Summary
Ex-vivo הלבלב איון מחקרים חשובים לחקר הסוכרת. קיימות טכניקות ללמוד איונים בתרבית באדריכלות תלת-ממדי מקורי שלהם הן זמן רב, לא יעיל, הנמצאים בשימוש לעיתים רחוקות. עבודה זו מתאר שיטה חדשה, פשוט ויעיל ליצירת באיכות גבוהה פרפין מקטעי איונים תרבותי שלם.
Abstract
ניסויים באמצעות איים מבודדים הלבלב חשובים למחקר בסוכרת, אך איונים הם יקרים השפע מוגבל. איונים מכילים אוכלוסיה לתא מעורב באדריכלות מובנית אשר משפיעה על תפקוד, איונים אנושי נרחב משתנה בקומפוזיציה סוג התא. שיטות נפוצות ללמוד איונים בתרבית כוללים מולקולרית מחקרים שבוצעו על כל איונים, מכלילה איון ובתחזוקה סוגי תאים ביחד, או מיקרוסקופ או במחקרים מולקולריים בתאי איון התפזרו, שיבוש איון אדריכלות. ללימודים ויוו איון, הלבלב פרפין-מוטבע חלוקתה היא טכניקה חזקה כדי להעריך את תוצאות ספציפיות תא בסביבת הלבלב מקורית. לימוד פוסט-תרבות איים על ידי חלוקתה פרפין, הייתי מציע מספר יתרונות: זיהוי של תוצאות מרובים על אותו איים קטנים (שעשויות להיות אפילו אותו ליתר דיוק איונים, באמצעות סעיפים טורי), מדידות ייחודיים לסוג התא, יליד לשמירה על איון תא התא, התא-תשתית אינטראקציות במהלך החשיפה ניסיוני והן לצורך ניתוח. עם זאת, קיימות טכניקות הטבעה מבודדים איונים פוסט-תרבות הן לא יעיל, זמן רב, נוטה אובדן של חומר, בדרך כלל לייצר סעיפים במספרים איון לא מספיק כדי להיות שימושי עבור לכימות תוצאות. הפתולוגיה הקלינית מעבדה התא בלוק הכנה מתקני הינם נגישים ולא מעשי עבור מעבדות מחקר בסיסי. פיתחנו שיטת ספסל-העליון משופרת, ההופך את יוצרת מקטעים עם תשואה חזקים והפצה של איים קטנים. איונים קבוע resuspended ב agarose היסטולוגית חמים ג'ל, pipetted לתוך דיסק שטוח על משטח זכוכית רגילה, כך איים מפוזרים במטוס. לאחר התייבשות רגילה, הטבעה, ניתן לחתוך (10 +) 4-5 מיקרומטר מקטעים מרובים מהגוש איון אותו. באמצעות שיטה זו, ניתן לבצע ניתוחים היסטולוגית ו immunofluorescent על עכבר, חולדה, איונים אנושי. זו גישה אפקטיבית, זולה, לחיסכון בזמן כדי להעריך מן איונים בתרבית תאים ייחודיים לסוג, שלם-אדריכלות התוצאות.
Introduction
הלבלב לנגרהנס, המקור הבלעדי של מחזורי אינסולין, הם רקמה קריטי לחוקרים הלומדים סוכרת. מכל יצור נתונה, איים קטנים יש גודל המשתנה תדירות סוג התא, אדריכלות1,2,3. האסטרטגיה קונבנציונאלי ללמוד ויוו מבנה והרכב האנדוקרינית תא לנגרהנס הוא על ידי חלוקתה4,של רקמת הלבלב5. מאז איונים מהווים רק חלק קטן הכולל תכנים סלולריים הלבלב, במחקרים מולקולריים מבוצעות על איים מבודדים. Ex-vivo איון תרבות ניסויים בדיקות בתגובה חומרים מזינים, ג'ין אפנון (תרביות תאים, התמרה חושית), או טיפולים ניסיוניים לספק חשוב תובנות מנגנוני הכוח ויסות הישרדות cell האנדוקרינית, התפשטות, ופועלים 5 , 6.
Ex-vivo איון ניסויים לעיתים קרובות הם ניתחו שימוש במחקרים מולקולריים של איים שלם או מחקרים היסטולוגית או מולקולרית של תאי איון התפזרו גדלו ב חד שכבתי5,6. אנליזה מולקולרית של איים קטנים כל מציג אזהרה חמורה של סוגי תאים intermixing, אשר עשויה לייצר תוצאות שווא-שלילי או חיובי-false כאשר אומדן לכל סוג של תא בודד. תא פיזור על coverslips עבור פוסט-תרבות מיקרוסקופיה מאפשר מדידה תוצאה ייחודיים לסוג התא, אך משבש איון אדריכלות, אשר עשוי לשנות את התגובה להתערבות, מונע זיהוי של תוצאות הקשורות אדריכלות. בנוסף, בדרך כלל רק תוצאה אחת ניתן למדוד; לדוגמה, כדי למדוד את התפשטות תאי בטא ומוות תאי בטא תחת באותם התנאים, שני ניסויים נפרדים צריך להתבצע. גישות אלה הם גם עיוור הבין-איון השתנות, שטח של עניין גובר בתחום. מיון תאי איון מאת cytometry זרימה במחקרים מולקולריים ייחודיים לסוג התא, או מחקרים RNA בתא יחיד הינם אלגנטיים אך יקר, זמן רב, מוגבלת על ידי רקמת שפע, ולחסל-אדריכלות, לא מתאימה כדי תא שגרתית תרבות ניתוחים 5 , 7. הדמיה קונאפוקלית של איים immunostained כולה-הר מספק נתונים שלם-אדריכלות באיכות גבוהה, אבל עמל רב, והנתונים שהתקבלו כל מדגם מוגבל לתוצאות לזיהוי יחיד immunostaining8.
היכולת לייצר באיכות גבוהה פרפין מקטעים של פוסט-תרבות איונים כל כתובת זו הרבה חששות אלה. עלות גבוהה, נמוך-שפע איון רקמות דגמים גנטיים ייחודיים או תורמי איברים אנושיים, או איים מצב פוסט vivo בתוך או במבחנה ניסיוני מניפולציה, יקרות. קבלת מספר מקטעים פרפין מ איונים באותו תאפשר ניתוחים ייחודיים לסוג התא, שלם-ארכיטקטורה מרובים מאותו הניסוי.
קיימות טכניקות ליצירת כדורי איון על חלוקתה מושלמים. Agarose הממוטבים היסטולוגיה היא ג'ל מימית נקודת התכה נמוכה נרחב המשמש לעיבוד היסטולוגית ו cytological דגימות כולל דגימות רקמה קטן או מפוצלים שקשה תהליך9. אחד איון הטמעת הגישה היא להשעות את איים קטנים ב- agarose בשפופרת microcentrifuge, צנטריפוגה הצניפה החומר, לאחזר את התקע אגר, ולאחר מכן לעבד, להטביע על חלוקתה10,11. חילוץ המדגם הקרושה מהחלק התחתון של הצינור הוא זמן רב וקשה, שמוביל מפעם לפעם פיצול של המדגם, הסיכון לפציעה. איים מרוכזים בקצה של התקע, שמוביל איון לקוי הפצה בסעיפים המתקבל בשיטה זו. בתחתית התקע עגול מסבך הטבעה כזאת אזור איון-עניים שיוצבו על חלוקתה. בסך הכל, שיטה זו מובילה תשואה נמוכה והפצה איון גושית בסעיפים וכתוצאה מכך.
שיטה חדשה זו היא גישה מפושטת ומשופרות עבור הכנת איון מקטעים. איים מרוכזים אמצעי אחסון קטן, ואז להניח אותה על פני חלקה של שקופית מיקרוסקופ כדי ליצור דיסק קטן, עם איים מטוס יחיד. הדיסק Histogel-איון לאחר מכן מעובד עבור פרפין הטבעה התייבשות מקוצר, קסילן הסתננות פרוטוקול. הגישה הקודמת, אשר מרכזת את איונים בחלק התחתון של צינור microfuge, מבוצעת גם לשם השוואה. טכניקה חדשה זו משפרת את התשואה של איים קטנים לכל סעיף, ההתפלגות של איים קטנים בכל מקטע, ולוקח פחות זמן כדי להעביר בלוקים איון קלטות. טכניקה זו שימושית לביולוגים איון או מדענים אחרים הלומדים חתיכות קטנות של רקמות המעוניינים למקסם פורה לשימוש טישו נמוך-שפע על ידי מדידת תוצאות מרובות על דוגמה אחת בארכיטקטורה רקמה מקורי שלו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על ידי במסצ'וסטס הספר מוסדיים חיה טיפול רפואי ועל שימוש הוועדה. איון האנושי מחקרים נקבעו על ידי מועצת המנהלים לסקור מוסדיים במסצ'וסטס אינן מצריכות סקירה IRB או פטור משום שהם אינם כרוכים השימוש של בני אדם.
1. איון בידוד ותרבות
- לבודד איונים, נפרדות ובלחות אקסוקרינית ו ductal רקמות בשיטת הבחירה שלך.
הערה: שיטה זו היה ממוטב באמצעות איים מבודדים collagenase ductal insufflation ו Ficoll ההפרדה12 (מכרסם) או משלוח שלאחר איונים מתוכנית משולב איון הפצה (IIDP13; האדם). איים מוגנים עם micropipette P200. - כדי למטב את איון מורפולוגיה, לאפשר איונים להתאושש בין לילה ב 10 מ"ל איון מוחלט בינוני (RPMI עם 10% FBS פניצילין/סטרפטומיצין, גלוקוז 5.5 mmol/L) בתוך תא humidified המכילה 5% CO2 ב 37 º C. למרות שלב זה לא נדרש להשיג חלקים, איים שלמים יותר לאחר תקופת התאוששות (ראה איור 2).
2. איון קיבוע
- באמצעות טיפ P200 נמוך מחייב, לבחור. לאישתך כ 250 איון מקבילות (IEQ)13 באמצעות רשת מכוילת תחת stereomicroscope לתוך צינור microfuge 1.5 mL מחייב נמוכה. טיפים וצינורות נמוך מחייב להפחית את אובדן איון.
- לאפשר איונים להתיישב לתחתית הצינור microfuge. הסר את תגובת שיקוע ברוב עם טיפ pipet P200, מטפל יש להסיר כל איונים.
- להוסיף 1 מ"ל ל- PBS. צנטריפוגה צינור ומפרידה דלי מתנדנדים עד המהירות מגיע 200 גרם x, אז לעצור את העובדות. הסר את תגובת שיקוע. חזור על שטיפת PBS, עבור סכום כולל של שני שוטף.
- להוסיף 500 µL של פתרון פורמלין 10% או 4% טריות paraformaldehyde. לתקן בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. התוצאות נבדק בשיטה זו, שיטות קיבוע אלה היו להבחין מגניחותיה. קיבוע קצר יותר ייתכן גם שתהיה אפשרות; מומלץ למטב את הקיבעון משך התוצאה הרצויה.
- הסר את לשבועיים עם טיפ P200.
- להוסיף 1 מ"ל ל- PBS. צנטריפוגה צינור עד המהירות מגיע 200 גרם x, אז לעצור את העובדות. הסר את תגובת שיקוע. חזור על שטיפת PBS, עבור סכום כולל של שני שוטף.
- המשך מיד לשלב הבא.
3. הכנת דיסק איון (איור 1)
- השימוש הראשון, להמיס את הג'ל (למשל, Histogel) ב 70 ° C ולעשות aliquots ב 1.5 mL microfuge צינורות לאחסון לטווח ארוך. נפח aliquot אינה קריטית, שכן aliquots יכול להיות שימוש חוזר.
- לחמם את הג'ל (כ-100 µL עבור דגימה) ב 70 מעלות צלזיוס על ידי הצבת microfuge שפופרת המכילה את aliquot ג'ל בתוך גוש חום מוגדר כ- 70 מעלות צלזיוס.
- העברת agarose כחול חרוזים (10 µL עבור כל דגימה) לתוך צינור נקי microfuge 1.5 mL. Resuspend ביסודיות את החרוזים לפני pipetting.
הערה: חרוזים כחול מעורבבים עם איונים כדי לסייע בזיהוי חזותי של החומר מוטמע לחצן agarose ואת הרחוב פרפין. מספר חרוזים כחול המשמש אינה קריטית לתוצאות, אך להימנע חרוזים מוגזמת (> 5 x מספר איים קטנים) כדי לאפשר הפצה אופטימלית של איים קטנים בסעיפים. - לשטוף את החרוזים הכחולים עם 1 מ"ל PBS, פעמיים. עבור כל כביסה, לסובב את החרוזים 1 דקות ב- g 800 x. לאחר לשטוף את השני, resuspend את החרוזים ב (n+2) x 10 הציבורית µL, כאשר n הוא המספר של צינורות מדגם; לדוגמה, עבור 2 צינורות מדגם, האחסון PBS כדי להוסיף החרוזים יהיה 40 µL.
- Centrifuge את הצינור microfuge המכיל איים קטנים (קצר spin כדי 200 גרם x) ולהסיר את רוב תגובת שיקוע. לחתוך את הקצה של טיפ micropipette 10 µL בעזרת מספריים או סכין ולהוסיף 10 µL של חרוזים כל שפופרת איון, באמצעות טיפ נקי עבור כל דגימה. לא מערבבים (כדי להימנע מאובדן איים קטנים).
- צנטריפוגה איים קטנים, חרוזים (קצר spin כדי 200 גרם x). להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר עם טיפ micropipette נימולים 10 µL.
- תווית של שקופיות מיקרוסקופ לזיהוי הדגימה. 2-3 דוגמאות ניתן להכין בכל שקופית. מקם את השקופית על הספסל ליד הרחוב חום עם ג'ל ומחוממת. חותכים הטיפים של שלוש עד חמש 20 טיפים micropipette µL קשירה נמוכה עבור דגימה עם גילוח או מספריים. לטעון micropipettes P20 שני עם טיפים לחתוך כדי לאפשר מהירה מתמיכת אחד לשני.
- באמצעות את micropipette הראשונה, להוסיף µL 15-20 של ג'ל חם הצינור microfuge איים קטנים/חרוזים; מיד לערבב, הימנעות בועות; חלות נוזל התערובת אגר/איים קטנים/חרוזים השקופית לטופס < דיסק בקוטר 1 ס מ. מקם את הדיסק סמוך לקצה השקופית, משאיר מקום הטבעת החיצונית ג'ל (השלב הבא). הקש על השקופית בעדינות מספר פעמים כדי ליישב את איים קטנים, חרוזים.
- באמצעות micropipette של השני, להוסיף 20 µL של ג'ל חם הצינור הדגימה. באמצעות את micropipette הראשונה, לערבב ג'ל חדש עם כל שאר איונים/חרוזים, מחדש ההתחממות בבלוק חום אם הוא מתחיל לגבש, לאחר מכן להחיל תערובת זו אל השקופית, המקיפים את הדיסק המקורי. חזור על הצורך, באמצעות טיפים נוספים חתוכות מראש, עד הדיסק הוא הגודל הרצוי ואת עובי.
הערה: טיפול הדיסק וג'ל קל אם הטבעת מבחוץ היא מעט עבה יותר. בדרך כלל, 3 x 20 µL של ג'ל מספיקה. שלב זה ממזער אובדן איים על ידי צינור שוטף ומוסיפה מסכן איון agarose החיצוני של הדיסק כדי להקל על הטיפול דיסק. - להכין כל דיסק בנפרד ולשמור בזהירות אחר סדר דגימה אם הצבת מרובות דיסקים בכל שקופית.
- במקום השקופיות על משטח שטוח של קרח רטוב, עם כיסוי, במשך 10 דקות או עד עפור הג'ל. . זה קשה יותר להחליק את הדיסק את הזכוכית אם זה מתייבש.
- תווית ביופסיה עיבוד/הטבעה רקמות קלטות עם עיפרון, אחד לכל דגימה. יבש האחורי של השקופית כדי להימנע להרטיב את נייר כחול.
- משתמש הקצה הקהה של סכין גילוח, דחף בעדינות את הדיסק לכל כיוון כדי לשחרר אותו מהזכוכית. כאשר הוא מחליק בקלות, לאט לדחוף את הדיסק מתוך השקופית מיקרוסקופ על הנייר טישו כחול. הנח את התקליטור, צידה השטוח, ישירות על הנייר.
- שמירה על הדיסק שטוח, מקפלים את הנייר סביב התקליטור כדי למנוע תנועה, הכנס את הדיסק נייר מקופל בקלטת, ולסגור את הקלטת. אם הדיסק לא לגלוש נקיה הזכוכית, להוסיף ג'ל נוסף ו/או להחזיר את השקופית לקרח במשך עוד כמה דקות.
- להטביע את הקלטת ב- PBS ב גביע. תהליך פרפין הטבעה באותו היום על מורפולוגיה של האופטימלית.
4. פרפין הטבעה
הערה: תהליך הג'ל איון דיסקים פרפין בלוקים באמצעות סדרות התייבשות מקוצרת כפי שמתואר להלן. טכניקה זו אופטימלי באמצעות מעבד אוטומטית, אך עיבוד ידני צריך לייצר תוצאות דומות.
- לטבול קלטות 85% אתנול במשך 15 דקות.
- לטבול קלטות אתנול 95% במשך 15 דקות.
- לטבול קלטות 100% אתנול במשך 15 דקות. חזור על פעמיים עבור סכום כולל של שלושה שוטף.
- לטבול קלטות של קסילן במשך 15 דקות. חזור על פעמיים עבור סכום כולל של שלושה שוטף.
- לטבול קלטות של פרפין מותכת במשך 10 דקות.
- העברת קלטות פרפין מותכת טריים למשך 10-30 דקות.
- בזהירות פתח את הקלטת, עטיפה בעיתון כחול. הסר את התקליטור ג'ל, שמירה על מסלול של משטח שטוח שהופעל על הנייר. להטביע את הדיסק בתבנית קטנה, עם משטח שטוח (המכילות איון) למטה, במקביל למשטח חיתוך. עבור התקע, בזהירות להסיר אותו בקלטת, להטביע אותו תבנית קטנה עם קצה והצביע לעבר משטח חיתוך.
5. פרפין חלוקתה ולא מכתים
- תווית שקופיות ברצף אם מקטעים טורי נדרשות.
- יש 5 מיקרומטר פרפין מקטעים קיצוץ של histotechnologist מנוסה. כדי למקסם את התשואה, שמור כל המקטעים המכילים חומר. באופן כללי, איסוף מקטעים 20 מאפשר לכידה של רוב החומר.
- חנות מקטעים בטמפרטורת החדר. סעיפים נתונות שגרתית היסטולוגית כתמים (למשל, H & E) ו immunofluorescence (למשל, אינסולין, גלוקגון, דאפי). למטב את הקיבעון של אנטיגנים אחרים, אם יש צורך בכך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מפרטים טכניים מאויר של צעדים כדי להכין את הדיסק ג'ל מוצג באיור1. זה ג'ל דיסק בשיטה התוצאות בסעיפים פרפין המכילים מספר מספיק של איים מופץ במטוס בודד כדי לאפשר כימות משמעות של תוצאות. איור 2 מציג תמונות נמוך-הגדלה של הסעיפים שנוצר כדי להמחיש את מספר איונים שנתפסו לפי סעיף. באופן כללי, > איונים 35 היו גלויים בכל מקטע 250 IEQ שימשו את ההליך, ו > סעיפים 10 (4-5 מיקרומטר) המכיל איונים, התקבלו כל דגימה. הגדלת מספר איים קטנים המשמשים את ההליך הגדילה את מספר איונים בסעיפים. איונים בסעיפים היו מגוונות מבחינה מבנית, בגדלים שונים, את הרעיון החדש, מעניין נתונים ניתן להשיג באמצעות סעיפים ולא טכניקות עיוור להבדלים הבין-איון. השיטה עבדה באותה מידה גם עבור מכרסמים איים מבודדים במעבדה (עכברים, עכבר) ועבור איונים אנושי לאחר משלוח שקיבל את IIDP. איונים מכרסמים היה ניכר יותר מורפולוגיה ללא פגע לאחר השחזור שלאחר בידוד בין לילה איון בינוני, עם משטח מעוגל חלק וקומפקטי צורה כדורית (איור 2א). מורפולוגיה אנושית איון היה דומה כאשר מוטבע על יום ההגעה או מוטבע לאחר השחזור שלאחר משלוח בן לילה, אולי בגלל ע כבר התאוששו בידוד מתח לפני משלוח. שיטת microtube הניבו רקמות חתך הרוחב לאזור קטן, עם פחות איונים לכל סעיף, וארזו בצפיפות איים קטנים, חרוזים (איור 2B). הדימויים microtube המוצגים באיור 2B היו הטובים ביותר שיכולנו להשיג בשיטה זו; לאחד הדגימות היה להישלח חזרה לחתוך קטעים יותר כי אין איונים נמצאו במערכה הראשונה של מקטעים.
טכניקה זו יוצרת מקטעים איון באיכות גבוהה עבור היסטולוגית ו immunofluorescence מכתים (איור 3). אינסולין, גלוקגון מכתים הראה את הרכב מגוון והטרוגניות של איון אדריכלות. הסעיפים בבירור recapitulated אדריכלות ידוע ההבדלים בין בני האדם, עכבר, חולדה איונים, עם איים האנושית המורכבת של תאי-α שופע התערבבו עם תאי הבטא, ואילו איונים עכבר ועכברוש, הראה אדריכלות דומה עם ליבה של תאי בטא תאי אלפא בפריפריה. סעיפים טורי היו השגה; הלוחות באיור 3 הצג סעיפים טורי של אותו איון צבעונית עבור H & E (משמאל) ו immunofluorescence (מימין).
איור 1 . איור של השלבים הקריטיים להכנת התקליטור ג'ל איון. ג'ל התחמם עד 70 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום (א) מועבר אל הצינור microfuge מחייב נמוך המכיל בגדר איון/חרוז (B). ע resuspended ב ג'ל חם והועבר שקופית מזכוכית, הפצת החומר בצורת דיסק (C-D). ג'ל נקי נוספים מועבר אל הצינור microfuge, ואז כל החומר הנותר הוא הסיר circumferentially לפזר את הדיסק הראשונית איון/חרוז-המכיל בשקופית זכוכית (E-F). לאחר ג'לי על קרח, הדיסק הוא צד שטוח, שהועברו, היסטולוגיה נייר (ז), אשר הוא מקופל והניח קלטת (H) לצורך עיבוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. פרפין מקטעים של ג'ל הדיסקים מכילים מספר רב של איים קטנים המפוזרים היטב. (א) הגדלה נמוכה לוחות (40 X, 3 x 3 תמונות תפר יחד, עם חפיפה 15%) של עכבר, חולדה או איון האנושי סעיפים מוכתמים H & E להראות כי איים רבים גלויים בכל מקטע. בהגדלה כניסות (200 X) הצג נציג איים קטנים. לוחות שמאלה מראים קטעים של איים מוטבע מיד לאחר בידוד (עכבר, חולדה) או משלוח (בני אדם); נכון מראות איונים מוטבע אחרי התאוששות לילה בתרבות. חיוור העיגולים הכחולים ראיתי בתמונות X 40 הם החרוזים כלולים להדמיה במהלך ההטמעה והשיוך חלוקתה. אלה דוגמאות מסוים הם C57BL/6N העכבר (בן שנה), עכברים BBDR (בן 4 שבועות), איים מבודדים על ידי הזרקת ductal collagenase והפרדה Ficoll, איים T2D האדם קיבל את IIDP. (B) 250 IEQ של האדם איונים מוטבע לאדם זקן microfuge צינור הטכניקה, לשם השוואה. נמוכה הגדלה לוחות (40 X; יחיד תמונת unstitched כבשו את כל החומר) ולהראות כניסות mag גבוהה (200 X) סעיפים נציג. תרבות בינוני היה RPMI עם 10% FBS פניצילין/סטרפטומיצין, גלוקוז 5.5 mmol/L. גודל ברים לפאנלים הגדלה נמוכה הם 1000 מיקרומטר; גודל ברים עבור לוחות בהגדלה הם 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . נציג פתולוגיה, immunofluorescence מכתים במקטעי איון טורי. מקטעים של עכבר, חולדה איונים האנושי מוטבעת לאחר לילה תרבות היו מוכתמים ל H & E, עם תמונה על ידי מיקרוסקופ brightfield (200 X; שמאלה). מקטע הסמוך היה מוכתם גלוקגון, אינסולין (אדום) (ירוק), נטען בתקשורת המכילות דאפי (כחול), עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (200 X; נכון). גודל ברים: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ששונה ג'ל-דיסק מבוסס ההטבעה שיטה זו מספקת פשוטה, זולה, דרך יעילה ליצירת תשואה גבוהה של איים קטנים לכל סעיף. בניית הדיסק ג'ל על משטח זכוכית שטוחה מקלה על איונים מתפשטת בריפודי כתופיים מעל אזור מוגדר היטב. להפיץ את איים בדיסק שטוח מציעה את היתרון של הצבת איים רבים במישור של מקטע, אופטימיזציה של התשואה ומאפשר איונים פחות לשמש. ניתן להתאים את עובי דיסק כדי לענות על הצרכים של החוקרים. מאז ניתן להשיג מספר מקטעים, טורי חלקים איים באותו יכול להיות מנותח, הגדלת מספר תוצאות נפרדות שניתן למדידה על הדגימה ניסיוני באותו. למרות המותאם במיוחד כאן לנגרהנס, בטכניקה יכול להיות מיושם חומר נמוך-שפע אחר, כולל אלה עם חתיכות קטנות, הטבע לעזאזל או דגימות צמיגה שאחרת היה קשה לעכל. שיטה זו ממוטבת עבורו איונים טריים-קבוע, לא נבדק עבור סוגים אחרים של חומרים, כמו איים בעבר קפואים. סעיפים אלה גם עשויה להיות שימושית עבור בחיי עיר הכלאה מבחני לגילוי DNA או RNA. התוספת של ג'ל נוסף משמשת לשתי מטרות: להגדיל את אוסף איון וכדי להגן על המרכז איון-עשיר דיסק מפני שיבושים במהלך העברת/טיפול. התקליטור ג'ל דק עפור במהירות, ומאפשר התייבשות מקוצר, קסילן הסתננות צעדים להטבעת פרפין. להרכיב את הדיסק על משטח שטוח ולא במיכל המשני (microfuge צינור או תרבות לוח טוב) מקל עליך להעביר פיזית את הדיסק לקלטת לעיבוד. כאשר לעומת התוצאות טכניקה דיסק, הטכניקה microtube היה מופחתת התשואה איון, התגבש איון הפצה, למרות הסידור הרקמה הלא-מישורי יכול לייצר מספר גדול יותר של איון המכיל מקטעים.
השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כוללות רקמות קיבעון, היווצרות של הדיסק ג'ל, פרפין הטבעה ולאחר חלוקתה. לגבי יציבות, כפי שנבדקו על-ידי H & E ו- immunofluorescence אינסולין, גלוקגון, אין הבדל זוהה בין מחברים, פורמלין, או משך קיבוע הנע בין 10-30 דקות (לא מוצג). עם זאת, קיבוע בעוצמת ומשך צריך להיות מוטבת לצרכים של משתמש הקצה. החידוש העיקרי הכלול בפרוטוקול זה הוא הכנת ג'ל איון הדיסק; שלבים קריטיים מסוכמות באיור1. השלבים החשובים כוללים באמצעות אמצעי אחסון קטן של ג'ל להתרכז רקמות באזור קטן ויוצרים את הדיסק על משטח שטוח כדי לארגן את הרקמה במטוס יחיד חלוקתה. השימוש מחייב נמוך microfuge צינורות, טיפים, צנטריפוגה דלי מתנדנדים עבור מהדורות כל משפר את רקמת תשואה; איונים מקל פלסטיק לאחר קיבוע. תוספת של חרוזים גלויים בקלות מסייע דיסק למערך, הטבעה, חלוקתה. הסרת כמה שיותר PBS ככל האפשר לפני הוספת שהג'ל הוא קריטי כדי למנוע דילול של agarose, מה שמוביל התמצקות המסכן ואת הקושי העברת הדיסק על הנייר. לשמור את הדיסק דק ללא פגע בעת הזזה של השקופית זכוכית על הנייר יכול להיות מאתגר. אם קמט מתרחשת הדיסק, לאפשר לחזור למצב המקורי, להוסיף עוד ג'ל ולהירגע מחדש את השקופית. לגבי פרפין הטבעה, חשוב כי הדיסק ניתן להטביע שטוח כלפי מטה, מקביל למישור של חיתוך. Histotechnologist מנוסה עם חיתוך פרפין מקטעים חיוני להצלחת הליך זה, שכן החומר הוא מרוכז בחוד החנית של גוש. מול יתר מחוץ לבלוק עלול להוביל לאובדן של המדגם. מומלץ להתחיל איסוף מקטעים ברגע החרוזים הכחולים גלויים.
קיבוע בעוצמת ומשך צריך להיות מוטבת בשביל לרקמות ספציפיות וצרכים של משתמש הקצה. ניתן לשנות את מספר איונים המשמש לדגימה במידת הצורך; עם זאת, הפחתת חומר המוצא יוצרת מקטעים עם פחות איונים. דיסקים עבה יותר או גדול יותר יכול להיווצר בעזרת טכניקה זו; התייבשות קסילן הסתננות צעדים ייתכן שתצטרך להיות מאורכים, צריך להיות מותאם. אם וכתוצאה מכך מכילים רק צורת דיסק חלקית, לשקול האפשרות כי הדיסק לא היה מוטבע במקביל למשטח חיתוך. אם גם מספר קטעים מתקבלים, טכנולוג איבד חומר במהלך הכנת בלוק הראשונית.
שיטה זו יוצרת מקטעים המכיל רקמות איון קבועה, בתור שכזה, ניתן להשתמש רק לתוצאות היסטולוגית. כדי לקבל מספר רב של איים קטנים לכל סעיף, IEQ 200-250 החל החומר שימש, אשר הוא מאתגר ליצור עבור סוגים מסוימים ניסוי. חלקים באיכות גבוהה תלויות שיש histotechnologist מנוסה.
היכולת להפיק 10 + מקטעים המכילים איים רבים מתוך ניסיוני תנאי יחיד יאפשר כימות של תוצאות מרובים על אותו חומר, לשפר את היעילות ניסיוני. ניתוח שגרתי של איים שלמים עלול להוביל ההתקדמות בהבנת רקמות הטרוגניות, לא רק ברמה התאית, אלא גם ברמת איון, על אילו מעט כעת מובנת. החלת טכניקה זו דגימות רקמה מוגבלת-שפע אחרים עשויים להציע יתרונות בתחומים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להכריז.
Acknowledgments
אנו להכיר בהכרת תודה הקבוצה ביולוגיה תאי בטא-תעודה מזויפת של אונ' סוכרת מרכז של מצוינות עבור עצות מועילות ודיונים. האדם לנגרהנס נמסרו על ידי NIDDK במימון משולב איון הפצה התוכנית (IIDP)-עיר של תקווה. עבודה זו מומן על ידי NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (חודשים), 2UC4DK098085 (IIDP), על ידי האגודה האמריקנית לסוכרת תמלא #1-15-BS-003 (LCA) בשיתוף עם הסדר של ירבוז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
- Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: http://iidp.coh.org/ (2018).
