Summary

הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

Published: June 20, 2018
doi:

Summary

כאן אנחנו פירוט שיטת הדמיה תא בשידור חי של אקסוציטוזה מוסדר. שיטה זו משתמשת FITC-לתוספי, אשר צוברת ב הקשורות ליזוזום organelles, בתור כתב. שיטה פשוטה זו מאפשרת גם הבחנה בין מצבים שונים של אקסוציטוזה מווסתת בתאים קשה לתמרן גנטית.

Abstract

אקסוציטוזה מוסדר הוא תהליך שבאמצעותו מטענים, אשר מאוחסן בגרגרים הפרשה (SGs), משוחרר בתגובה גורם הפרשה. אקסוציטוזה מוסדר הוא היסוד לתקשורת המערכת והוא מפתח מנגנון הפרשת נוירוטרנסמיטרים, הורמונים, מתווכים דלקתיים, תרכובות אחרות, על ידי מגוון רחב של תאים. לפחות שלושה מנגנונים נפרדים ידועים אקסוציטוזה מוסדר: אקסוציטוזה מלא, איפה SG יחיד מלא ולספות עם קרום פלזמה, נשיקה-וברח אקסוציטוזה, איפה SG יחיד פתילים transiently עם קרום פלזמה, ומתחם אקסוציטוזה, איפה SGs מספר נתיך אחד עם השני, לפני או אחרי ס ג פיוז’ן עם קרום פלזמה. סוג מוסדר אקסוציטוזה שנערך על ידי תא מוכתב לעתים קרובות על ידי הסוג של גירוי הפרשה. עם זאת, תאים רבים, בגורם מפעיל הפרשה יחיד ניתן להפעיל מספר מצבי של אקסוציטוזה מוסדרים בו זמנית. למרות שפע שלהם ואת חשיבות על פני התא סוגים ומינים, המנגנונים הקובעות את מצבים שונים של הפרשת הן במידה רבה בלתי פתורות. אחד האתגרים העיקריים בחקירת על מצבים שונים של אקסוציטוזה מוסדר, הוא הקושי הבחנה ביניהם, כמו גם לחקור אותם בנפרד. כאן נתאר את השימוש fluorescein isothiocyanate (FITC)-לתוספי אקסוציטוזה הכתב, וכן תא חי הדמיה, כדי להבדיל בין המסלולים השונים של אקסוציטוזה מוסדר, התמקדות אקסוציטוזה מורכבים, בהתבסס על החוסן, משך הזמן של אירועים exocytic.

Introduction

אקסוציטוזה מוסדר הוא המנגנון העיקרי שבאמצעותו מטענים בקלות עשה הוא שוחרר מן תא הפרשה בתגובה גורם ספציפי. המטען מראש נוצר, מבודדות לתוך שלפוחית הפרשה, שבו הוא מאוחסן עד טריגר ממסרים האות לשחרור של התוכן של SGs. סוגים שונים של אותות עלולה לגרום מצבים שונים של אקסוציטוזה מוסדר, או מצבים שונים של אקסוציטוזה מוסדר עלולה להתרחש בו זמנית. שלושה מצבים עיקריים של אקסוציטוזה מוסדר ידועים: אקסוציטוזה מלאה, הכוללת פיוז’ן מלא של גרגר הפרשה יחיד עם קרום פלזמה; נשיקה-וברח אקסוציטוזה, שכרוך ארעי הפיוז’ן גרגר הפרשה עם קרום פלזמה ואחריו שלה מיחזור; ו אקסוציטוזה מורכבות, אשר מאופיין על ידי homotypic פיוז’ן של מספר לפני SGs (קרי, אקסוציטוזה multigranular) או רציף (קרי, אקסוציטוזה רציפים) כדי פיוז’ן עם קרום פלזמה1. אקסוציטוזה מתחם נחשב מצב הנרחב ביותר של מטען מהדורה2, כמו זה מאפשר הפרשה מהירה של מטענים, כולל זה של SGs הממוקמים דיסטלי של קרום פלזמה. אקסוציטוזה מתחם תועד בשני תאים האנדוקרינית אקסוקרינית3,4,5,6,7,8,9, וכן תאים חיסוניים. תאים חיסוניים, כגון אאוזינופילים10,11,12 ו נויטרופילים13, מתחם אקסוציטוזה מאפשר שחרור מהיר וחזק של המגשרים הדרושים כדי להרוג פתוגנים פולשים כגון חיידקים או טפילים. תאי פיטום (MCs) לפרוס אקסוציטוזה המורכבת לשחרור יעיל של מתווכים דלקתיים מראש מאוחסנות במהלך תגובות מערכת החיסון המולדת, אנפילקסיס ו אחרים14,15,של תגובות אלרגיות16 , 17. מאז מצבים שונים של אקסוציטוזה עלולה להתרחש בו זמנית18,19, זה הפך להיות אתגר כדי להבחין בין אותם בזמן אמת או כדי לזהות שלהם machineries פיוז’ן בהתאמה, ומכאן שחקרתי מנגנונים הבסיסית שלהם.

כאן אנו מציגים שיטה, המבוסס על תאים חיים הדמיה של התא טעון FITC-לתוספי, המאפשר מעקב בזמן אמת של אירועים exocytic, הבחנה בין מצבים שונים שלהם. בפרט, השיטה שלנו מאפשר ניטור בלעדית של תרכובת אקסוציטוזה.

FITC-לתוספי הוא המספר המשלים של fluorophore pH רגיש FITC עם לתוספי רב-סוכר גלוקן. Dextrans fluorescently שכותרתו הוכחו הזן את התא על-ידי micropinocytosis20,21 ו- macropinocytosis22,23. כמו תאים endocytic בוגר לתוך lysosomes, הוכח כי FITC-לתוספי שמצטבר ליזוזום עם אין השפלה נראית לעין. עם זאת, כיוון FITC הוא מאוד רגיש pH fluorophore בגודל24, ליזוזום לומן הוא חומצי, זריחה FITC-לתוספי המרווה בהגיעם ליזוזום24. לכן, הקמת dextrans כמו ליזוזום ממוקד מטענים, ויחד עם הרגישות pH של FITC, הניחו את היסודות עבור השימוש FITC-לתוספי במחקרים ליזוזום אקסוציטוזה25,26,27 , 28 , 29.

מספר סוגי תאים, כולל MCs, נויטרופילים, אאוזינופילים, T ציטוטוקסיים, melanosomes ואחרים, SGs להציג תכונות lysosomal, מסווגים הקשורים ליזוזום organelles (LROs) או הפרשה lysosomes30,31 . מכיוון LROs יש על pH חומצי luminal, FITC-לתוספי ניתן להמחיש אקסוציטוזה שלהם, כתוצאה pH גבוה יותר המשויכים את כיציאה מתוך הגוף של LROs. אכן, נעשה שימוש FITC-לתוספי לפקח אקסוציטוזה ב MCs-18,32,33. בשיטה זו, FITC-לתוספי נוספו התרבות תאים, שימולא על ידי התאים פינוציטוזה, מתמיינים של SGs. כמו בגן lysosomes, זריחה FITC הוא מתרצה ב SGs כאשר הם בתוך התא. עם זאת, על ס ג פיוז’ן עם קרום פלזמה, חשיפה הסוגר חצרו החיצונית, FITC-לתוספי חוזר שלה פלורסצנטיות כמו עלייתו של ה-pH של ס ג, ומאפשר את מעקב פשוט של exocytic אירועים על ידי מיקרוסקופ תא חי. כאן, אנחנו מותאם בשיטה זו כדי לאפשר מעקב ייחודי של תרכובת אקסוציטוזה.

שתי שיטות נוספות שימשו בעבר כדי לעקוב אחר אקסוציטוזה מורכבים. מיקרוסקופ אלקטרונים הייתה השיטה הראשונה כדי לאפיין מבני exocytic כי הציע את המופע של מצבים שונים של אקסוציטוזה. בפרט, תצפיות המנהרות”הפרשה” בתאי הלבלב acinar34 , MCs35,36,37 הולידה ההשערה של תרכובת אקסוציטוזה. עם זאת, בעוד הרזולוציה הגבוהה של מיקרוסקופ אלקטרונים יש את הכוח כדי לחשוף את שלפוחית מאוחה, זה לא יכולים לאתר את הדינמיקה של פיוז’ן שלהם, ולכן אינו יכול להגדיר אם הם תואמים SG פיוז’ן במהלך אקסוציטוזה תרכובת או פיוז’ן של גרגרי כבש מחדש בעקבות אנדוציטוזה שלהם. זה מכשול בשיטות אחרות שיכול למדוד אקסוציטוזה בתאים חיים, כגון תיקון המידות קלאמפ של קרום פלזמה קיבוליות11,13,38,39 או amperometry 40 של המדיה. עם זאת, תיקון מחבר חובק למעקה דורש מלכודת מיוחדת, לא יכול להיות מתאים לכל סוגי תאים. מדידות Amperometry מסוגלים לעקוב אחר אקסוציטוזה רק אם המטען הוא שוחרר במרחק מאוד קרוב אל האלקטרודה. לכן, באמצעות הדמיה תא חי מציע יתרון על פני שיטות אלה, זה לא רק מאפשר מעקב בזמן אמת אחר אקסוציטוזה, אבל זה גם מאפשר רכישה מהירה ופשוטה של נתונים כל התא.

המעקב של FITC-לתוספי על ידי מיקרוסקופ תא חי מציע גם כמה יתרונות אחרים תא חי שיטות דימות מבוססות. לדוגמה, השיטה הנפוצה היא גמורה פלורסצנטיות מיקרוסקופ (TIRFM) של תאים נטען עם מכשיר בדיקה SG פלורסנט או ביטוי של פלורסנט מתויג חלבון SG מטען או קרום חלבון26,41, 42 , 43. כוחו של שיטה זו נעוץ יכולתה לפקח באופן בלעדי האירועים המתרחשים בקרבת קרום פלזמה (המכונה בזאת טביעת רגל), ומכאן exocytic אירועים. עם זאת, זהו גם החיסרון של שיטה זו כי רק השבר תאים סמוכים coverglass, קרוב המיקרוסקופ יכול להיות עם תמונה44. אם טביעות הרגל כזה אכן מייצגים על פני קרום התא כולו נמצא עדיין שנוי במחלוקת45,46,47. בהקשר זה, באמצעות צבע רגיש pH כמו FITC-לתוספי, מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה או מיקרוסקופ קונפוקלי עם חריר פתוח מאפשר הדמיה של התא כולו, וכך לתפוס את האירועים exocytic הכולל המתרחשים בתא.

כתבים pH רגישים נוספים המשמשים ללמוד אקסוציטוזה מוסדר על ידי הדמיה התא כולו או TIRFM כוללות SG מטען או חלבון ממברנלי SG דבוקה phlourin, pH רגיש GFP משתנה. דוגמאות כוללות NPY – phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin synapto-phluorin48,49,50,51,52. בעוד הביטוי של הגששים אלה עשוי לייצג באופן הדוק יותר ההרכב אנדוגני של SGs, זה כרוך תרביות תאים של תאי, וייתכן ולכן פחות מתאים תאים שקשה transfect. לכן, כאשר הלומדים תאים זה קשים transfect או בתנאים ניסיוני הדורשים מספר מניפולציות גנומית, השימוש של מתחם זה ניתן להשלים פשוט לתוך התרבות התא האמצעי, כגון FITC-לתוספי, יש יתרון . FITC-לתוספי מציע גם יתרון על פני acridine כתום (AO), צבע pH רגיש אחר שבו נעשה שימוש עבור המעקב של אקסוציטוזה מאת חיים התא מיקרוסקופ53,54,55,56 , 57 , 58. אאו הוכח לגרום פוטוליזה של שלפוחית שבו התוצאה הבזקים כוזבים, אשר מתאימה ההפרשה בפועל מעבדת27. לעומת זאת, FITC-לתוספי משקף אירועים הפרשת יותר, כנראה בגלל הייצור הנוצרות על-ידי צילום נמוכה של חמצן תגובתי27.

ראוי לציין, גישה חלופית ללמוד אקסוציטוזה זה לאתר זרם של צבע, של המדיום חיצוניים לתוך ס ג דרך הנקבובית פיוז’ן שנפתח במהלך תהליך זה. במקרה זה, לצבוע מתווסף המדיום חיצוני לצד ההדק הפרשה. לאחר מכן, עם פתיחת הנקבובית פיוז’ן, לצבוע מפזרת לתוך ה59,ג60. יתרון ברור של שיטה זו הוא כי הוא מציע גם את היכולת לאמוד את גודל הנקבוביות פיוז’ן, על ידי שימוש צבעים בגודל משתנה. לדוגמה, ניתן להשתמש dextrans של משקל מולקולרי שונה (MW), מצומדת כדי fluorophores שונים, כמו צבעי חוץ-תאית, לפיה הגודל המרבי של לתוספי שיכולים לחדור את ס ג להתאים לגודל של פיוז’ן נקבובית59, 61 , 62 , 63 , 64. בנוסף, גישה זו אינה דורשת שימוש בדיקה pH-רגיש. עם זאת, חיסרון משמעותי הוא האות לרעש יחס הוא נמוך מאוד, שכן כמות גדולה של צבע קיים בתקשורת במהלך רכישת תמונות, וכתוצאה מכך רקע.

בסך הכל, השימוש של FITC-לתוספי סמן אקסוציטוזה מתגבר על מספר חסרונות בשיטות שדווחה בעבר, כגון אות לרעש יחס, רעילות, מעקב דינמי ומורכבות.

כאן נתאר את השימוש FITC-לתוספי לפקח אקסוציטוזה מתחם בקו 3 תא פיטום RBL – 2H (בזאת המכונה RBL, בעיקר שקבע אקלסטון. et al. 65 ו לשכפל עוד יותר על-ידי. Barsumian et al. 66), בתגובה אימונוגלובולין E (IgE) / הפעלה אנטיגן (Ag).

Protocol

1. תכשירים הכנת RBL תרבות המדיה מיקס 500 מ של סוכרים נמוכה Dulbecco של ששינה בינוני הנשר (DMEM) עם 56 מ של סרום שור עוברית (FBS), 5.5 mL של פניצילין-סטרפטומיצין-ניסטטין פתרון, מ 5.5 לגלוטמין 200 מ מ פתרון. התוצאה גלוקוז נמוך DMEM בתוספת 10% FBS, סטרפטומיצין µg 100/mL, 100 יחידות/mL פניצילין, 12 יחידות/mL ניסטטין ו- 2 מ ?…

Representative Results

איור 1a מייצג סכמטי איך FITC-לתוספי עשוי לפעול בתור עיתונאי מוסדר אקסוציטוזה וזה מסכם את הדברים על מצבים שונים של אירועים exocytic. ראשית, תאים מודגרת עם FITC-לתוספי, אשר על ידי פינוציטוזה, ממוין to SGs. מאז SGs של MCs הם LROs, pH נמוך שלהם dampens על ידי קרינה פלואורסצנטית של FITC, …

Discussion

כאן נתאר איך איתור זריחה של FITC-לתוספי נטען לתוך SGs ניתן ללכוד במיוחד אקסוציטוזה מתחם אירועים. זה הושג על ידי הגדרת המיקרוסקופ לרכוש תמונה כל 15 שניות, ובכך להבטיח כי רק לטווח ארוך אירועים יתועדו לאורך זמן ולכן למעט אירועים קצרה שיתאימו באופן מלא אקסוציטוזה או נשיקה-וברח אקסוציטוזה. כדי ליצו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים Ashery U. ד ר על מתנה נדיבה של cDNA. אנו מודים ד”ר ג מסה, ל’ וקולאז’ים, מ’ שהרבני ו Y.Zilberstein ממלון הסלולר סקלר & מרכז הדמיה מולקולרית על שלהם בפז סיוע עם מיקרוסקופ. העבודה הזאת נתמכה על ידי ארצות הברית-לאומית הקרן הלאומית למדע (גרנט 2013263 ר שגיא-אייזנברג, אני Hammel של S.J.Galli), מענק 933/15 של הקרן הלאומית למדע, שנוסדה על ידי ישראל האקדמיה למדעים (כדי R.Sagi-אייזנברג ) ומענקים NIH U19 AI 104209 ו- AR067145 R01 (כדי סניף Galli).

Materials

DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

References

  1. Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils – compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, &. #. 2. 1. 4. ;. A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -. O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta – Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -. Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

Play Video

Cite This Article
Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

View Video