classique lignée-amorcé feeder-dépendants et indépendants de chargeur (Figure 1). Le protocole détaillé, décrit ci-après, contours adaptation séquentielle au FRV-3i à partir soit hPSC chargeur-dépendante ou exempte d’engraissement conventionnel des conditions (p. ex. E8 moyen).

Représentant des résultats pour la réversion de FRV-3i de plusieurs classiques CSEh et exempt de transgene hiPSC lignes sont présentés dans les Figures 1 et 3. Ces résultats typiques peuvent être validés avec la ligne disponible dans le commerce de CSEh H9, ou avec un disponible dans le commerce libre transgène, cordon ligne hiPSC épisomiques dérivés du sang (6.2) provenant du laboratoire de Zambidis8,9. Mise en place d’une première mesure d’adaptation FRV-5i permet très efficace ultérieure, en vrac la multiplication clonale des cultures conventionnelles hPSC en FRV-3i et ne nécessite pas des agents anti-apoptotique ou ROCK inhibiteurs10 (Figure 1A, B ). Plusieurs plaques de naïve comme hPSC peut être rapidement prélevés pour analyses en aval ou multilineage réalisé différenciation qu’après 5 à 7 passages en FRV-3i. Alternativement, FRV-3i cultures peuvent être cryopréservés pour de futures applications. Après décongélation récupération cellulaire peut être amélioré (Figure 2) par l’inclusion d’un inhibiteur ROCK cryoconservation et dégel après media11.

Les déterminants de la pluripotence moléculaire et fonctionnelle, les deux in vitro et chez l’embryon ont été récemment révisé2. Ces facteurs comprennent le bagage génétique, acquisition de la culture associée à des mutations des gènes du développement clés, et les différences de CSEh et dérivation hiPSC et méthodes de culture. Fourni ci-dessous est un résumé des essais standards qui peuvent être employées pour la caractérisation et validation de la phénotypiques, moléculaires et pluripotencies fonctionnelle du FRV-3i-revenue hPSC.

Morphologie des colonies
La transition entre les systèmes de culture apprêtée, classiques et FRV-3i-revenue est accompagnée de changements physiques distinctes dans la morphologie des colonies hPSC (Figure 1B). Classiques hPSC cellules prolifèrent aussi plat, colonies de large monocouche qui développez rapidement des touffes de petites cellules (sur MEF ou conditions sans chargeur), mais mal comme des cellules individuelles. Exposition des lignes conventionnelles hPSC aux FRV-3i favorise la croissance et l’expansion et de plus petits, serrés, colonies en forme de dôme qui découlent par clonage de simples cellules. Ces changements morphologiques sont complètement réversibles et FRV-3i-revenue en forme de dôme colonies peuvent passer spontanément vers une morphologie monocouche conventionnel si FRV-3i est retirée et les cellules sont re-cultivées dans un milieu standard CSEh classiques additionné de bFGF. En outre, dilatation des cellules FRV-3i-revenue à fortes densités anastomosées (ou culture prolongée sans passage fréquent) entraîne la réacquisition spontanée de la morphologie plate, classique avec une efficacité réduite clonale ; soulignant la nécessité pour l’entretien avec diligence et soin hPSC LIF-3i-Revenue (e.g., < confluence de 40 à 60 %).

Vivre l’immunofluorescence souillant et flux analyse cytométrique des marqueurs de surface pluripotence
Évaluation des marqueurs pluripotence pendant la transition des classiques à un État naïf suivant la culture FRV-3i continue peut être contrôlée au moyen non invasive d’anticorps direct coloration sans détecter tout effet négatif sur LIF-3i/MEF expansion ( e.g., vivre-coloration des anticorps conjugués fluorochrome contre TRA-1-81, TRA-1-60 et SSEA4).

Rétention de pluripotence pendant LIF-3i réversion peut être également régulièrement surveillée par cytométrie d’expression du marqueur de surface associées à la pluripotence des TRA-1 et antigènes SSEA au cours de la seule cellule passage (Figure 1C) ou immunofluorescence d’intact, fixe colonies in situ (Figure 3). Bien que ces marqueurs ne sont pas distinguent entre classiques et FRV-3i États, leurs niveaux inversement corrèlent avec la fréquence de la différenciation spontanée qui peut-être survenir dans hPSC lorsqu’il passe de hPSC classique aux conditions FRV-3i. Des antigènes de surface supplémentaires qui peuvent plus précisément marque humaine naïve comme États in vitro2,12,13 peuvent aussi servir à détecter efficacement FRV-3i hPSC réversion.

Validation de pluripotence moléculaire de N-hPSC
Parce que le fond génétique de hPSC lignes a été caractérisé comme un facteur fort de variabilité d’interligne, il est important d’évaluer rigoureusement les cultures isogéniques correspondant culture porté lors de la comparaison des systèmes de culture de hPSC (Figure 4). Étant donné que certains de ces systèmes ont déjà démontrés que génèrent les populations de hPSC avec configurations aberrant de génomique et épigénétiques2, toute méthode de réversion naïf doit être dosé avec un certain nombre de N-hPSC des antécédents génétiques indépendantes, d’une manière Cela suffit valider la reproductibilité biologique et exclure les États non-développemental pertinent « pseudo-pluripotentes » (c'est-à-dire, avec les caractéristiques apparentes de pluripotence moléculaire, mais manque de capacités de différenciation fonctionnelle). Zimmerlin et al. la validation du système culture FRV-3i pour inclure le dosage de la pluripotencies moléculaire et fonctionnelle de dévulcanisation N-hiPSC dérivé de diverses méthodes de reprogrammation, qui est un autre facteur présumé connu de variabilité fonctionnelle étendue entre pluripotentes indique2.

En conséquence, la plupart des études de systèmes de culture humaine naïve ont mis l’accent sur l’analyse moléculaire pluripotence des N-hPSC au 1) le niveau épigénétique (p. ex., histone marks par séquençage de puce ou puce-PCR, globale méthylation de l’ADN par immuno-blot ou ensemble de génomique séquençage de bisulfite, allèle spécifique CpG méthylation microarrays, OCT4 enhancer prédominante l’utilisation de systèmes de reporter l’activité mondiale à des éléments de régulation par la DNAse I hypersensibilité et élément répété profilage de RNA-sequencing), 2) transcriptomique niveau (RNA-sequencing, expression microarrays et RT-PCR quantitative), analyse de l’expression protéique (e.g., FACS, microscopie par immunofluorescence et Western Blot) et 3) via les études du métabolisme oxydatif (p. ex., glycolyse, métabolisme de la phosphorylation et la nicotinamide). Exemples représentatifs d’immunofluorescence taches et tache occidentale détection d’expression des marqueurs clés de pluripotence moléculaire apparaissent (Figure 3B, C). Par exemple, illustré à la Figure 3 b sont activé phosphorylée (phospho) et total isoformes de STAT3 et ERK1/2, qui sont clés caractéristiques moléculaires de souris ESC-comme naïve pluripotence. Ceux-ci ont été détectés en utilisant des anticorps primaires anti-STAT3 et anti-ERK1/2. En outre, pluripotence fonctionnelle lors d’essais de différenciation de tératome est démontrée dans conventionnel vs. HPSC LIF-3i-revenue tératome tissus disséqué dix semaines après l’injection et fixé à 4 % de formaldéhyde et de paraffine incorporé (Figure 3D).

Préparation du FRV-3i/MEF ou CSEh/MEF/bFGF échantillons pour l’analyse moléculaire en aval doit contenir épuisement de force expéditionnaire des marines. Deux approches sont décrites ci-dessus pour l’épuisement de force expéditionnaire des marines qui ont été utilisés avec succès dans notre laboratoire. MEF avant électrodéposition est un simple, fiable, et rentable méthode pour éliminer les mangeoires de N-hPSC des échantillons pour les études moléculaires et est une alternative préférable à FACS ou MACS séparation (c.-à-d., anti-TRA-1-81 ou anti-TRA-1-60 base d’anticorps séparation ). En outre, TRA-1-négatif spontanément-différencier les cellules adhérentes en FRV-5i/FRV-3i cultures peuvent être rapidement éliminés de FRV-5i/FRV-3i N-hPSC cultures avant adoption subséquente de FRV-3i sur MEF fraîche par pré-revêtement la digestion enzymatique cellules individuelles pendant 1 h sur plaques revêtues avec de la gélatine de 0,1 % (Figure 2).

Évaluation de pluripotence fonctionnelle de N-hPSC
L’essai plus rigoureux de pluripotence fonctionnelle de la CFP est l’essai de chimère blastocyste injection, qui est limité à l’essai des lignes N-hPSC pour des raisons éthiques. Par ailleurs, plusieurs groupes qui ont signalé la génération de N-hPSC avec diverses autres méthodes ont tenté de générer des chimères interspécifiques. Toutefois, ces tentatives ont donné une contribution extrêmement faible ou non des lignées de N-hPSC différenciées aux embryons murins ou porcines, par rapport à la capacité de produire des chimères de souris standard ESC2.

Des études fonctionnelles supplémentaires ont étudié dirigée in vitro la différenciation des N-hPSC putatif dérivé via diverses méthodes, mais ont révélé la capacité de différenciation multilignée biaisée, défectueux ou diminuée, avec concomitant héberger des anomalies épigénétiques2,13. Des aberrations épigénomique similaire, surtout au locus imprimés, ont été détectées dans les souris ESC suite à une exposition prolongée à la FRV-2i cocktail14. Fait intéressant, certains systèmes de culture de réversion ont signalé des améliorations globales dans les attributs spécifiques de pluripotence fonctionnelle du CFP telles que la renforcement des capacités en vivo trophectoderme contribution2,15 .

À l’aide d’une large collection de dérivé indépendamment de hPSC LIF-3i-Revenue, Zimmerlin et coll. employées différenciation multilignée essais pour montrer que le système de FRV-3i améliore considérablement la pluripotence fonctionnelle des lignes classiques hPSC 3. cela permet une analyse systématique des classiques vs FRV-3i hPSC lignes par paires isogéniques afin d’éliminer les variations dépendant d’interligne (Figure 4). FRV-3i-revenue hPSC lignes ne nécessitent pas une ré-amorçage étape préalable à la différenciation de l’EB. Cependant, hPSC LIF-3i prolifèrent à des taux significativement plus élevés clonales qu’isogéniques cellules développées en E8 et initiales plus faibles densités de placage exigent ainsi, ajustement pour permettre à chaque culture atteindre le confluent à une semblable validant.

Les enquêteurs devraient utiliser systématiquement plusieurs dosages pour illustrer la fonctionnalité améliorée de hPSC LIF-3i-revenue qui comprend non seulement des essais in vivo tératome, mais aussi in vitro réalisé différenciation dosages de neurones, définitif endoderme et hematovascular lignées3 à l’aide de tests multiples (p. ex., 2D APEL3,16 et systèmes de17,18 corps embryoïdes 3D). Pour contrôler pour la reproductibilité du dosage dépendant, au moins deux méthodes différentes de différenciation doit être effectué de réplication pour chaque paire isogénique d’amorcée/FRV-3i hPSC cultures (par exemple, la Figure 4, APEL, embryoïdes corps protocoles de différenciation). Le protocole expérimental devrait inclure un numéro solide (par exemple, > 3 – 5) apprêté/FRV-3i isogéniques paires de hPSC lignes de multiples, antécédents génétiques de donateurs indépendants (Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Transition de une progressive des cultures conventionnelles, lignée-amorcé hPSC aux conditions naïve-comme avec la méthode FRV-3i. (A) schéma de protocoles pour la reversion de FRV-3i par étapes. (Schéma en haut) Une méthode générale pour la transition d’amorcée, hPSC classique aux cultures FRV-3i. (Schémas de fond) Deux stratégies résumées pour FRV-3i naïf réversion des classiques (amorcée) hPSC cultivé sur le chargeur (c.-à-d., Primed/MEF à FRV-3i/MEF) ou conditions sans chargeur (i.e, Primed/E8 à FRV-3i/MEF). (B) les morphologies de COPS humain. Montré sont photomicrographies représentatifs de hPSC au cours de la réversion FRV-3i en utilisant une ligne disponible dans le commerce humain iPSC épisomiques (6.2). Montré sont les transitions observées entre colonies monocouche plat conventionnel initial, et les colonies subséquentes en forme de dôme clonogéniques qui existera après passage en FRV-5i intermédiaires et des conditions de culture FRV-3i stables. Barreaux de l’échelle = 200 µm. (C) représentative par cytométrie en flux analyses des flux des marqueurs de surface pluripotence. Montré, sont TRA-1-81 et SSEA-4 surface les expressions conventionnelles hPSC ligne 6.2 (p40) élargies dans les passages suivants de 1 à 9 (P1-P9) E8 et le passage initial en FRV-5i/MEF dans des conditions de FRV-3i. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Cryopréservation de N-hPSC et préparation des échantillons par ensemencement pré MEF. (A) exemple d’un cycle de gel/dégel des cultures FRV-3i/MEF. La ligne de dérivés du sang, non intégrées, exempt de transgènes humains iPSC cordon classique E5C3 a été dérivé et étendu sur les mangeoires MEF dans CSEh additionné de 4 ng/mL bFGF pour 18 passages. E5C3 classiques, lignée-amorcé ont été adaptés en FRV-5i (à gauche) et été transférées au FRV-3i moyen pour 3 passages (Centre). Les cellules E5C3 LIF-3i indiqués sur le panneau du Centre ont été cryoconservés moyen milieu cryoprotecteur à base de DMSO (tableau 2, 1 x 106 cellules par flacon) et conservés dans l’azote liquide). Un flacon a été décongelé un mois plus tard, et les cellules E5C3 ont été transférés dans un enduit relève bien d’une plaque de 6 puits (à droite). Cellule de récupération peut être améliorée en complétant le milieu FRV-3i avec 5 µM Y-27632 pour seulement dégel après un jour. Barreaux de l’échelle = 200 µm. élimination de force expéditionnaire des marines (B) (et aussi les cellules adhérentes de TRA-négatif différencié) dans les cultures hPSC LIF-3i/MEF par la méthode de placage à l’avant. Montré est flux cytométrique analyses avant et après pré bordé de PE-conjugué anti-TRA-1-81 et anticorps TRA-1-60, SSEA-4 APC-conjugués anticorps et anticorps SSEA-1/CD15 démontrant l’appauvrissement de la couche de TRA-1 antigène négatif et cellules de force expéditionnaire des marines à l’aide de la méthode d’électrodéposition avant une heure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Caractérisation de pluripotence dans des cultures de FRV-3i/MEF N-hPSC. (A) des marqueurs de Surface et nucléaire pluripotence. Expression du facteur de pluripotence NANOG dans le (isogéniques) même TRA-1-81+SSEA4+ classique, apprêté hiPSC dérivés du sang de cordon ligne E5C3 (p39) élargi soit apprêté (E8), ou les conditions de FRV-3i (+ p8 en FRV-3i/MEF) naïf. Par immunofluorescence taches de hPSC représentant des cultures sur des lames de chambre a révélé l’expression uniforme, nucléaire du facteur pluripotence core NANOG dans SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC cultivé in amorcée, conventionnel (E8 moyen) ou FRV-3i/MEF conditions. Echelle = 100 µm. (B) analyse par Western blot. Stat3 (à gauche), ERK (Centre) et expression de protéines bêta-actine contrôle pour une représentant hPSC ligne (CSEh H9) dans des conditions de FRV-3i/MEF (3i) ou conventionnelle (E8 moyen). (C) Expression naïve pluripotence associée à des facteurs de transcription. Montré sont STELLA/DPPA3, NR5A2 et TFCP2L1 par immunofluorescence dans une culture de FRV-3i/MEF représentative (cordon ligne de dérivés du sang hiPSC E5C3 à p33 (CSEh/MEF) + p8 (FRV-3i/MEF). Echelle = 100 µm. tératome (D) les dosages de hPSC classique et FRV-3i-revenue. Validation de pluripotence fonctionnelle dans la lignée isogénique hiPSC représentatif (E32C6 dérivés du sang de cordon) cultivés en soit E8 (p9) ou FRV-3i/MEF (+ p12) par dosage de tératome. 10 x 106 cellules cultivées en parallèle conventionnel, apprêtée vs isogéniques FRV-3i-revenue hPSC ont été injectés par voie sous-cutanée dans les branches des souris immunodéficientes de NSG. Hématoxyline et éosine taches de tératome microsections révèlent robuste différenciation dans les trois couches de germe avec ectoderme bien structuré (neural rosette : NR, epitheliam pigmenté rétinien : RPE), mésoderme (chondroblastes : Ch) et de l’endoderme (glandulaire tissu : GI) lignées. Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Comparaison de pluripotence fonctionnelle interétatiques isogéniques apprêtée et naïve. (A) schématique de la stratégie d’évaluation fonctionnelle pluripotence des États distincts pluripotentes dans isogéniques conventionnelle vs hPSC LIF-3i cultivées dans des protocoles de différenciation indépendante. Sont deux systèmes différenciation des progéniteurs hémato-vasculaire (APEL monocouche et systèmes du corps embryoïdes 3D (EB)) qui ont été précédemment employées pour évaluer la puissance de la différenciation des classiques vs FRV-3i-inversée dans la même ligne (isogéniques) hPSC cultivées en parallèle post FRV-3i reversion avec les mêmes numéros de passage. FRV-3i-revenue hPSC lignes ne nécessitent pas une ré-amorçage étape préalable à la différenciation de l’EB et sont soumis directement au protocole de différenciation. Système de différenciation de (B) EB vasculaire progénitrices (VP). Le système de différenciation 3D EB utilisé pour cette étude a été décrit précédemment17,18. Le résultat est indiqué représentant au jour 10 de différenciation EB (panneaux de gauche) pour les cultures isogéniques du même sang cordon (CB)-dérivé E5C3 hPSC9, cultivées dans deux classique CSEh/MEF (Primed / MEF) conditions ou FRV-3i/MEF naïf conditions. Analyse en cytométrie en flux de ces cellules EB montrent une augmentation spectaculaire du CD31+CD146+ VP suite FRV-3i reversion de la ligne de E5C3 avant la différenciation des populations. L’histogramme affiche la moyenne ±et de CD31+CD146+ VP pourcentages récupérés au jour 10 dans ce système d’EB en utilisant trois paires isogéniques de lignes hPSC indépendante (c.-à-d., deux CB-hiPSC et un adulte dérivé de fibroblastes de cellules hiPSC, lignes pointillées connecter isogéniques paires). Résultats montrent une amélioration significative des efficacités de différenciation VP dans le système EB dans l’ensemble des antécédents génétiques de plusieurs lignes de hPSC. (C) APEL monocouche progénitrices vasculaire différenciation système. Conventionnel (apprêté E8) et FRV-3i-revenue hPSC peuvent être directement différenciées en utilisant les mêmes conditions de culture, les facteurs de croissance, les cytokines et les petites molécules de la différenciation endothéliale progressive de APEL protocole 3, 16. sont présentées des expériences de différenciation APEL indépendantes à l’aide de la ligne de hiPSC dérivés du sang de cordon de E5C3 et le pourcentage de CD31+CD146+ des populations de progéniteurs vasculaire au 7e jour de différenciation de l’APEL. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le système de FRV-3i applique une version modifiée du classique 2i murine naïf reversion cocktail1 à cellules souches pluripotentes humaines. L’auto-renouvellement des hPSC (qui ne peut pas développer à 2i seul) est stabilisé en FRV-2i en complétant ce cocktail avec l’inhibiteur de la tankyrase XAV939. FRV-3i culture permet en vrac et efficace retour de la hPSC conventionnelle à un État pluripotentes ressemblant à l' épiblaste préimplantatoire humain3. Bien que les mécanismes d’action des XAV939 en hPSC sont probablement complexe et synergique avec 2i, ils incluent probablement au moins, une stabilisation importante et augmentation de la hPSC l’auto-renouvellement via WNT signaling pathways3.

Les cultures conventionnelles hPSC normalement adoptent un éventail d’États pluripotentes avec expressions génétiques de lignée-amorcé très variable et post-implantatoire épiblaste marques épigénétiques pouvant entraîner incompatible ou diminue fonctionnelle pluripotence2 . L’amorçage de cette lignée inhérente des cultures conventionnelles hPSC peut-être également interférer avec la reversion de FRV-3i réussie de quelques lignes de hPSC2. Toutefois, l’inclusion de l’étape initiale du adaptation FRV-5i (tableau 1) dans la méthode FRV-3i élargit l’efficacité du FRV-3i reversion parmi une multitude de lignes hPSC et favorise la réversion naïve en vrac des lignes conventionnelles hPSC d’une manière universellement qui contourne la fastidieuse cueillette et subcloning de rares colonies naïve-rétabli, ou la nécessité d’utiliser des molécules anti-apoptotiques systématique pour stabiliser leur viabilité.

La méthode de réversion FRV-5i/FRV-3i naïve est reproductible dans une large variété de lignées de CSEh et hiPSC. Elle nécessite une formation minimale avec habileté de la culture de cellule de base. Zimmerlin et coll. employée avec succès cette stratégie séquentielle revenir > 30 CSEh indépendant et exempt de transgene hiPSC lignes d’un large éventail de donateurs 3. Un seul passage en FRV-5i (Figure 1) est suffisant pour la plupart des lignes hPSC à subir une réversion naïf efficace dans les cultures de hPSC en vrac et progresser leur entretien stable et leur expansion en FRV-3i seul.

En outre, le système de FRV-3i/MEF supporte efficacités expansion clonale vrac solide tout au long de toutes les étapes entre la culture de lignée-amorcé classiques hPSC tout le chemin à la réversion terminé naïve comme hPSC (i.e., adaptation, transition et extension pour 7 à 10 passages en FRV-3i/MEF seul). Bien que la formulation actuelle de ce système de culture nécessite le support de chargeur, une méthode simple et abordable pour épuiser les mangeoires par la technique de placage à l’avant pour l’analyse des cultures FRV-3i est présentée (Figure 2).

Plusieurs autre systèmes ont également été signalés à promouvoir hPSC classique à semblable naïve comme pluripotentes la culture indique2. Bien que ces systèmes de culture hPSC comptent aussi sur l’utilisation des conditions classiques de souris naïves 2i, dans la plupart des cas ces méthodes passaging unicellulaires également nécessaire modulation chimique supplémentaire pour stabiliser un instable / état métastable humaine naïve. Ce qui est important, la plupart de ces autres méthodes démontré la pluripotence fonctionnelle avec facultés affaiblies après différenciation et/ou acquise anormale épigénomique empreintes ou caryotypes2. Bien que l’émergence de caryotypes anormaux au sein des cultures conventionnelles hPSC apprêtée est déjà bien documentée19, prolongée, cellule unique passage des méthodes enzymatiques qui sont employés couramment dans la plupart des méthodes de réversion naïf. Cela a également été montré pour potentialiser la génération des configurations chromosomiques anormales20,21; des techniques plus sensibles (p. ex., les variations de numéro copie, polymorphisme simple nucléotide) peuvent révéler les modifications additionnelles22,23.

En revanche, un vaste répertoire de FRV-3i-revenue hPSC lignes ont été confirmés à posséder des caryotypes normaux à moyen-doux passages (par exemple, p5-p15), ainsi qu’au nombre élevé de passage (p. ex.., > p30) suite à la culture de FRV-3i3. En outre, épigénomique empreintes en FRV-3i-revenue hPSC trouvées reproductible normal et intact au poste de 5 à 10 passages de réversion FRV-3i2. Utilisant la plate-forme de tableau sensible méthylation commercial allèle spécifique, il a été démontré précédemment que marques méthylation CpG à imprimés locus d’un large répertoire de FRV-3i-revenue hPSC lignes (suivant 4 – 7 passages en FRV-3i) se sont révélés nettement normale dans la structure1. Puisque caryotypes et empreintes génomiques anormales peuvent altérer en fin de compte de la capacité fonctionnelle des hPSC, des directives préalables ont été présentés dans le présent protocole qui encourage les chercheurs à valider des cultures hPSC avant et après retour naïf, l’utilisation de ce méthode ainsi que d’autres.

La méthode améliorée de FRV-3i pluripotence fonctionnelle à travers des couches de germe dans un large répertoire de CSEh et non transgéniques hiPSC lignes (Figure 3). Contrairement aux autres protocoles de réversion naïve, la méthode de FRV-3i ne fait pas nécessitent une étape de re-aspiration et par conséquent pour la différenciation ultérieure des N-hPSC (p. ex., conversion N-hPSC retour des conditions classiques amorcées avant leur utilisation dans mise en scène tests de différenciation). FRV-3i-revenue N-hPSC affichent des capacités de différenciation significativement plus efficaces que leurs homologues isogéniques hPSC classiques dans les deux tests de tératome (Figure 3-D) et réalisé des protocoles de la différenciation des lignées de tous trois couches de germe2. En raison de l’essai-dépendante et variations de test fonctionnel des hPSC classique d’interligne, différenciation de la lignée spécifique doit être évaluée à l’aide de protocoles indépendants différenciation dirigée et hPSC provenant de multiples antécédents génétiques. À l’aide d’une conception expérimentale rigoureuse, un large éventail de lignes hPSC peut s’attendre à améliorer de façon significative leurs efficacités multilignée différenciation par rapport à leurs homologues conventionnels isogéniques après 4 – 10 passages dans des conditions de FRV-3i.

En résumé, cette méthode rapide et par clonage élargit le nombre de l’homme CFP, améliore l’efficacité de leur différenciation en aval, augmente le nombre de cellules progénitrices lineage-commis après différenciation, et diminue la variabilité d’interligne Parmi les lignes classiques, apprêtée à la lignée hPSC. Ces N-hPSC avec une fonctionnalité améliorée peut avoir encore un large impact pour leur potentiel à contribuer des tissus fonctionnels à un embryon en développement. Par exemple, N-CSEh stable peut-être être employée pour développer des organes transplantables humains et les cellules souches adultes dans l’élaboration des chimères animales ou pour la génération humanisés gène ciblé des modèles animaux de maladies. L’optimisation de cette méthode de FRV-3i utilisant l’inhibiteur de la tankyrase dans défini exempt d’engraissement GMP conforme aux conditions de culture facilitera la génération cliniquement utile efficace d’un large éventail de types de cellules fonctionnelles et engraftable pour usage thérapeutique.

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Disclosures

En vertu d’un accord de licence entre les Technologies de vie et de l’Université de Hopkins de Johns (JHU), Dr Zambidis a droit à une part des redevances reçues par l’Université pour les licences de cellules souches. Les conditions de cette entente sont gérées par JHU conformément à sa politique de conflit d’intérêts. Cela n’altère pas le respect des auteurs politiques de journal sur le partage des données et matériaux.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), le prix Innovation de BRP Stein, le Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award et la Fondation Moseley.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

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References

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Biologie du développement numéro 136 Naïve pluripotence cellules souches pluripotentes humaines différenciation inhibition de la tankyrase petite molécule épiblaste
Réversion chimique des cellules souches pluripotentes humaines classiques à un état semblable au naïf avec une puissance améliorée de différenciation multilignée
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Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

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