Summary
Ex vivo islote pancreático estudios son importantes para la investigación de la diabetes. Técnicas existentes para el estudio de islotes cultivados en su arquitectura original de 3 dimensiones son lentos, ineficientes y uso poco frecuente. Este trabajo describe un método nuevo, simple y eficiente para la generación de secciones de la parafina de alta calidad de todo cultos islotes.
Abstract
Experimentos con islotes pancreáticos aislados son importantes para la investigación de la diabetes, pero islotes son costosos y de limitada abundancia. Islotes contienen una población de mezclado de la célula en una arquitectura estructurada que afecta a la función, e islotes humanos son ampliamente variables en la composición del tipo de célula. Métodos actuales utilizados para el estudio de islotes cultivados incluyen estudios moleculares realizados en islotes enteros, junten tipos de células de islote dispares juntos, o microscopía o estudios moleculares en células de los islotes dispersos, alterar la arquitectura de la isla. En vivo estudios de islote, secciones parafina-encajadas del páncreas es una técnica poderosa para evaluar los resultados de células específicas en el entorno nativo de páncreas. Estudiando la post-cultura islotes dividiendo el parafina ofrece varias ventajas: detección de múltiples resultados de mismo islotes (potencialmente incluso el mismo exacto islotes, mediante secciones seriadas), las medidas específicas del tipo celular y nativos manteniendo islote célula-célula y célula-sustrato interacciones durante la exposición experimental y de análisis. Sin embargo, técnicas existentes para incrustar aislaron islotes de cultura post son ineficientes, lentos, propensos a la pérdida de material y generalmente producen secciones con números islote inadecuada para ser útil para la cuantificación de los resultados. Patología clínica celular bloque preparación laboratorios son inaccesibles y poco práctico para los laboratorios de investigación básica. Hemos desarrollado un método de banco mejorado y simplificado que genera secciones con sólido rendimiento y distribución de los islotes. Islotes fijos son suspendidas en gel de agarosa histológica caliente y pipeta en un disco plano en un portaobjetos de vidrio estándar, tal que las islas se distribuyen en un plano. Después de deshidratación estándar e incrustación, (10 +) 4-5 μm las secciones múltiples se pueden cortar de la misma cuadra del islote. Usando este método, pueden realizarse análisis histológicos e inmunofluorescencia en ratón, rata e islotes humanos. Este es un enfoque eficaz, barato, ahorro de tiempo para evaluar los resultados específicos de tipo celular, intacta arquitectura de islotes cultivados.
Introduction
Páncreas islotes de Langerhans, la única fuente de circulación de insulina, son un tejido crítico para los investigadores de diabetes mellitus. De cualquier organismo dado, islotes tienen tamaño variable, la frecuencia de célula tipo y arquitectura1,2,3. La estrategia convencional para estudiar en vivo la estructura y composición de células endocrinas de los islotes pancreáticos es dividiendo el páncreas tejido4,5. Desde islotes constituyen sólo una pequeña fracción del contenido celular pancreática total, se realizan estudios moleculares en islotes aislados. Ex vivo islote cultura experimentos pruebas de respuesta a nutrientes, modulación del gene (transfección, transducción de señales), o tratamientos experimentales proporcionan la penetración importante en mecanismos de modulación de la función, la proliferación y supervivencia de la célula endocrina 5 , 6.
A menudo los experimentos ex vivo del islote se analizan mediante estudios moleculares de islotes enteros o estudios histológicos o moleculares de células de los islotes dispersos en monocapa5,6. Análisis molecular de islotes todo presenta la seria advertencia de mezclantes tipos de células, que pueden producir resultados falsos negativos o falsos positivos cuando se extrapolan a cualquier tipo de célula individual. Dispersión de células sobre cubreobjetos para microscopia de la cultura permite la medida de resultado específicas de tipo celular, pero altera la arquitectura del islote, que puede alterar la respuesta a la intervención y excluye la identificación de los resultados relacionados con la arquitectura. Además, generalmente solamente un resultado solo puede ser medido; por ejemplo, para medir la proliferación de la célula beta y la muerte de la célula beta en las mismas condiciones, dos experimentos separados deban realizarse. Estos enfoques también son ciegos a la variabilidad inter-islote, un área de creciente interés en el campo. Clasificación las células del islote por citometría de flujo para estudios moleculares de la célula-tipo-específico, o estudios de RNA unicelulares son elegantes pero costoso, desperdiciador de tiempo, limitada por la abundancia de tejido, erradicación de arquitectura y no muy adecuado para análisis de rutina de la célula cultura 5 , 7. proyección de imagen confocal de islotes de Monte conjunto immunostained proporciona datos intacta arquitectura de alta calidad, pero es mano de obra, y datos obtenidos de cada muestra se limita a los resultados identificables en immunostaining solo8.
La capacidad para generar secciones de parafina de alta calidad de islotes todas cultura post abordará muchas de estas preocupaciones. Tejido del islote de alto costo, baja abundancia de modelos genéticos únicos o de los donantes de órganos humanos, o islotes estado post in vivo o in vitro manipulación experimental, son preciosos. Obtención de múltiples secciones de la parafina de los islotes mismo permitiría múltiples análisis específicos de tipo celular, intacta arquitectura desde el mismo experimento.
Técnicas existentes para generar pellets de islote para seccionamiento son imperfectas. Histología-optimizado de la agarosa es un gel acuoso bajo punto de fusión que es ampliamente utilizado en el procesamiento de muestras histológicas y citológicas, incluyendo muestras de tejidos pequeños o fragmentados que son difíciles de proceso9. Un islote inclusión enfoque es suspender los islotes en agarosa en un tubo de microcentrífuga, centrífuga para el material de la pelotilla, recuperar el tapón de agar, luego procesar y embed para seccionamiento10,11. Extracción de la muestra solidificada de la parte inferior del tubo es lento y difícil, lleva a la fragmentación ocasional de la muestra y el riesgo de lesiones personales. Los islotes están concentrados en la punta de la clavija, islote inadecuada distribución en secciones obtenidas por este método. El fondo redondo del enchufe complica incorporar tales que puede presentar una región pobre en islote de seccionamiento. En general, este método conduce a bajo rendimiento y distribución islote agrupada en las secciones resultantes.
Este nuevo método es un enfoque simplificado y mejorado para la preparación de las secciones del islote. Islotes son concentrados en un pequeño volumen y luego se coloca en la superficie lisa de un portaobjetos de microscopio para formar un pequeño disco, con los islotes en un solo plano. El disco de Histogel-islote es posteriormente procesado para parafina incrustar en una deshidratación acortada y Protocolo de infiltración de xileno. El anterior planteamiento, que concentra los islotes en la parte inferior de un tubo de microcentrífuga, también se lleva a cabo como una comparación. Esta nueva técnica mejora el rendimiento de islotes por sección, la distribución de los islotes en cada sección y toma menos tiempo para transferir los bloques islote casetes. Esta técnica es útil para los biólogos de islote u otros científicos estudiando pequeñas porciones de tejido que deseen maximizar productividad usan de un tejido de baja abundancia mediante la medición de los resultados múltiples en una sola muestra en su arquitectura de tejido propio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por la Comisión de uso y de UMass Medical School institucional Animal Care. Estudios del islote humano fueron determinados por la Junta de revisión institucional de UMass para no calificar para la revisión IRB o exención porque no implican el uso de sujetos humanos.
1. islote aislamiento y cultura
- Islotes de aislar y separar contaminantes tejido exocrino y ductal mediante el método de su elección.
Nota: Este método se optimizó utilizando islotes aislados por insuflación ductal colagenasa y Ficoll separación12 (roedor) o islotes posterior a la expedición desde el programa integrado de distribución de islote (IIDP13; humanos). Islotes se recolecta a mano con una micropipeta de P200. - Para optimizar la morfología de la isla, permiten islotes recuperar durante la noche en medio del islote completo de 10 mL (RPMI con 10% FBS, penicilina/estreptomicina y glucosa de 5.5 mmol/L) en una cámara humidificada con 5% CO2 a 37 ° C. Aunque este paso no es necesario para obtener las secciones, los islotes están más intactos después de un período de recuperación (ver figura 2).
2. islote fijación
- Usando una punta de P200 de baja obligatoria, dedazo aproximadamente 250 islotes equivalentes (IEQ)13 usando una rejilla calibrada bajo un estereomicroscopio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL baja obligatoria. Consejos y tubos Unión a baja reducen la pérdida de islotes pancreáticos.
- Permiten islotes para instalarse en la parte inferior del tubo de microcentrífuga. Quite el sobrenadante más con una punta de la pipeta de P200, teniendo cuidado de no para eliminar cualquier islotes.
- Añadir 1 mL de PBS. Centrifugar el tubo en una centrífuga oscilante del cubo hasta que la velocidad llegue a 200 x g y entonces detener el giro. Eliminar el sobrenadante. Repita el lavado de PBS, para un total de dos lavados.
- Añadir 500 μl de solución de formol al 10% o paraformaldehído al 4% recién hechos. Fije en la temperatura ambiente durante 30 minutos. Para los resultados en este método, estos métodos de fijación eran indistinguibles. Fijación más corta también puede ser posible; se recomienda para optimizar la duración de la fijación para lograr el resultado deseado.
- Retirar el fijador con una punta de P200.
- Añadir 1 mL de PBS. Tubo de centrífuga hasta que la velocidad llegue a 200 x g y entonces detener el giro. Eliminar el sobrenadante. Repita el lavado de PBS, para un total de dos lavados.
- Proceder inmediatamente al siguiente paso.
3. preparación del islote disco (figura 1)
- El primer uso, fundir el gel (por ejemplo, Histogel) a 70 ° C y hacer alícuotas de 1,5 mL tubos de microcentrífuga para almacenamiento a largo plazo. Volumen de alícuota no es crítica, puesto que las alícuotas pueden ser reutilizadas.
- Caliente del gel (aproximadamente 100 μl por muestra) a 70 ° C tubo de microcentrífuga con la alícuota de gel en un bloque térmico a 70 ° C.
- Transferencia de perlas de agarosa azul (10 μl por cada muestra) en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Resuspender bien los granos antes de pipetear.
Nota: Cuentas azules se mezclan con los islotes para ayudar en la identificación visual del material incrustado en el botón de la agarosa y el bloque de parafina. El número de abalorios azul utilizado no es fundamental para el resultado, pero evitar granos excesiva (> 5 x el número de islotes) para permitir una óptima distribución de islotes en las secciones. - Lavar los granos azules con 1mL de PBS, dos veces. Para cada lavado, gire los granos 1 min a 800 x g. Después del segundo lavado, suspender las cuentas de (n+ 2) x 10 μl PBS, donde n es el número de tubos de muestras; por ejemplo, 2 tubos, el volumen de PBS para añadir a los granos serían 40 μl.
- Centrifugar el tubo de microcentrífuga con islotes (breve vuelta a 200 x g) y eliminar la mayor parte del sobrenadante. Corte el extremo de una punta de micropipeta 10 μl con tijeras o una cuchilla y añadir 10 μl de granos a cada tubo de islote, usando una punta limpiarla para cada muestra. No mezclar (para evitar la pérdida de islotes).
- Centrifugue los islotes y los granos (breve vuelta a 200 x g). Quite tanta PBS como sea posible con una punta de micropipeta 10 μl sin cortar.
- Etiquete los portaobjetos de microscopio para la identificación de la muestra. Se pueden preparar dos o tres muestras en cada diapositiva. Colocar el portaobjetos sobre la mesa cerca del bloque de calor con el gel caliente. Corte las puntas de tres a cinco 20 puntas de micropipeta vinculante bajo μl por muestra con una hoja de afeitar o tijeras. Carga dos P20 Micropipetas con puntas de corte para permitir la rápida conmutación de uno a otro.
- Usando la primera micropipeta, agregar 15-20 μl de gel caliente en el tubo de microcentrífuga de islotes cuentas; inmediatamente la mezcla, evitando burbujas; y aplique la mezcla de granos de islotes de agar líquida a la diapositiva para formar un < disco de diámetro de 1 cm. Coloque el disco cerca del borde de la diapositiva, dejando espacio para el anillo de gel externo (siguiente paso). Puntee la diapositiva suavemente un par de veces a los islotes y los granos.
- Usando una micropipeta segundo, añadir 20 μl de gel caliente al tubo de muestras. Utilizando la primera micropipeta, nuevo gel mezcla con cualquier restantes cuentas islotes, recalentamiento en el bloque de calor si empieza a solidificar, entonces aplique esta mezcla a la diapositiva, que rodea el disco original. Repita según sea necesario, utilizando puntas cortadas adicionales, hasta que el disco es el tamaño y grosor.
Nota: El disco gelificado el manejo es más fácil si el anillo exterior es ligeramente más grueso. Por lo general, 3 x 20 μl de gel es suficiente. Este paso reduce al mínimo pérdida de islotes por tubo lavados y agrega islote pobres agarosa hacia el exterior del disco para facilitar el tratamiento de disco. - Preparar cada disco individualmente y seguimiento cuidadoso de la orden de la muestra si coloca varios discos en cada diapositiva.
- Coloque el portaobjetos sobre una superficie plana de hielo húmedo, con una cubierta, por 10 minutos o hasta que el gel se solidifica. Es más difícil deslizar el disco de vidrio si se seca a cabo.
- Etiqueta de procesamiento/incrustar cintas de tejido con lápiz, uno por cada muestra de la biopsia. Secar la parte posterior de la corredera para evitar mojar el papel azul.
- Con el borde romo de una hoja de afeitar, empuje suavemente el disco en cada dirección libre de la Copa. Cuando se desliza fácilmente, empuje lentamente el disco desde el portaobjetos sobre el papel de seda azul. Coloque el disco, el lado plano hacia abajo, directamente sobre el papel.
- Mantener el disco plano, doblar el papel alrededor del disco para prevenir movimiento, coloque el disco en un papel doblado en el cassette y cerrar el cassette. Si el disco no salga limpio el vaso, añadir más gel o volver la diapositiva de hielo durante unos minutos más.
- Sumerja el cassette en PBS en un vaso de precipitados. Proceso para incorporar el mismo día para la morfología óptima de la parafina.
4. inclusión en parafina de
Nota: El gel del islote de proceso discos para bloques de parafina utilizando una serie de deshidratación abreviado como se describe a continuación. Esta técnica se optimizó utilizando un procesador automático y procesamiento manual debe producir resultados similares.
- Sumergir cintas en etanol 85% durante 15 minutos.
- Sumergir cintas en etanol al 95% durante 15 minutos.
- Sumergir cintas en etanol al 100% durante 15 minutos. Repetir dos veces para un total de tres lavados.
- Sumergir cintas en xileno durante 15 minutos. Repetir dos veces para un total de tres lavados.
- Sumergir cintas en parafina fundida durante 10 minutos.
- Transferencia de cassettes a parafina fundida fresco durante 10-30 minutos.
- Cuidadosamente abra el cassette y desenvolver el papel azul. Retire el disco de gel, hacer el seguimiento de la superficie plana que se opuso al papel. Insertar el disco en un molde pequeño con la superficie plana (islotes conteniendo) hacia abajo, paralelo a la superficie de corte. Para el enchufe, cuidadosamente retire del cassette e incrustarlo en un molde pequeño con la punta apuntando hacia la superficie de corte.
5. parafina corte y tinción
- Etiqueta diapositivas secuencialmente, en caso de secciones seriadas.
- Tiene 5 secciones de parafina μm cortadas por un histotecnólogo experimentado. Para maximizar el rendimiento, guarde todas las secciones que contienen material. En general, que recoge 20 secciones permite captura de la mayoría del material.
- Guardar secciones a temperatura ambiente. Las secciones son susceptibles a las manchas histológicas rutinarias (por ejemplo, H & E) e inmunofluorescencia (p. ej., insulina, glucagón y DAPI). Optimizar la fijación de otros antígenos, si es necesario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 1muestra un esquema ilustrado de los pasos para preparar el disco de gel. Este gel disco método los resultados en las secciones de la parafina que contienen un número suficiente de islotes distribuidos en un solo plano para permitir la cuantificación significativa de los resultados. Figura 2 muestra las imágenes de baja magnificación de las secciones resultantes para ilustrar el número de islotes capturados por sección. En general, > 35 islotes eran visibles en cada sección al IEQ 250 fueron utilizados para el procedimiento, y > 10 secciones (4-5 μm) que contienen islotes obtenidas de cada muestra. Aumentar el número de islotes utilizado para el procedimiento aumentó el número de islotes en las secciones. Islotes en las secciones eran estructuralmente diversos y de diferentes tamaños, apoyando el concepto que nueva e interesante datos puede obtenerse usando las secciones en lugar de técnicas de ciegas a las diferencias entre islotes. El método funcionó igualmente bien para roedores islotes aislados en el laboratorio (rata, ratón) y de islotes humanos recibidos después del envío por el IIDP. Islotes de roedores tenían perceptiblemente más morfología intacta después de recuperación posterior al aislamiento durante la noche en medio del islote, con una superficie redondeada lisa y compacta forma esférica (figura 2A). Morfología del islote humano fue similar cuando se topa en el día de llegada o cuando después de la recuperación posterior a la expedición durante la noche, tal vez porque los islotes habían recuperado ya de la tensión de aislamiento antes del envío. El método de microtubo rindió un área transversal más pequeña de tejido, con islotes menos por sección y densamente poblado islotes y los granos (figura 2B). Las imágenes de microtubos se muestra en la figura 2B fueron los mejores que hemos podido obtener con este método; una de las muestras tuvo que ser enviado a cortar secciones más porque no hay islotes fueron encontrados en el primer conjunto de secciones.
Esta técnica genera secciones de islotes pancreáticos de alta calidad para histológico e inmunofluorescencia, tinción (figura 3). Insulina y glucagón manchas demostró la diversos composición y heterogeneidad de la arquitectura de la isla. Las secciones claramente recapitulan las diferencias de arquitectura conocido entre humanos, ratón y rata islotes, con islotes humanos conformadas por abundantes células α entremezclan con las células beta, mientras que islotes de rata y ratón demostraron una arquitectura similar con un núcleo de la célula beta y las células alfa en la periferia. Las secciones seriales eran obtenibles; los paneles en la figura 3 muestran las secciones seriales del mismo islote tinción h & E (izquierda) e inmunofluorescencia (derecha).
Figura 1 . Ilustración de los pasos críticos para hacer el disco de gel del islote. Gel calienta a 70 ° C en un bloque de calor (A) se transfiere al tubo de microcentrífuga de enlace baja que contiene el precipitado de islote/grano (B). Los islotes son suspendidos en gel caliente y transferidos a un portaobjetos de vidrio, que se separa el material en forma de disco (C, D). Gel de limpieza adicional se transfiere al tubo de microcentrífuga, entonces todo el material restante es eliminado y extensión circunferencial alrededor del disco inicial islote/grano-que contiene en el portaobjetos de vidrio (E-F). Después de gelificante en el hielo, el disco es transferido, plano lateral, al libro de histología (G), que es doblado y colocado en un cassette (H) para el proceso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Secciones de la parafina de gel discos contienen un gran número de islotes bien distribuidos. (A) paneles de bajo aumento (40 X, 3 x 3 imágenes cosidas juntas, con traslapo de 15%) de ratón, rata o islote humano secciones teñidas con H & E mostrar que muchos islotes son visibles en cada sección. Inserciones de alta magnificación (200 X) muestran islotes representante. Paneles de la izquierda muestran las secciones de islotes integrados inmediatamente después del aislamiento (ratón, rata) o envío (humano); paneles de la derecha muestran islotes integrados después de la recuperación durante la noche en la cultura. Círculos azules claros vistos en imágenes X 40 son los granos incluidos para la visualización durante la incrustación y seccionamiento. Estas muestras particular son de un ratón C57BL/6N (1 año de edad) y rata BBDR (4 semanas), islotes aislados por inyección de colagenasa ductal y separación de Ficoll e islotes de T2D humanos recibidas de lo IIDP. (B) 250 IEQ de islotes humanos incrustados por la vieja técnica de tubo de microcentrífuga, para comparación. Bajo paneles de ampliación (40 X; una sola imagen unstitched capturado todo el material) y apliques de alta mag (200 X) muestran secciones representativas. Medio de cultivo fue RPMI con 10% FBS, penicilina/estreptomicina y 5.5 mmol/L glucosa. Barras de escala para los paneles de ampliación baja son 1000 μm; barras de escala para los paneles de alta magnificación son 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Representante histoquímica y la inmunofluorescencia que manchaba en secciones de islote serial. Secciones de ratón, rata y humanos islotes integrado después de cultura durante la noche fueron tinción H & E y reflejada por microscopía brightfield (200 X; izquierda). Una sección adyacente fue manchada por insulina (rojo), glucagón (verde), montado en medios que contienen DAPI (azul) y reflejada mediante microscopía fluorescente (200 X; derecha). Barras de escala: 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este método de empotrar modificado basado en el disco de gel proporciona un simple, barato y la forma eficiente para generar un alto rendimiento de islotes por sección. Construyendo el disco gel sobre una superficie de vidrio plano facilita islotes que se separa en una distribución uniforme sobre un área bien definida. Difusión de los islotes en un disco plano ofrece la ventaja de colocar muchos islotes en el plano de la sección, optimizando el rendimiento y permitiendo menos islotes ser utilizado. El grueso del disco puede ajustarse para satisfacer las necesidades de los investigadores. Ya que se pueden obtener múltiples secciones, secciones seriadas de los mismos islotes pueden ser analizadas, aumentando el número de resultados distintos que pueden medirse en la misma muestra experimental. Aunque aquí optimizado de islotes pancreáticos, la técnica podría aplicarse a otros materiales de baja abundancia, los pequeños pedazos, naturaleza friable o muestras viscosas que serían difíciles de proceso incluidos. Este método está optimizado para islotes frescos-fijo y no ha sido probado para otros tipos de material, como islotes previamente congelados. Estas secciones también pueden ser útiles para los análisis hibridación en situ detectar ADN o ARN. La adición de gel extra sirve dos propósitos: para maximizar la colección de islote y para proteger el centro del islote rico disco de alteración durante manejo/transferencia. El disco de gel fina se solidifica rápidamente y permite xileno y deshidratación acortada pasos de infiltración para inclusión en parafina. Formando el disco sobre una superficie plana en lugar de en un contenedor secundario (microcentrífuga tubo o cultura placa bien) hace más fácil transferir físicamente el disco en el cassette para el procesamiento. En comparación con los resultados de la técnica de disco, la técnica de microtubo había reducido rendimiento del islote y aglutinadas distribución de islote, aunque el arreglo no-planar tejido podría generar un mayor número de islotes pancreáticos que contienen las secciones.
Los pasos críticos del protocolo incluyen la fijación de tejidos, formación del disco de gel, parafina inclusión y seccionamiento. Con respecto a la fijación, como probado por H & E y de la inmunofluorescencia para la insulina y el glucagón, no se detectaron diferencias entre la PFA y formalina o duración de la fijación que van desde 10 a 30 minutos (no mostrados). Sin embargo, duración e intensidad de la fijación deben ser optimizados para las necesidades del usuario final. La principal innovación contenida en el presente Protocolo es la preparación del disco gel islote; pasos críticos se resumen en la figura 1. Pasos clave incluyen utilizando una pequeña cantidad de gel para concentrarse en un área pequeña del tejido y formando el disco en una superficie plana para colocar el tejido en un solo plano de seccionamiento. Uso de los tubos del microfuge baja obligatoria y consejos y una centrífuga oscilante de cubo para todas las vueltas mejora rendimiento de tejido; islotes del palillo de plástico después de la fijación. Además de granos visibles ayuda en formación de disco, incrustar y seccionamiento. Retirar tanto PBS como sea posible antes de añadir que el gel es crítico para evitar diluir la agarosa, que conduce a la solidificación pobre y dificultad de transferencia del disco al papel. Manteniendo intacto el disco fino mientras que el desplazamiento de la corredera de vidrio al papel puede ser difícil. Si una arruga se produce en el disco, permita que regrese a la posición original, añadir más gel y volver a enfriar el portaobjetos. Con respecto a la inclusión en parafina, es importante que el disco de incrustar el lado plano hacia abajo y paralelas al plano de corte. Un histotecnólogo experimentada con cortar secciones de la parafina es esencial para el éxito de este procedimiento, ya que el material se concentra en el borde del bloque. Excesiva hacia fuera del bloque puede conducir a la pérdida de la muestra. Se recomienda comenzar a recoger las secciones como las perlas azules son visibles.
Duración y la intensidad de fijación deben ser optimizados para tejido específico y las necesidades del usuario final. El número de islotes por muestra puede modificarse si es necesario; sin embargo, reducir el material de partida genera secciones con islotes menos. Discos más gruesos o más grandes pueden ser generados usando esta técnica; deshidratación y xileno infiltración pasos deban ser alargado y deben ser optimizados. Si secciones resultantes contienen sólo una forma parcial de disco, considere la posibilidad de que el disco no estaba integrados paralelo a la superficie de corte. Si se obtienen también algunas secciones, el tecnólogo puede que haya perdido material durante la preparación del bloque inicial.
Este método genera secciones que contienen tejido islote fijo y, como tal, sólo puede utilizarse para los resultados histológicos. Para obtener un gran número de islotes por sección, 200-250 IEQ a partir material fue utilizado, que es un reto para algunos tipos de experimento. Secciones de alta calidad dependen de tener un histotecnólogo experimentado.
La capacidad para generar 10 + secciones que contienen muchos islotes de una única condición experimental permite cuantificación de resultados múltiples en el mismo material, mejorar la eficiencia experimental. Análisis de rutina de islotes intactos pueden conducir a avances en la comprensión en la heterogeneidad del tejido, no sólo a nivel celular, sino también en el plano de la isla, sobre la que poco se entiende actualmente. Aplicar esta técnica a otras muestras de tejido de abundancia limitada puede ofrecer beneficios a otros campos también.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al grupo de Biología de la célula Beta en el UMass Diabetes centro de excelencia para el debate y consejos útiles. Islotes pancreáticos humanos fueron proporcionados por el NIDDK financiado integrado islote distribución programa (IIDP) en ciudad de la esperanza. Este trabajo fue financiado por NIH/NIDDK: R01-DK114686 (ACV), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) y por la Asociación de Diabetes Americana #1-15-BS-003 (ACV) en colaboración con la orden del amaranto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
- Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: http://iidp.coh.org/ (2018).
