הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

Summary

כאן אנחנו פירוט שיטת הדמיה תא בשידור חי של אקסוציטוזה מוסדר. שיטה זו משתמשת FITC-לתוספי, אשר צוברת ב הקשורות ליזוזום organelles, בתור כתב. שיטה פשוטה זו מאפשרת גם הבחנה בין מצבים שונים של אקסוציטוזה מווסתת בתאים קשה לתמרן גנטית.

Abstract

אקסוציטוזה מוסדר הוא תהליך שבאמצעותו מטענים, אשר מאוחסן בגרגרים הפרשה (SGs), משוחרר בתגובה גורם הפרשה. אקסוציטוזה מוסדר הוא היסוד לתקשורת המערכת והוא מפתח מנגנון הפרשת נוירוטרנסמיטרים, הורמונים, מתווכים דלקתיים, תרכובות אחרות, על ידי מגוון רחב של תאים. לפחות שלושה מנגנונים נפרדים ידועים אקסוציטוזה מוסדר: אקסוציטוזה מלא, איפה SG יחיד מלא ולספות עם קרום פלזמה, נשיקה-וברח אקסוציטוזה, איפה SG יחיד פתילים transiently עם קרום פלזמה, ומתחם אקסוציטוזה, איפה SGs מספר נתיך אחד עם השני, לפני או אחרי ס ג פיוז’ן עם קרום פלזמה. סוג מוסדר אקסוציטוזה שנערך על ידי תא מוכתב לעתים קרובות על ידי הסוג של גירוי הפרשה. עם זאת, תאים רבים, בגורם מפעיל הפרשה יחיד ניתן להפעיל מספר מצבי של אקסוציטוזה מוסדרים בו זמנית. למרות שפע שלהם ואת חשיבות על פני התא סוגים ומינים, המנגנונים הקובעות את מצבים שונים של הפרשת הן במידה רבה בלתי פתורות. אחד האתגרים העיקריים בחקירת על מצבים שונים של אקסוציטוזה מוסדר, הוא הקושי הבחנה ביניהם, כמו גם לחקור אותם בנפרד. כאן נתאר את השימוש fluorescein isothiocyanate (FITC)-לתוספי אקסוציטוזה הכתב, וכן תא חי הדמיה, כדי להבדיל בין המסלולים השונים של אקסוציטוזה מוסדר, התמקדות אקסוציטוזה מורכבים, בהתבסס על החוסן, משך הזמן של אירועים exocytic.

Introduction

אקסוציטוזה מוסדר הוא המנגנון העיקרי שבאמצעותו מטענים בקלות עשה הוא שוחרר מן תא הפרשה בתגובה גורם ספציפי. המטען מראש נוצר, מבודדות לתוך שלפוחית הפרשה, שבו הוא מאוחסן עד טריגר ממסרים האות לשחרור של התוכן של SGs. סוגים שונים של אותות עלולה לגרום מצבים שונים של אקסוציטוזה מוסדר, או מצבים שונים של אקסוציטוזה מוסדר עלולה להתרחש בו זמנית. שלושה מצבים עיקריים של אקסוציטוזה מוסדר ידועים: אקסוציטוזה מלאה, הכוללת פיוז’ן מלא של גרגר הפרשה יחיד עם קרום פלזמה; נשיקה-וברח אקסוציטוזה, שכרוך ארעי הפיוז’ן גרגר הפרשה עם קרום פלזמה ואחריו שלה מיחזור; ו אקסוציטוזה מורכבות, אשר מאופיין על ידי homotypic פיוז’ן של מספר לפני SGs (קרי, אקסוציטוזה multigranular) או רציף (קרי, אקסוציטוזה רציפים) כדי פיוז’ן עם קרום פלזמה¹. אקסוציטוזה מתחם נחשב מצב הנרחב ביותר של מטען מהדורה², כמו זה מאפשר הפרשה מהירה של מטענים, כולל זה של SGs הממוקמים דיסטלי של קרום פלזמה. אקסוציטוזה מתחם תועד בשני תאים האנדוקרינית אקסוקרינית^{3,4,5,6,7,8,9}, וכן תאים חיסוניים. תאים חיסוניים, כגון אאוזינופילים^10,11,12 ו נויטרופילים¹³, מתחם אקסוציטוזה מאפשר שחרור מהיר וחזק של המגשרים הדרושים כדי להרוג פתוגנים פולשים כגון חיידקים או טפילים. תאי פיטום (MCs) לפרוס אקסוציטוזה המורכבת לשחרור יעיל של מתווכים דלקתיים מראש מאוחסנות במהלך תגובות מערכת החיסון המולדת, אנפילקסיס ו אחרים^14,15,של תגובות אלרגיות^{16 , 17}. מאז מצבים שונים של אקסוציטוזה עלולה להתרחש בו זמנית^18,19, זה הפך להיות אתגר כדי להבחין בין אותם בזמן אמת או כדי לזהות שלהם machineries פיוז’ן בהתאמה, ומכאן שחקרתי מנגנונים הבסיסית שלהם.

כאן אנו מציגים שיטה, המבוסס על תאים חיים הדמיה של התא טעון FITC-לתוספי, המאפשר מעקב בזמן אמת של אירועים exocytic, הבחנה בין מצבים שונים שלהם. בפרט, השיטה שלנו מאפשר ניטור בלעדית של תרכובת אקסוציטוזה.

FITC-לתוספי הוא המספר המשלים של fluorophore pH רגיש FITC עם לתוספי רב-סוכר גלוקן. Dextrans fluorescently שכותרתו הוכחו הזן את התא על-ידי micropinocytosis^20,21 ו- macropinocytosis^22,23. כמו תאים endocytic בוגר לתוך lysosomes, הוכח כי FITC-לתוספי שמצטבר ליזוזום עם אין השפלה נראית לעין. עם זאת, כיוון FITC הוא מאוד רגיש pH fluorophore בגודל²⁴, ליזוזום לומן הוא חומצי, זריחה FITC-לתוספי המרווה בהגיעם ליזוזום²⁴. לכן, הקמת dextrans כמו ליזוזום ממוקד מטענים, ויחד עם הרגישות pH של FITC, הניחו את היסודות עבור השימוש FITC-לתוספי במחקרים ליזוזום אקסוציטוזה^{25,26,27 , 28 , 29}.

מספר סוגי תאים, כולל MCs, נויטרופילים, אאוזינופילים, T ציטוטוקסיים, melanosomes ואחרים, SGs להציג תכונות lysosomal, מסווגים הקשורים ליזוזום organelles (LROs) או הפרשה lysosomes^30,31 . מכיוון LROs יש על pH חומצי luminal, FITC-לתוספי ניתן להמחיש אקסוציטוזה שלהם, כתוצאה pH גבוה יותר המשויכים את כיציאה מתוך הגוף של LROs. אכן, נעשה שימוש FITC-לתוספי לפקח אקסוציטוזה ב MCs-^18,–^32,–³³. בשיטה זו, FITC-לתוספי נוספו התרבות תאים, שימולא על ידי התאים פינוציטוזה, מתמיינים של SGs. כמו בגן lysosomes, זריחה FITC הוא מתרצה ב SGs כאשר הם בתוך התא. עם זאת, על ס ג פיוז’ן עם קרום פלזמה, חשיפה הסוגר חצרו החיצונית, FITC-לתוספי חוזר שלה פלורסצנטיות כמו עלייתו של ה-pH של ס ג, ומאפשר את מעקב פשוט של exocytic אירועים על ידי מיקרוסקופ תא חי. כאן, אנחנו מותאם בשיטה זו כדי לאפשר מעקב ייחודי של תרכובת אקסוציטוזה.

שתי שיטות נוספות שימשו בעבר כדי לעקוב אחר אקסוציטוזה מורכבים. מיקרוסקופ אלקטרונים הייתה השיטה הראשונה כדי לאפיין מבני exocytic כי הציע את המופע של מצבים שונים של אקסוציטוזה. בפרט, תצפיות המנהרות”הפרשה” בתאי הלבלב acinar³⁴ , MCs^35,36,37 הולידה ההשערה של תרכובת אקסוציטוזה. עם זאת, בעוד הרזולוציה הגבוהה של מיקרוסקופ אלקטרונים יש את הכוח כדי לחשוף את שלפוחית מאוחה, זה לא יכולים לאתר את הדינמיקה של פיוז’ן שלהם, ולכן אינו יכול להגדיר אם הם תואמים SG פיוז’ן במהלך אקסוציטוזה תרכובת או פיוז’ן של גרגרי כבש מחדש בעקבות אנדוציטוזה שלהם. זה מכשול בשיטות אחרות שיכול למדוד אקסוציטוזה בתאים חיים, כגון תיקון המידות קלאמפ של קרום פלזמה קיבוליות^11,13,38,39 או amperometry ⁴⁰ של המדיה. עם זאת, תיקון מחבר חובק למעקה דורש מלכודת מיוחדת, לא יכול להיות מתאים לכל סוגי תאים. מדידות Amperometry מסוגלים לעקוב אחר אקסוציטוזה רק אם המטען הוא שוחרר במרחק מאוד קרוב אל האלקטרודה. לכן, באמצעות הדמיה תא חי מציע יתרון על פני שיטות אלה, זה לא רק מאפשר מעקב בזמן אמת אחר אקסוציטוזה, אבל זה גם מאפשר רכישה מהירה ופשוטה של נתונים כל התא.

המעקב של FITC-לתוספי על ידי מיקרוסקופ תא חי מציע גם כמה יתרונות אחרים תא חי שיטות דימות מבוססות. לדוגמה, השיטה הנפוצה היא גמורה פלורסצנטיות מיקרוסקופ (TIRFM) של תאים נטען עם מכשיר בדיקה SG פלורסנט או ביטוי של פלורסנט מתויג חלבון SG מטען או קרום חלבון^{26,41, 42 , 43}. כוחו של שיטה זו נעוץ יכולתה לפקח באופן בלעדי האירועים המתרחשים בקרבת קרום פלזמה (המכונה בזאת טביעת רגל), ומכאן exocytic אירועים. עם זאת, זהו גם החיסרון של שיטה זו כי רק השבר תאים סמוכים coverglass, קרוב המיקרוסקופ יכול להיות עם תמונה⁴⁴. אם טביעות הרגל כזה אכן מייצגים על פני קרום התא כולו נמצא עדיין שנוי במחלוקת^45,46,47. בהקשר זה, באמצעות צבע רגיש pH כמו FITC-לתוספי, מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה או מיקרוסקופ קונפוקלי עם חריר פתוח מאפשר הדמיה של התא כולו, וכך לתפוס את האירועים exocytic הכולל המתרחשים בתא.

כתבים pH רגישים נוספים המשמשים ללמוד אקסוציטוזה מוסדר על ידי הדמיה התא כולו או TIRFM כוללות SG מטען או חלבון ממברנלי SG דבוקה phlourin, pH רגיש GFP משתנה. דוגמאות כוללות NPY – phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin synapto-phluorin^{48,49,50,51,52}. בעוד הביטוי של הגששים אלה עשוי לייצג באופן הדוק יותר ההרכב אנדוגני של SGs, זה כרוך תרביות תאים של תאי, וייתכן ולכן פחות מתאים תאים שקשה transfect. לכן, כאשר הלומדים תאים זה קשים transfect או בתנאים ניסיוני הדורשים מספר מניפולציות גנומית, השימוש של מתחם זה ניתן להשלים פשוט לתוך התרבות התא האמצעי, כגון FITC-לתוספי, יש יתרון . FITC-לתוספי מציע גם יתרון על פני acridine כתום (AO), צבע pH רגיש אחר שבו נעשה שימוש עבור המעקב של אקסוציטוזה מאת חיים התא מיקרוסקופ^{53,54,55,56 , 57 , 58}. אאו הוכח לגרום פוטוליזה של שלפוחית שבו התוצאה הבזקים כוזבים, אשר מתאימה ההפרשה בפועל מעבדת²⁷. לעומת זאת, FITC-לתוספי משקף אירועים הפרשת יותר, כנראה בגלל הייצור הנוצרות על-ידי צילום נמוכה של חמצן תגובתי²⁷.

ראוי לציין, גישה חלופית ללמוד אקסוציטוזה זה לאתר זרם של צבע, של המדיום חיצוניים לתוך ס ג דרך הנקבובית פיוז’ן שנפתח במהלך תהליך זה. במקרה זה, לצבוע מתווסף המדיום חיצוני לצד ההדק הפרשה. לאחר מכן, עם פתיחת הנקבובית פיוז’ן, לצבוע מפזרת לתוך ה^59,ג⁶⁰. יתרון ברור של שיטה זו הוא כי הוא מציע גם את היכולת לאמוד את גודל הנקבוביות פיוז’ן, על ידי שימוש צבעים בגודל משתנה. לדוגמה, ניתן להשתמש dextrans של משקל מולקולרי שונה (MW), מצומדת כדי fluorophores שונים, כמו צבעי חוץ-תאית, לפיה הגודל המרבי של לתוספי שיכולים לחדור את ס ג להתאים לגודל של פיוז’ן נקבובית^{59, 61 , 62 , 63 , 64}. בנוסף, גישה זו אינה דורשת שימוש בדיקה pH-רגיש. עם זאת, חיסרון משמעותי הוא האות לרעש יחס הוא נמוך מאוד, שכן כמות גדולה של צבע קיים בתקשורת במהלך רכישת תמונות, וכתוצאה מכך רקע.

בסך הכל, השימוש של FITC-לתוספי סמן אקסוציטוזה מתגבר על מספר חסרונות בשיטות שדווחה בעבר, כגון אות לרעש יחס, רעילות, מעקב דינמי ומורכבות.

כאן נתאר את השימוש FITC-לתוספי לפקח אקסוציטוזה מתחם בקו 3 תא פיטום RBL – 2H (בזאת המכונה RBL, בעיקר שקבע אקלסטון. et al. ⁶⁵ ו לשכפל עוד יותר על-ידי. Barsumian et al. ⁶⁶), בתגובה אימונוגלובולין E (IgE) / הפעלה אנטיגן (Ag).

Protocol

1. תכשירים הכנת RBL תרבות המדיה מיקס 500 מ של סוכרים נמוכה Dulbecco של ששינה בינוני הנשר (DMEM) עם 56 מ של סרום שור עוברית (FBS), 5.5 mL של פניצילין-סטרפטומיצין-ניסטטין פתרון, מ 5.5 לגלוטמין 200 מ מ פתרון. התוצאה גלוקוז נמוך DMEM בתוספת 10% FBS, סטרפטומיצין µg 100/mL, 100 יחידות/mL פניצילין, 12 יחידות/mL ניסטטין ו- 2 מ ?…

Representative Results

איור 1a מייצג סכמטי איך FITC-לתוספי עשוי לפעול בתור עיתונאי מוסדר אקסוציטוזה וזה מסכם את הדברים על מצבים שונים של אירועים exocytic. ראשית, תאים מודגרת עם FITC-לתוספי, אשר על ידי פינוציטוזה, ממוין to SGs. מאז SGs של MCs הם LROs, pH נמוך שלהם dampens על ידי קרינה פלואורסצנטית של FITC, …

Discussion

כאן נתאר איך איתור זריחה של FITC-לתוספי נטען לתוך SGs ניתן ללכוד במיוחד אקסוציטוזה מתחם אירועים. זה הושג על ידי הגדרת המיקרוסקופ לרכוש תמונה כל 15 שניות, ובכך להבטיח כי רק לטווח ארוך אירועים יתועדו לאורך זמן ולכן למעט אירועים קצרה שיתאימו באופן מלא אקסוציטוזה או נשיקה-וברח אקסוציטוזה. כדי ליצו?…

Materials

DMEM low glucose	Biological Inductries	01-050-1A
Fetal bovine serum	Gibco	12657
Pen-strep-nystatin solution	Biological Inductries	03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution	Biological Inductries	03-020-1A
FITC dextran 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B	Biological Inductries	03-052-1A	Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size	Sartorius	16534K
Chambered coverglass	Thermo scientific	155411
Corning tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4	Biological Inductries	03-025-1B
CaCl2	MERK	102382
Glucose	BDH Laboratories	284515V
Ammonium chloride	MERK	1145
PIPES dipotassium salt	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calcium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	MERK	6346
NaCl	MERK	106404
MgCl2	MERK	105833
KCl	MERK	104936
Electroporator	BTX	ECM830
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator
Confocal microscope, Leica	Leica	SP5	Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells			RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67