Summary
우리는 주문 품 선택 항목을 사용 하 여 개발 마우스 tibial 산만 골 모델 제시. 분석 대상으로는 마우스를 사용 하 여 연구 발전에 유리 하다.
Abstract
주의 골 (마) 세포 이식 없이 골격 조직 재생을 포함 하는 수술입니다. 할 모델 다음의 세 단계로 구성 됩니다: 뼈 및 외부 선택 항목;의 배치 후 대기 시간 단계 주의 단계 어떤 점에서 분리 된 뼈 끝은 점차적으로 그리고 지속적으로 산만; 그리고 통합 단계입니다. 이 맞춤 선택 항목에 대 한 사용은 2 개의 불완전 한 아크릴 수 지 고리와 확장 나사 구성 됩니다. 과정은 실리콘 느낌 물자와 형 하 고 다음 맞춤 선택 항목을 만드는 시작 되었다. 치과 수 지 실리콘 느낌 물자, formwork에 부 어 했다 그리고 그것은 맞춤 선택 항목에 필요한 불완전 한 수 지 반지를 만드는 유해를 허용 했다. 이 고리는 투명 수 지를 사용 하 여 확장 나사와 고정 했다. 이 방법을 통해 만든 맞춤 선택 항목은 쥐의 경골에 붙어 있었다. 경골은 고정 proximally, 25g 바늘의 한 쌍을 사용 하 여 장치에 27g 바늘의 한 쌍 distally, 및 아크릴 수 지. 5 일의 대기 시간, 후 주의 0.2 m m/12 h의 속도로 시작 되었다. 길이 계속 되었다 8 일 3.2 m m의 총 간격의 결과로. 쥐 산만 후 4 주를 희생 했다. 뼈 형성에 산만 갭 방사선 및 조직학을 사용 하 여 확인 되었다.
Introduction
주의 골 (마) 골격 장애, 사지 길이 불일치, 뼈 결함, 사지 기형1등의 다양 한 설립된 치료 방법입니다. 이 독특한 치료 전략 Ilizarov 제안한 "긴장 스트레스 원리"를 기반으로 합니다. 메서드는 대기 시간, 활성 주의 대 한 몇 주 및 통합에 대 한 몇 개월에 대 한 성숙한 뼈 형성된2때까지 몇 일을 필요 합니다.
혈액 흐름3,4 , 기계적 자극5,6 의 막힘으로 인해 로컬 hypoxic 조건의 치유 과정에서 특히 중요 하다. Hypoxia 유발 신생 산소, 영양소, 수용 성 요인과 세포 혈액 흐름을 통해 로컬 조직 복구에 필요한 수행합니다. 확장 작업으로 기계적 자극 하면 간 엽 줄기 세포, 뼈 형성, 석 회화 및 리 모델링의 차별화 등 생물학 반응. 직렬 할 치료 하드 조직 뿐만 아니라 부드러운 조직, 신경, 근육, 혈관, 및 줄기 세포 이식에 대 한 필요 없이 피부 조직를 포함 하 여 형성 수 있습니다. 따라서, 할 모델의 다양 한 조직 재생을 분석 하기 위한 훌륭한 모델이 될 여겨진다.
토끼와 개에 있는 가장 널리 사용 되는 동물 기초 연구에 대 한; 그러나, 이러한 동물에 대 한 사용할 수 있는 몇 가지 분석 도구 있다. 마우스 마 모델의 사용 더 자세한 분석을 촉진 한다. 그것은 녹아웃 쥐를 이용한 실험에 특히 적합 합니다. 그러나, 실험 동물으로 마우스를 사용 하 여, 확장 장치를 만들어야 합니다. 여기, 우리가 현재의 tibial 마우스 모델 할 치과 실험실 도구 및 이전 연구에서 사용 된 기법을 사용 하 여 만든 맞춤 선택 항목을 사용 하 여 개발.
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Protocol
모든 실험 동물 관리 및 사용 위원회의 우리의 기관에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 실행 되었다. 소독 절차 전에 모든 악기.
1. 맞춤 선택 항목을 만들기 위한 금형의 준비
- 2 불완전 한 반지 (외경, 20 mm, 내경 10 m m), 일부는 선택 항목, 파라핀 왁 스 (145 x 74 mm)의 한 시트와 에반스 왁 스 카 버를 사용 하 여 확인 합니다.
- 같은 조각 4을 확인 합니다. 가스 버너가 열 왁 스 주걱을 사용 합니다. 두께의 5. 확장 나사와 바늘, 8 x 2 mm 5 x 2 mm (그림 1A, 1B) 에반스 왁 스 카 버와 각각에 대 한 제공 공간에 대 한 4 개의 고리를 스택.
- 실리콘 느낌 물자에 왁 스 패턴을 포함 하 고 수 지 반지 (그림 1C)에 대 한 금형을 만듭니다.
- 실리콘 느낌 물자 (실 온에서 약 5 분), 경화 후 왁 스 패턴을 제거 합니다.
2입니다. 주문 품 선택 항목의 생산
- 석유 젤리 실리콘 몰드 다 얇게 균일 하 게 적용 됩니다. 중 합 수 지 치과의 3 세대를 혼합 하 고 즉시 실리콘 몰드에 부 어. 실 온 (RT)에서 5 분 설정 합니다.
- 금형에서 생산 수 지 반지를 제거 하 고 카바 이드 바와 버 (약 1 분)를 제거 하는 치과 micromotor 폴란드어. 두 수 지 반지는 주문 품 각 선택 항목에 필요 합니다.
- (그림 1D) 수 지의 필요한 수를 만드는 절차를 반복 합니다.
- 유틸리티 왁 스와 수 지 반지를 수정 하 고 투명 한 수 지로 완전히 확장 나사의 외부 보안 약 2mm의 간격을 남겨 주세요. 실시간에서 5 분 수 지를 설정 중 합이 완료 되 면 확장 나사 손잡이 (그림 1E)를 제거 합니다.
3. 수술 프로토콜
- 8 주 된 남성 마우스를 사용 합니다.
- 0.3 m g/g에 염 산 medetomidine, midazolam 4 mg/kg, 5 mg/kg의 몸 무게에 butorphanol 주석산의 복 주사로 마 취를 유도.
- 신중 하 게 면도 하 고 10% 요오드 솔루션, 외과 영역 소독 다음, 오른쪽 하단 다리에 0.5 %lidocaine 염 산 염을 관리.
- 경도 피부 절 개 (길이 약 15 m m) 오른쪽에 낮은 다리 15 번 메스를 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 하지는 모두 제거 하도록 기본 근육 분리 합니다. 비 골을 쉽게 도달에 외부에서 접근 하는. 가 위 비 골을 잘라.
- 좁은 얇은 멸 균 포 셉으로 발목을 잡고 고 뒤꿈치에서 약 5 mm 뼈에 구멍을 만들기 위하여 메 마른 27 G 바늘을 사용 합니다. 바늘은 피부, 뼈, 그리고 그 순서 대로 피부 침투 한다. 바늘 침투 하는 때, 팁 및 루트는 집게와 바늘은 약 15 m m.
- 같은 방식으로, 약 2-3 m m 인접 다른 구멍을 확인 합니다. 발목 주위를 누른 동일한 방식으로 무릎 아래 두 25g 바늘을 통과 합니다. 바늘 침투 후 집게 (그림 1F)와 팁과 뿌리를 잘라.
- 확장 방향에 평행 하 게 되도록 맞춤 선택 항목을 놓습니다. 장치의 홈을 채우기 위해 충분 한 중 합 치과 수 지와 바늘과 장치를 수정. (약 5 분) 완료 하는 중 합을 기다립니다 (그림 1G).
- 수 주변 조직 손상 되지 않도록 주의. 염 분 해결책 (1-2 mL)을 적용 하는 동안 매우 얇은 절단 디스크를 사용 하 여 경골의 diaphysis의 중간을 잘라.
- 4-0 나일론 봉합 된 상처를 닫습니다.
- 작업 후 즉시 진통에 대 한 buprenorphine (0.1 mg/kg)의 피하 주사를 제공 합니다. 수술 후 하루 7 하 고 필요에 따라 그 후 매 12 h buprenorphine를 계속 합니다.
4. 주의 프로토콜
참고: 대기 시간 기간 및 주의 산만 비율에는 다양 한 보고서 하지만 여기, 대표적인 프로토콜 표시 됩니다.
- 5 일의 지연 기간 후 0.2 m m/12 h의 속도로 산만 시작 합니다. 확장에 대 한 급속 한 확장 나사에 연결 핀을 사용 합니다. 핀 확장 나사 (그림 1E)에 부착 된 노란색 화살표의 방향으로 이동 합니다.
- 마 취 확장 하는 동안 필요 하지 않습니다. 작은 손가락 및 손바닥, 꼬리를 누른 집게손가락과 엄지손가락으로 확장 장치를 수정 합니다.
- 확장 (0.2 m m 1/4 차례)을 수행 합니다. 3.2 m m의 총 간격 귀 착될 것 이다 8 일 동안 길게 계속.
5입니다. 분석
- 방사선 분석: 확장의 완료 후 2.0 %isoflurane 사용 하 여 전신 마 취하에 컴퓨터 단층 촬영으로 뼈 재생을 평가.
참고: 경우 확장 장치의 위치에 관하여 주의 되는, 그것 가능 하다 연결 장치와 단순 방사선 촬영으로 그것을 평가 하. - 조직학 분석: 기구를 신중 하 게 제거 골절 주의 사이트 샘플링 하는 동안 발생할 수 없습니다. 실 온에서 24 h에 대 한 10% 중립 버퍼링된 말린에 샘플을 수정. 4 ° c.에 하룻밤 모스의 솔루션 (10% 나트륨 구 연산 염, 20% 개미 산 성)으로 알려줍니다
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Representative Results
그림 1A 및 1B 파라핀 왁 스와 함께 불완전 한 반지 (외부 직경, 20 mm, 내부 직경, 10 m m, 두께 5 m m)을 제시. 2 왁 스 패턴 실리콘 느낌 물자에 포함 된 고 형 수 지 반지 (그림 1C)에 대 한 형성 되었다. 수 지 생산은 즉시이 금형에 부 어 그리고 수 지 반지 (그림 1D)를 입수 했다. 맞춤 선택 항목 확장 나사 (그림 1E) 두 수 지 반지를 결합 하 여 만들었습니다. 그림 2 A 모델에서 산만 후 4 주에 일반적인 방사선 촬영 결과 선물. 새로 형성된 된 뼈는 주의 사이트에서 관찰 되었다. 그림 2B 는 hematoxylin 오신 결과 얼룩을 선물 한다. 새로 형성된 된 뼈 다리, 관찰 하 고 새로 형성된 된 뼈 네이티브 뼈에서 쉽게 구별 될 수 있습니다. 자가 골절 또는 수술 후 감염 5 쥐이 실험에 사용 했다.
그림 1 : 맞춤 선택 항목. (A, B) 링의 대략적인 크기는 다음과 같습니다: 외경, 20 밀리미터; 내경 10 m m; 두께 5 mm입니다. 확장 나사 (흰색 화살표) 및 바늘 (검은 화살표)에 대 한 공간을 확보. (C) 실리콘 느낌 물자에 포함 된 왁 스 패턴. (D) 완료 반지 수 지. (E) 두 수 지 고리와 확장 나사 수 지로 보호 됩니다. (F) 4 개의 바늘은 경골의 근 위 및 원심 metaphysis에 삽입 됩니다. (G) 주의 산만 장치 마우스 다리에 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 방사선 및 조직학 발견. (A) 방사선학, 새로 형성된 된 뼈는 산만 후 4 주 관찰 이다. (B) 조직학, 격차 채워집니다 새로 형성 된 뼈 (눈금 막대 = 500 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
큰 동물 실험 모델을 사용 하면 미리 만들어진 확장 장치를 사용할 수 있습니다, 그리고 좋은 정착을 얻을 확장 양과 확장 작업 자체를 평가 하는. 그러나, 마우스 실험 모델을 사용 하면 일부 또는 모든 장비를 개발 하는 데 필요한입니다. Isefuku 그 외 여러분 및 테일러 외. 장치 고 만든 마우스 모델7,8. Carvahjo 외 고정 미리 만들어진 확장 장치를 포함 하는 방법을 채택 (선택 항목 추적: KLS 마틴)는 합자와 와이어9. 우리는 또한 마우스 할 모델 확장 장치에 대 한 기존 제품을 사용 하 여 및 고정 방법 고안을 만들 수 있습니다. 이 방법은 확장 장치를 제조, 확장, 수행 평가 확장 금액을 쉽게 만들 것입니다. 또한, tibial 단편 결함 모델 같은 장치를 사용 하 여 만들 수 있습니다 예상 된다. 또한, 결함의 길이 0.2 m m의 단계에서 조정 될 수 있다 하 고 따라서, 장치는 다재 다능 한 것으로 간주 됩니다.
같은 실험에서 경골을 통해 바늘을 스레드 하가 기술적으로 어렵습니다. 특히, 경골의 원심 부분의 직경은 작은, 그리고 훈련 두 개의 바늘을 통과 하는 데 필요한. 충분 한 뼈 언급 하지 하는 경우 그것은 좋은 고정 취득 여부를 확인 하는 데 필요한입니다. 좋은 고정을 얻으려면, 바늘7,8사이의 각도 가능한 넓은 간격으로 바늘을 통과 하는 더 나은 수 있습니다. 또한, 치유의 속도 치료 기간 동안 조직학 뼈의 방법 변경 것 이다, 그것은 특정 방식으로 절차를 수행 하는 데 필요한.
실험 동물의 크기가이 실험의 제한 요인으로 간주 될 수 있습니다. 마우스는 큰; 때 아무런 문제가 있다 그러나, 너무 작은 경우, 수술 자체 가능한 않을 수 있습니다. 이전에 우리 4 주 오래 된 마우스를 사용 하 고 어떤 문제10없이 실험을 수행할 수 있었다. 평가 기간에 관해서는 확장 장치 뼈를 절단 후 42 일 이내 문제 없이 설치할 수 있습니다. 그러나, 더 관측을 수행 하지 않은로 추가 연구 필요 하다 나중에. 합병증의 발생 실험 발전 문제가 있을 수도 있습니다. 골절 수술 중 약 1/30 쥐에서 발생할 수 있습니다. 마찬가지로, 수술 후 상처 감염 약 1/30 쥐에서 발생할 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 주문 품 선택 항목을 사용 하 여 개발 마우스 tibial 할 모델 제시.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는이 연구를 완료 하는 격려를 제공 하기 위한 가토 마 키 코를 감사 합니다. 우리 또한 쥐의 주택에 대 한 실험 동물의 부 및 의료 연구 엔지니어링, 나고야 대학 대학원의 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
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