Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

Hier detail we een methode om levende cellen beeldvorming van gereglementeerde exocytose. Deze methode maakt gebruik van FITC-dextran, die hoopt zich op in lysosoom-gerelateerde organellen, als verslaggever. Deze eenvoudige methode kan ook onderscheid te maken tussen de verschillende modi van gereglementeerde exocytose in cellen die moeilijk zijn te genetisch manipuleren.

Abstract

Gereglementeerde exocytose is een proces dat door die lading, die is opgeslagen in secretoire korrels (SGs), is uitgebracht in reactie op een secretoire trigger. Gereglementeerde exocytose is van fundamenteel belang voor de intercellulaire communicatie en is een belangrijk mechanisme voor de secretie van neurotransmitters, hormonen, inflammatoire mediatoren en andere verbindingen, door een aantal cellen. Ten minste drie verschillende mechanismen staan bekend om gereglementeerde exocytose: volledige exocytose, waar een enkele SG volledig met het plasma-membraan, kus-en-run exocytose versmelt, waar een enkele SG Transient met het plasma-membraan combineert, en samengestelde exocytose, waar verschillende SGs zekering met elkaar, vóór of na SG fusion met het plasma-membraan. Het soort gereglementeerde exocytose ondernomen door een cel wordt vaak bepaald door het soort secretoire trigger. Echter in veel cellen, kunt één secretoire trigger activeren meerdere modi van gereglementeerde exocytose gelijktijdig. Ondanks hun overvloed en belang in de celtypen en soorten zijn de mechanismen die bepalend zijn voor de verschillende vervoerstakken secretie grotendeels onbekend. Een van de belangrijkste uitdagingen bij het onderzoeken van de verschillende modi van gereglementeerde exocytose, is het moeilijk onderscheid te maken tussen hen, evenals het verkennen van hen afzonderlijk. Hier beschrijven we het gebruik van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran als exocytose verslaggever en levende cel imaging, om te differentiëren tussen de verschillende trajecten van gereglementeerde exocytose, gericht op samengestelde exocytose, op basis van de robuustheid en duur van de exocytic gebeurtenissen.

Introduction

Gereglementeerde exocytose is het primaire mechanisme waarmee gemakkelijk gemaakt lading wordt vrijgelaten uit een secretoire cel in antwoord op een specifieke trigger. De lading is pre gevormd en afgezonderd in secretoire blaasjes, waarin het is opgeslagen totdat een trigger Relais het signaal voor de vrijlating van de SGs inhoud. Verschillende soorten signalen kunnen resulteren in verschillende modi van gereglementeerde exocytose of verschillende modi van gereglementeerde exocytose tegelijkertijd kunnen optreden. Drie belangrijkste wijzen van gereglementeerde exocytose zijn bekend: volledige exocytose, waarbij volledige fusie van een enkele secretoire submodule met het plasmamembraan; kus-en-run exocytose, waarbij voorbijgaande fusie voor de secretoire granule met het plasma-membraan gevolgd door haar recycling; en samengestelde exocytose, die wordt gekenmerkt door homotypic fusie van verschillende SGs prior (dat wil zeggen, multigranular exocytose) of na elkaar (dat wil zeggen, sequentiële exocytose) tot fusie met het plasmamembraan1. Samengestelde exocytose wordt beschouwd als de meest uitgebreide modus van lading release2, omdat het zorgt voor de snelle afscheiding van vracht, met inbegrip van die van SGs die zich bevinden distale uit het plasma-membraan. Samengestelde exocytose is gedocumenteerd in beide exocrine en endocriene cellen3,4,5,6,7,8,9, evenals in immuuncellen. Samengestelde exocytose kunt immune cellen, zoals eosinofielen10,11,12 en neutrofielen13, de snelle en robuuste versie van bemiddelaars die nodig zijn voor het doden van invasie ziekteverwekkers zoals bacteriën of parasieten. Mastcellen (MCs) implementeren samengestelde exocytose voor de efficiënte introductie van vooraf opgeslagen inflammatoire mediatoren tijdens aangeboren immuunresponsen, anafylaxie en andere allergische reacties14,15,16 , 17. aangezien de verschillende modi van exocytose gelijktijdig18,19 treedt, is het een uitdaging onderscheid maken tussen hen in real-time of identificeren van hun respectieve fusion machineries, vandaar ophelderen geworden hun onderliggende mechanismen.

Hier presenteren we een methode, gebaseerd op de levende cel beeldvorming van cel geladen FITC-dextran, waarmee real-time tracking van exocytic evenementen en onderscheid te maken tussen hun verschillende modi. Onze werkwijze zorgt voor met name de exclusieve opvolging van samengestelde exocytose.

FITC-dextran is een geconjugeerde van de pH-gevoelige fluorophore FITC met de glucan polysaccharide dextran. Fluorescently geëtiketteerde dextrans hebben aangetoond dat de cel invoeren door micropinocytosis20,21 en macropinocytosis22,23. Naarmate endocytotische compartimenten in de lysosomen rijpen, is gebleken dat de FITC-dextran in het lysosoom met geen zichtbare aantasting accumuleert. Echter, aangezien FITC een zeer pH-gevoelige fluorophore24 is, en het lysosoom lumen zuur is, Lest FITC-dextran fluorescentie bij het bereiken van het lysosoom24. Dus, tot vaststelling van dextrans als lysosoom lading, samen met de gevoeligheid van de pH van FITC gericht, hebben de basis gelegd voor het gebruik van FITC-dextran in studies van lysosoom exocytose25,26,27 , 28 , 29.

In verschillende celtypen, met inbegrip van MCs, neutrofielen eosinofielen, cytotoxische T-cellen, melanosomes en anderen, de SGs lysosomale functies weergegeven en zijn geclassificeerd als lysosoom-gerelateerde organellen (LROs) of secretoire lysosomen30,31 . Aangezien LROs een zure luminal pH hebben, kan FITC-dextran worden gebruikt om te visualiseren van hun exocytose, als gevolg van hogere pH die is gekoppeld aan de exteriorization van de LROs. Inderdaad, FITC-dextran is gebruikt om te controleren van exocytose in MCs18,32,33. Bij deze methode is FITC-dextran toegevoegd aan de celcultuur, in beslag genomen door de cellen door Pinocytose en gesorteerd in de SGs. Aangezien er in de lysosomen, is FITC fluorescentie uitgeblust in de SGs wanneer zij binnen de cel. Echter bij SG fusion met het plasmamembraan en daaruit voortvloeiende blootstelling aan de externe omgeving herwint de FITC-dextran zijn fluorescentie als de SG pH stijgt, waardoor het eenvoudig volgen van exocytic evenementen door levende cel microscopie. Hier, we deze methode zodat unieke tracking van samengestelde exocytose aangepast.

Twee andere methoden hebben eerder is gebruikt voor het bijhouden van samengestelde exocytose. Elektronenmicroscopie was de eerste methode te karakteriseren exocytic structuren die het vóórkomen van de verschillende vervoerswijzen exocytose voorgesteld. Met name gaf opmerkingen van "secretoire tunnels" in de alvleesklier acinaire cellen34 en MCs35,36,,37 aanleiding tot de hypothese van samengestelde exocytose. Maar terwijl de hoge resolutie van elektronenmicroscopie bevoegd is om te onthullen gesmolten blaasjes, kan de dynamiek van hun fusie niet bijhouden en dus geen definiëren of ze overeenkomen met SG fusion tijdens samengestelde exocytose of fusie van heroverde korrels na hun endocytose. Dit obstakel overwonnen in andere methoden die exocytose in levende cellen, zoals patch klem metingen van het plasmamembraan capaciteit11,13,38,39 of amperometry meten kunnen 40 van de media. Echter patch klemmen vereist een speciale set-up en mogelijk niet geschikt voor alle celtypes. Amperometry metingen kunnen bijhouden van exocytose alleen als de lading in zeer dicht bij de elektrode wordt vrijgegeven. Dus, met behulp van levende cellen imaging biedt een voordeel ten opzichte van deze methoden, zoals het niet alleen voor real-time tracking van exocytose staat, maar het biedt ook snelle en eenvoudige overname van gegevens uit de hele cel.

Het volgen van FITC-dextran door levende cel microscopie biedt ook enkele voordelen naar andere levende cel imaging gebaseerde methoden. Bijvoorbeeld, is een veel gebruikte methode totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) van cellen met een fluorescente sonde SG geladen of uiting van een fluorescente proteïne-gelabeld SG vracht of membraan eiwit26,41, 42 , 43. de kracht van deze methode ligt in zijn vermogen om uitsluitend gebeurtenissen die zich voordoen vlak bij het plasma-membraan (hierna te noemen voetafdruk), te controleren dus exocytic gebeurtenissen. Dit is echter ook het nadeel van deze methode omdat slechts in het geval van de cel-fractie dat grenst aan het dekglaasje en dicht bij de lens Microscoop kan worden beeld44. Of dergelijke voetafdrukken inderdaad het gehele celmembraan oppervlak vertegenwoordigen is nog betwistbaar45,46,47. In dit verband kunt met behulp van een pH-gevoelige kleurstof zoals FITC-dextran en een standaard fluorescentie Microscoop of een confocal microscoop met een open pinhole beeldvorming van de hele cel, dus het vastleggen van de totale exocytic-gebeurtenissen die in die cel plaatsvinden.

Extra pH-gevoelige verslaggevers die worden gebruikt voor het bestuderen van gereglementeerde exocytose door hele cel beeldbewerkings- of TIRFM bevatten SG vracht of SG membraan eiwit gesmolten tot phlourin, een pH-gevoelige GFP variant. Voorbeelden zijn NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, en synapto-phluorin48,49,50,51,52. Terwijl uitdrukking van deze sondes de endogene samenstelling van de SGs nauwer vertegenwoordigen kan, het impliceert transfectie van de cellen, en kan dus minder geschikt voor cellen die moeilijk te transfect. Daarom, wanneer bestuderen van cellen die zijn moeilijk te transfect of onder experimentele omstandigheden waarvoor meerdere genomic manipulaties, is het gebruik van een stof die eenvoudig kan worden aangevuld in het kweekmedium cel, zoals FITC-dextran, voordelig . FITC-dextran biedt ook een voordeel ten opzichte van acridine oranje (AO), een andere pH-gevoelige kleurstof die is gebruikt voor het volgen van exocytose door levende cel microscopie53,54,55,56 , 57 , 58. AO is gebleken voor het opwekken van fotolyse van blaasjes dat resultaat in valse flitsen, die niet met werkelijke secretie overeen komen27verwerkt. Daarentegen weerspiegelt de FITC-dextran beter secretie evenementen, waarschijnlijk als gevolg van zijn lage foto-geïnduceerde productie van reactieve zuurstof27.

Met name is een alternatieve benadering voor het bestuderen van exocytose door het bijhouden van de instroom van een kleurstof, uit het externe medium in de SG via de porie van fusie dat wordt tijdens dit proces wordt geopend. In dit geval wordt de kleurstof toegevoegd aan het externe medium naast de secretoire trigger. Vervolgens, wanneer de fusie porie opent, de kleurstof diffundeert in de SG59,60. Een duidelijk voordeel van deze methode is dat het biedt ook de mogelijkheid om het inschatten van de fusion porie maat, door het gebruik van kleurstoffen van variabele grootte. Bijvoorbeeld, kunnen dextrans met verschillende molecuulgewicht (MW), geconjugeerd met verschillende fluorophores, worden gebruikt als extracellulaire kleurstoffen waarbij de maximale grootte van Dextraan die de SG doordringen kan zou overeenkomen met de grootte van de fusion porie59, 61 , 62 , 63 , 64. Bovendien deze aanpak vereist niet het gebruik van een pH-gevoelige sonde. Een aanzienlijk nadeel is echter dat de signaal / ruisverhouding zeer laag is, is aangezien een grote hoeveelheid kleurstof aanwezig in de media tijdens de overname van beelden, wat resulteert in hoge achtergrond.

Globaal, het gebruik van FITC-dextran als een marker voor exocytose overwint verschillende nadelen in reeds gerapporteerde methoden, zoals de signaal-ruis verhouding, toxiciteit, dynamische tracering en complexiteit.

Hier beschrijven we het gebruik van FITC-dextran samengestelde exocytose in de RBL - 2H 3 mestcel lijn (hierna te noemen RBL, voornamelijk opgericht door Eccleston et al. volgen 65 en verder door Barsumian et al. gekloond 66), in reactie op immunoglobuline (IgE) / antigeen (Ag) activering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding

  1. Bereiding van de voedingsbodems RBL
    1. Mix 500 mL van lage glucose Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 56 mL foetale runderserum (FBS), 5,5 mL penicilline-streptomycine-nystatine oplossing, 5,5 mL van L-Glutamine 200 mM oplossing. Dit resulteert in lage glucose DMEM aangevuld met 10% FBS, 100 µg/mL streptomycine, 100 eenheden/mL penicilline, 12 eenheden/mL nystatine en 2 mM L-glutamine.
    2. De media filteren met behulp van een top-vacuüm-filter van 0,22 µm poriegrootte en winkel bij 4 ° C.
  2. Onderhoud van RBL cellen.
    1. RBL cellen groeien tot een maximale confluentie van 90% in een 10 cm schotel. Als de celkweek gezond is, moeten de cellen hebben de vorm van een spindel met occasionele uitsteeksels.
    2. Voor cel splitsen, de cellen van de schotel te loskoppelen door aspirating van de media en 2 mL trypsine/EDTA oplossing B. Incubate vervangen voor 5-10 minuten in een bevochtigde sfeer van 5% CO2 bij 37 ° C.
    3. Zodra de cellen hebben losgemaakt, de trypsine te neutraliseren door toevoeging van 2 mL van voedingsbodems, met behulp van een precisiepipet, en splitsen van cellen in een 1:2-1:10 verhouding.
  3. Voorbereiding van 20 x Tyrode de buffer
    1. Een voorraad 20 x 54 mM KCl oplossing, 20 mM MgCl22,74 M NaCl en 8 mM NaH2PO4 in dubbel gedestilleerd water (DDW) voor te bereiden. Meng goed en bewaren bij 4 ° C.

2. cultuur van RBL cellen voor levende cellen microscopie

  1. Bereiding van FITC-dextran oplossing.
    1. Meng 1 mg FITC-dextran poeder (150 K) per 1 mL voedingsbodems (zie stap 1.1.1). Voor een volledige chambered dekglaasje, bereiden 3 mL.
    2. Met behulp van een celluloseacetaat spuit filter eenheid met 0,22 µm poriegrootte, filteren de opgeloste FITC-dextran.
    3. Voeg muis IgE tot een concentratie van 1 µg/mL.
  2. Zaaien van RBL cellen voor imaging
    1. Eergisteren beeldvorming, gecombineerd de media van de cultuur-schotel en 2 mL trypsine/EDTA oplossing B. Incubate vervangen voor 5-10 minuten in een bevochtigde sfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. Zodra de cellen hebben losgemaakt, neutraliseren de trypsine door toevoeging van 2 mL van voedingsbodems.
    2. Graaf RBL cellen met behulp van een hemocytometer en het volume aanpassen met voedingsbodems om een concentratie van de cel van 7,5 x 105/mL.
    3. Voeg toe 10 µL celsuspensie aan een chambered dekglaasje vooraf gevuld met verse FITC-dextran aangevuld voedingsbodems (dit resulteert in het zaaien van 7,5 x 103 cellen in een kamer).
    4. Groeien RBL cellen overnachting in een humified sfeer van 5% CO2 bij 37 ° C. De cellen moeten in een sub confluente niveau blijven om ervoor te zorgen dat de cellen worden gescheiden en dat het gemakkelijk te identificeren van elke cel afzonderlijk onder de Microscoop.
  3. De transfectie van RBL cellen - optioneel.
    1. Zie transfectie protocol voor RBL cellen in Azouz et al. voor imaging exocytic gebeurtenissen in combinatie met andere fluorescently tagged eiwitten, 67

3. levende cel microscopie van exocytose

  1. Bereiding van de oplossingen:
    1. Een definitieve Tyrode bufferoplossing bereid door verdunning van de stockoplossing in DDW in een 1:20 verdunnings- en supplement met 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA en 5,6 mM glucose.
    2. Vers bereiden 20 x secretagogue reagens in de Tyrode van buffer [1 µg/mL dinitrophenyl geconjugeerd met menselijk serum albumine (DNP-heeft (Ag)) in ons geval, voor een concentratie van 50 ng/mL 1 x].
    3. Bereid een 400 mM ammoniumchlorideoplossing door ontbinding poeder in Tyrode de buffer.
  2. Voorbereiding van de cellen.
    1. De chambered dekglaasje 3 keer wassen door aspirating van de media van de kamer en het navullen dankzij 300 µL van Tyrode de buffer, voorverwarmde tot 37 ° C. Tot slot, het vullen van de zaal met 300 µL van Tyrode de buffer, voorverwarmde tot 37 ° C.
    2. Plaats de chambered dekglaasje in van de Microscoop incubator kamer. Zorg ervoor dat de kamer stabiel is.
  3. Instellen van de Microscoop
    1. Om te kiezen een gebied van belang om bij te houden, zet de fluorescerende lichtbron (traditioneel een kwik-lamp) en kies de juiste fluorescentie-filter (het filter voor groene fluorophores voor het bekijken van de FITC-dextran kiezen). Zodra de regio van belang in beeld is en in het midden van het gezichtsveld is, schakelt u de lichtbron ter voorkoming van foto-bleken en toxiciteit.
      Opmerking: Sommige van de FITC-dextran opgenomen in de cellen kan handhaven fluorescentie. Dit is omdat de FITC-dextran kan ook worden gesorteerd naar niet-lysosomale compartimenten zoals Endosomen.
    2. Inschakelen van de juiste verlichting voor excitatie van FITC. Als met behulp van een laser gebaseerde Microscoop, schakelt de 488 nm laser. Emissies moet worden verzameld rond 500-550 nm (FITC emissie pieken bij 510-520 nm).
    3. Wanneer u een confocal microscoop, open het gaatje tot het maximum. Dit zal toestaan met behulp van lagere laser macht om te voorkomen dat bleken en toxiciteit en zorgt voor de inname van exocytose gebeurtenissen uit alle vliegtuigen van de cel.
    4. Kalibreren van het tijdsinterval tussen afbeelding acquisities.
      1. Verschillende cellen kunnen variëren in hun kinetiek van gereglementeerde exocytose68. Voor specifieke beeldvorming van samengestelde exocytose raden wij een tijdsinterval van minstens 5 seconden. Nochtans, als een vuistregel, als u wilt toestaan voor snelle beeldvorming, zorg ervoor dat het tijdstip van de verwerving van een enkel frame snel is.
      2. Bij het gebruik van een laser-scanner confocal microscoop, de richting van de scan instellen met bi-directionele, niet toestaan voor gemiddeld en resolutie ingesteld op 512 x 512 (aanbevolen; de laatste twee bepalingen zal ook helpen om bleken en toxiciteit te minimaliseren).
  4. Beeldvorming van exocytose.
    1. De cellen van de afbeelding voor de gewenste duur, afhankelijk van het type cel of secretagogue. RBL cellen geactiveerd met IgE/Ag, plaatsvinden de meeste exocytic gebeurtenissen binnen 15-20 min van activering.
    2. Voor activering van de cellen, Voeg 16 µL van de 20 x secretagogue oplossing aan de kamer.
  5. Bevestiging van FITC-dextran aanwezigheid in de cellen.
    1. Om te bevestigen de aanwezigheid en de lokalisatie van FITC-dextran naar de SGs, Voeg 16 µL van ammoniumchlorideoplossing (wees niet worden verplaatst van de zaal in om niet te verliezen richten) aan de kamer zachtjes (Hierdoor wordt een eindconcentratie van 20 mM). Dit zal leiden tot alkalization van de SGs en dequenching van FITC fluorescentie, die binnen enkele seconden voordoen zich.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1a vertegenwoordigt schematisch hoe FITC-dextran kan fungeren als een verslaggever voor geregeld exocytose en herhalen van de verschillende modi van exocytic gebeurtenissen. Ten eerste, de cellen worden geïncubeerd met FITC-dextran, die door Pinocytose geïnternaliseerd en gesorteerd naar de SGs. Aangezien de SGs van MCs LROs, hun lage pH dempt de fluorescentie van FITC, hier weergegeven als zwarte korrels (A-C, ik). Wanneer cellen worden getriggerd door een secretagogue en de zekering van de SGs met het plasma-membraan, wordt een fusion porie gevormd, waardoor efflux van protonen en alkalization van de SGs. Dientengevolge, herwint FITC zijn fluorescentie (A, II). Volledige exocytose zal manifesteren in een korte (minder dan 5 s) TL gebeurtenis zoals de exteriorized SG membraan volledig in het plasmamembraan en de FITC-dextran stort diffundeert weg in het kweekmedium (A, III). Tijdens een evenement kus-en-run exocytic van de SG membraan alleen Transient combineert met het plasma-membraan, resulterend in een kortstondige fusion porie en daarom alleen een korte uitbarsting van fluorescentie als de SG snel los en haar lumen verzuurt snel opnieuw (B, III - IV). Tot slot, tijdens de samengestelde exocytose, een reeks van SGs sequentieel zekering met elkaar (volgende SG smelting) en met het plasma-membraan, met behoud van een porie open fusion. Dientengevolge, is een veel grotere massa van FITC-dextran dequenched, wat resulteert in een grote en langlevende fluorescentie-burst (C, III-IV) dat vervalt wanneer de sonde in het externe medium (C, V diffundeert).

Wij hebben dit model gebruikt en zijn voorspellingen door imaging cellen en cellen die zijn uitgeput van Rab5, die we laten zien hebben als cruciaal voor homotypic SG-SG fusion69 en samengestelde exocytose33bevestigd. Door acquisitietijd in te stellen een afbeelding elke 15 s, wij moeten detecteren meestal continu gebeurtenissen van afscheiding, dat wil zeggen, samengestelde exocytose. Inderdaad, zoals weergegeven in figuur 1B, onze gegevens tonen aan dat terwijl in controle cellen van vele grote en langdurige exocytic evenementen kan worden opgenomen, alleen enkele gebeurtenissen werden vastgelegd in Rab5 vechtpartij cellen (shRab5). Bovendien waren de gebeurtenissen die zijn vastgelegd in de shRab5 cellen aanzienlijk kleiner in grootte in vergelijking met de gebeurtenissen die zijn vastgelegd in de cellen. Van de nota blijft de secretoire capaciteit van de cellen van de shRab5 ongewijzigd onder de zelfde voorwaarden69, wat suggereert dat terwijl shRab5 samengestelde exocytose remt, het niet secretie afschaffen doet. Daarom zorgt imaging FITC-dextran fluorescentie in lange tijdsintervallen voor de specifieke detectie van samengestelde exocytose. Bovendien kan imaging FITC-dextran release vastleggen van de sequentiële aard van samengestelde exocytose. Zoals aangegeven door de pijl in Figuur 1b, na een lichtflits, begint een tweede flits als een zwakke flits die grenst aan het ene. Dit kan worden afgeleid als de fusie van een SG met een SG die is al bezig met de fusie met het plasma-membraan (dat wil zeggen, sequentiële exocytose). Vandaar, als de tweede submodule combineert met de eerste module die al is verbonden met het plasmamembraan door een fusie porie, de pH van de tweede submodule verhoogt ook en FITC fluorescentie dequenches, opbrengst van een tweede uitbarsting van fluorescentie. Zulk een scenario van FITC-dextran release tijdens opeenvolgende fusie van aangrenzende SGs is in Figuur 1 cgepresenteerd.

Een ander voorbeeld van sequentiële fusie van SGs tijdens samengestelde exocytose is afgebeeld in Figuur 2. RBL cellen waren mede transfected met een constitutively actieve (CA) vorm van Rab5a en WT module-23, de voorwaarden onder welke samengestelde exocytose meer robuuste33 wordt. Beeldvorming van de CA-Rab5a, die is van essentieel belang voor SG-SG fusion en grote SGs33,69, samen met FITC-dextran, is coating kunt betere visualisatie van de fusie voor een kleinere granule met een grotere submodule CA-Rab5a ingericht.

Aangezien de FITC-dextran is uitgeblust wanneer opgeslagen in de SG, is het nodig voor de uitvoering van een techniek voor het controleren dat FITC-dextran inderdaad aanwezig in de SGs is. Dit wordt nog noodzakelijker wanneer preforming een experiment onder de voorwaarden die worden verwacht af te schaffen secretie. Om te overwinnen deze hindernis, 20 mM van ammoniumchloride toevoegde aan de kamer aan het einde van elk experiment. Deze behandeling verhoogt de pH binnen de SGs, rekening houdend met FITC fluorescentie. Zoals blijkt uit Figuur 3, na toevoeging van ammoniumchloride tot de media, FITC dextran zichtbaar wordt en samen met mRFP-gelabeld neuropeptide Y, oftewel een SG-verslaggever in RBL cellen70is gelokaliseerd.

Figure 1
Figuur 1: specifieke detectie van samengestelde exocytose. (a) een beschrijving van hoe wijzigingen in fluorescentie FITC-dextran recapituleren de verschillende modi van gereglementeerde exocytose diagram. (b) Live cel die beeldvorming van FITC-dextran in RBL cellen transfected met NPY-mRFP en pSilencer of shRab5, zoals aangegeven. Transfectie werd uitgevoerd als eerder beschreven67,70. Kort, 1.5 x 107 RBL cellen werden geresuspendeerde in Transfectie buffer (DMEM aangevuld met 20 mM K-Pipes pH 7, 10 µM Ca2 + acetaat, 2 mM Mg2 + acetaat, 128 mM kalium glutamaat) met 15 µg NPY-mRFP en ofwel 30 µg van pSilencer of 15 µg voor shRab5A, en 15 µg voor shRab5B/C. transfectie werd bereikt door electroporation op 300 V en een 20 pulslengte van de mSec. Cellen werden onmiddellijk replated in kweekmedium dat 1 mg/mL FITC-dextran. Na 24u, werden cellen gesensibiliseerde personen met 1 µg/mL IgE en verder 24 h ge¨ uncubeerd. De cellen werden vervolgens driemaal met volledige Tyrode de buffer gewassen en geactiveerd door 50 ng/mL van DNP-HSA (Ag). Cellen werden gevisualiseerd door time-lapse fluorescentie microscopie. De witte pijl in de beelden van de pSilencer wijst naar een uitbarsting van FITC fluorescentie en de witte cirkel markeert een ontladen SG. De witte pijl in de shRab5A/B/C-beelden geeft minuut fluorescerende gebeurtenissen die plaatsvinden in Rab5-knockdown cellen, kunnen indicatief zijn voor volledige exocytose. Van de nota, werd de intensiteit van de afbeelding van de ShRab5 verhoogd zodat de opsporing van het signaal. Beelden werden verworven door een confocal microscoop uitgerust met een verwarmde kamer (37 ° C) en CO2 controller (4,8%) en een C-Apochromat x63/1.2 W Corr-doelstelling, onder open pinhole instelling. Voor de volledige films, verwijzen naar Klein et al. 33 (c) een schematisch diagram van het proces dat wordt weergegeven in (b) in de fusie van de homotypic SG. In detail, zoals de eerste SG met het plasma-membraan combineert en een fusie porie stelt, begint het te alkalize tijdens het loslaten van de FITC-dextran inhoud. Dus, tegen de tijd dat een tweede SG combineert met het eerste item in een sequentiële wijze, de fluorescentie van de eerste SG verdwijnt door de vrijval van FITC-dextran. Echter, de tweede SG alkalizes, wat resulteert in een FITC-flitser die wordt weergegeven naast de eerste SG. Dit cijfer werd aangepast van Klein et al. 33 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Afbeelding 2: dubbele beeldvorming van mStr-CA-Rab5 en de FITC-Dextraan. RBL cellen waren mede transfected met 20 µg HA-wt-SNAP23 en 10 µg mStr-CA Rab5A. Cellen werden vooraf geïncubeerd met FITC-dextran en IgE en gestart met Ag, zoals beschreven in Figuur 1. (a) een reeks beelden vastleggen van de gebeurtenis van een fusie tussen een gehard SG (witte pijl) en een SG die is al gesmolten met het plasma-membraan en daarom tl. Op 15,8 minuten, heeft de gehard SG gefuseerd met de naburige SG en begonnen met het krijgen van fluorescentie. De doos gebieden worden vergroot in de linkerbenedenhoek van elk punt van de tijd. (b) presentatie van zowel de mSTR-CA Rab5A (in rood) en de FITC-dextran (in groen) uit de bijbehorende tijdstippen weergegeven in punt a, demonstreren de fusie tussen de twee SGs. beelden werden verworven door confocale microscopie (open gaatje) met behulp van een Plan-apochromat x63-nb 1.4 doelstelling. Dit cijfer werd aangepast van Klein et al. 33 Zie voor de volledige film, Klein et al. 33 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Dual imaging van NPY-mRFP en FITC-dextran tijdens alkalization van SG door NH4Cl. RBL cellen werden transfected met shRab5, vooraf geïncubeerd met FITC-dextran en IgE en geactiveerd met Ag, zoals beschreven in Figuur 1. (a) cellen werden gevisualiseerd door time-lapse fluorescentie microscopie. Aangewezen tijden in de beelden zijn minuten na triggering met Ag. Beelden werden verworven door confocale microscopie met behulp van een Plan-apochromat x63-nb 1.4 doelstelling. (b) kwantitatieve analyse van het experiment aangetoond in (a). Elke regel in de grafieken is de gemiddelde fluorescentie van FITC op een gebied van belang (ROI) via een enkele cel. De pijl wijst naar de tijd van NH4Cl (20 mM) toevoeging. Bars = 5 µm. Dit cijfer werd aangepast van Klein et al. 33 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschrijven we hoe traceren de fluorescentie van FITC-dextran in SGs geladen kan worden gebruikt om het speciaal samengestelde exocytose van gebeurtenissen. Dit werd bereikt door de Microscoop te verwerven van een afbeelding elke 15 seconden, aldus voor te zorgen dat alleen langdurige gebeurtenissen na verloop van tijd worden vastgelegd en dus met uitzondering van korte gebeurtenissen die zou overeenkomen met volledige exocytose of kus-en-run exocytose. Om vast te stellen van de methode, toonden we dat knockdown van de Rab5-isoforms die worden uitgedrukt in RBL cellen, en zijn cruciaal voor samengestelde exocytose, elimineert de mogelijkheid om het vastleggen van gebeurtenissen van FITC-dextran release, hoewel de totale secretie door de cel wordt niet beïnvloed.

Het belangrijkste nadeel van de methode is dat het alleen van toepassing op cellen met zure SGs. Het belangrijkste voordeel van de methode is echter dat het is gebaseerd op eenvoudige incubatie van de cellen met FITC-dextran, zonder transfectie. Andere pH-gevoelige verslaggevers die worden gebruikt voor het bestuderen van gereglementeerde exocytose en betrekken SG vracht of SG membraan eiwit-gesmolten tot phlourin, een pH-gevoelige GFP variant (zoals NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, en synapto-phluorin48, 49,,50,51,52), kan meer nauw vertegenwoordigen de endogene samenstelling van de SGs. Echter, het gebruik ervan met zich meebrengt transfectie van de cellen, die minder geschikt voor cellen die moeilijk wellicht te transfect. Daarom, wanneer bestuderen van cellen die zijn moeilijk te transfect of onder experimentele omstandigheden waarvoor meerdere genomic manipulaties, het gebruik van een stof die eenvoudig kan worden aangevuld in het kweekmedium cel, zoals FITC-dextran, is gunstig. Ons protocol mogelijk cel specifieke aanpassingen voor de verschillen in de kinetiek van exocytose van andere cel typen68. Vandaar moet de gekozen tijdsinterval voor Beeldacquisitie worden geoptimaliseerd. Voor RBL cellen hebben we set-up de Microscoop een nieuwe opname interval van vijftien seconden, volgens IgE/Ag RBL cellen geactiveerd ons toegestaan om te visualiseren alleen langdurige gebeurtenissen, waardoor het exclusieve volgen van samengestelde exocytose gebeurtenissen.

Een andere factor die moet worden beschouwd is de soort dextran moet worden gebruikt. Een verscheidenheid van dextrans die in hun molecuulgewichten variëren zijn beschikbaar. Het is daarom belangrijk om te kiezen van de juiste dextran als verslaggever, rekening houdend met de mogelijke gevolgen die verschillende dextrans zou kunnen op de cellen hebben. Laag moleculair gewicht dextrans hebben bijvoorbeeld aangetoond dat activeren MCs en induceren secretie71,72,73,74. Laag moleculair gewicht dextrans zou daarom geen passende verslaggevers voor MC secretie. Verschillen in cel reactiviteit naar dextrans werden ook vermeld in verschillende rat stammen75of onder verschillende co-stimulatory voorwaarden71,76,77,78. Hier hebben wij gekozen voor een 150 K FITC-dextran dat eerder is bestudeerd in de cellijn van RBL en aangetoond dat zij ineffectief in inducerende secretie18,79.

De lichtbron worden geselecteerd is ook cruciaal voor het protocol. Wanneer u een confocal microscoop, is de lichtbron traditioneel op laser gebaseerde. Dus, om te voorkomen dat toxiciteit, het is noodzakelijk om te kiezen van een lage laser macht. De kracht van de gewenste laser verschilt tussen microscopen, afhankelijk van het type en de leeftijd van de laser. Bovendien, de gewenste laser macht is ook afhankelijk van het soort detector gebruikt. Bijvoorbeeld, bij gebruik van een gemeenschappelijk detector zoals een fotomultiplicator buis gebaseerde detector, zal een hoger vermogen laser nodig zijn dan bij het gebruik van een moderne hybride detector (zoals een fotomultiplicator en een lawine foto-diodes hybride detector). Het is raadzaam om met behulp van de laagste laser kracht mogelijk en niet meer dan 10 gewichtspercenten van de macht van de laser.

Kortom, toezicht op de dequenching van SG geladen FITC-dextran tegen tijd die lapse-microscopie onder zorgvuldig gekozen instellingen kan ons uitsluitend inneming samengestelde exocytose in RBL MCs, sterk faciliterende identificatie van de moleculaire entiteiten die het regelen van dit proces. Deze methode kan verder worden aangepast om te onderscheiden volledige van kus-en-run exocytose door het verminderen en zorgvuldig het kalibreren van het tijdsinterval tussen afbeelding acquisities teneinde het onderscheid van de kortstondige flitsen gekoppeld kus-en-run Exocytose van de nog kortere flitsers die gepaard gaan met volledige exocytose. Dergelijke omstandigheden zou vangen zowel samengestelde en kus-en-run exocytose die vervolgens kan worden onderscheiden op basis van de duur van het signaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belang

Acknowledgments

Wij danken Dr. U. Ashery voor de gulle gift van cDNA. Wij danken Drs. G. massa, L. Mittleman, M. Shaharbani en Y.Zilberstein van de Sackler mobiele & Molecular Imaging Center voor hun onschatbare hulp met microscopie. Dit werk werd gesteund door de Verenigde Staten-Israël binationale Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel en S.J.Galli) en het verlenen van 933/15 vanaf de Israël Science Foundation, opgericht door de Israël-Academie voor Wetenschappen (te R.Sagi-Eisenberg ) en NIH grants U19 AI 104209 en R01 AR067145 (naar S.J. Galli).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

Tags

Biologie kwestie 136 FITC-dextran gereglementeerde exocytose samengestelde exocytose levende cel beeldvorming lysosoom-gerelateerde organellen Pinocytose
Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, O., Roded, A., Hirschberg,… More

Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter