Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

כאן אנחנו פירוט שיטת הדמיה תא בשידור חי של אקסוציטוזה מוסדר. שיטה זו משתמשת FITC-לתוספי, אשר צוברת ב הקשורות ליזוזום organelles, בתור כתב. שיטה פשוטה זו מאפשרת גם הבחנה בין מצבים שונים של אקסוציטוזה מווסתת בתאים קשה לתמרן גנטית.

Abstract

אקסוציטוזה מוסדר הוא תהליך שבאמצעותו מטענים, אשר מאוחסן בגרגרים הפרשה (SGs), משוחרר בתגובה גורם הפרשה. אקסוציטוזה מוסדר הוא היסוד לתקשורת המערכת והוא מפתח מנגנון הפרשת נוירוטרנסמיטרים, הורמונים, מתווכים דלקתיים, תרכובות אחרות, על ידי מגוון רחב של תאים. לפחות שלושה מנגנונים נפרדים ידועים אקסוציטוזה מוסדר: אקסוציטוזה מלא, איפה SG יחיד מלא ולספות עם קרום פלזמה, נשיקה-וברח אקסוציטוזה, איפה SG יחיד פתילים transiently עם קרום פלזמה, ומתחם אקסוציטוזה, איפה SGs מספר נתיך אחד עם השני, לפני או אחרי ס ג פיוז'ן עם קרום פלזמה. סוג מוסדר אקסוציטוזה שנערך על ידי תא מוכתב לעתים קרובות על ידי הסוג של גירוי הפרשה. עם זאת, תאים רבים, בגורם מפעיל הפרשה יחיד ניתן להפעיל מספר מצבי של אקסוציטוזה מוסדרים בו זמנית. למרות שפע שלהם ואת חשיבות על פני התא סוגים ומינים, המנגנונים הקובעות את מצבים שונים של הפרשת הן במידה רבה בלתי פתורות. אחד האתגרים העיקריים בחקירת על מצבים שונים של אקסוציטוזה מוסדר, הוא הקושי הבחנה ביניהם, כמו גם לחקור אותם בנפרד. כאן נתאר את השימוש fluorescein isothiocyanate (FITC)-לתוספי אקסוציטוזה הכתב, וכן תא חי הדמיה, כדי להבדיל בין המסלולים השונים של אקסוציטוזה מוסדר, התמקדות אקסוציטוזה מורכבים, בהתבסס על החוסן, משך הזמן של אירועים exocytic.

Introduction

אקסוציטוזה מוסדר הוא המנגנון העיקרי שבאמצעותו מטענים בקלות עשה הוא שוחרר מן תא הפרשה בתגובה גורם ספציפי. המטען מראש נוצר, מבודדות לתוך שלפוחית הפרשה, שבו הוא מאוחסן עד טריגר ממסרים האות לשחרור של התוכן של SGs. סוגים שונים של אותות עלולה לגרום מצבים שונים של אקסוציטוזה מוסדר, או מצבים שונים של אקסוציטוזה מוסדר עלולה להתרחש בו זמנית. שלושה מצבים עיקריים של אקסוציטוזה מוסדר ידועים: אקסוציטוזה מלאה, הכוללת פיוז'ן מלא של גרגר הפרשה יחיד עם קרום פלזמה; נשיקה-וברח אקסוציטוזה, שכרוך ארעי הפיוז'ן גרגר הפרשה עם קרום פלזמה ואחריו שלה מיחזור; ו אקסוציטוזה מורכבות, אשר מאופיין על ידי homotypic פיוז'ן של מספר לפני SGs (קרי, אקסוציטוזה multigranular) או רציף (קרי, אקסוציטוזה רציפים) כדי פיוז'ן עם קרום פלזמה1. אקסוציטוזה מתחם נחשב מצב הנרחב ביותר של מטען מהדורה2, כמו זה מאפשר הפרשה מהירה של מטענים, כולל זה של SGs הממוקמים דיסטלי של קרום פלזמה. אקסוציטוזה מתחם תועד בשני תאים האנדוקרינית אקסוקרינית3,4,5,6,7,8,9, וכן תאים חיסוניים. תאים חיסוניים, כגון אאוזינופילים10,11,12 ו נויטרופילים13, מתחם אקסוציטוזה מאפשר שחרור מהיר וחזק של המגשרים הדרושים כדי להרוג פתוגנים פולשים כגון חיידקים או טפילים. תאי פיטום (MCs) לפרוס אקסוציטוזה המורכבת לשחרור יעיל של מתווכים דלקתיים מראש מאוחסנות במהלך תגובות מערכת החיסון המולדת, אנפילקסיס ו אחרים14,15,של תגובות אלרגיות16 , 17. מאז מצבים שונים של אקסוציטוזה עלולה להתרחש בו זמנית18,19, זה הפך להיות אתגר כדי להבחין בין אותם בזמן אמת או כדי לזהות שלהם machineries פיוז'ן בהתאמה, ומכאן שחקרתי מנגנונים הבסיסית שלהם.

כאן אנו מציגים שיטה, המבוסס על תאים חיים הדמיה של התא טעון FITC-לתוספי, המאפשר מעקב בזמן אמת של אירועים exocytic, הבחנה בין מצבים שונים שלהם. בפרט, השיטה שלנו מאפשר ניטור בלעדית של תרכובת אקסוציטוזה.

FITC-לתוספי הוא המספר המשלים של fluorophore pH רגיש FITC עם לתוספי רב-סוכר גלוקן. Dextrans fluorescently שכותרתו הוכחו הזן את התא על-ידי micropinocytosis20,21 ו- macropinocytosis22,23. כמו תאים endocytic בוגר לתוך lysosomes, הוכח כי FITC-לתוספי שמצטבר ליזוזום עם אין השפלה נראית לעין. עם זאת, כיוון FITC הוא מאוד רגיש pH fluorophore בגודל24, ליזוזום לומן הוא חומצי, זריחה FITC-לתוספי המרווה בהגיעם ליזוזום24. לכן, הקמת dextrans כמו ליזוזום ממוקד מטענים, ויחד עם הרגישות pH של FITC, הניחו את היסודות עבור השימוש FITC-לתוספי במחקרים ליזוזום אקסוציטוזה25,26,27 , 28 , 29.

מספר סוגי תאים, כולל MCs, נויטרופילים, אאוזינופילים, T ציטוטוקסיים, melanosomes ואחרים, SGs להציג תכונות lysosomal, מסווגים הקשורים ליזוזום organelles (LROs) או הפרשה lysosomes30,31 . מכיוון LROs יש על pH חומצי luminal, FITC-לתוספי ניתן להמחיש אקסוציטוזה שלהם, כתוצאה pH גבוה יותר המשויכים את כיציאה מתוך הגוף של LROs. אכן, נעשה שימוש FITC-לתוספי לפקח אקסוציטוזה ב MCs-18,-32,-33. בשיטה זו, FITC-לתוספי נוספו התרבות תאים, שימולא על ידי התאים פינוציטוזה, מתמיינים של SGs. כמו בגן lysosomes, זריחה FITC הוא מתרצה ב SGs כאשר הם בתוך התא. עם זאת, על ס ג פיוז'ן עם קרום פלזמה, חשיפה הסוגר חצרו החיצונית, FITC-לתוספי חוזר שלה פלורסצנטיות כמו עלייתו של ה-pH של ס ג, ומאפשר את מעקב פשוט של exocytic אירועים על ידי מיקרוסקופ תא חי. כאן, אנחנו מותאם בשיטה זו כדי לאפשר מעקב ייחודי של תרכובת אקסוציטוזה.

שתי שיטות נוספות שימשו בעבר כדי לעקוב אחר אקסוציטוזה מורכבים. מיקרוסקופ אלקטרונים הייתה השיטה הראשונה כדי לאפיין מבני exocytic כי הציע את המופע של מצבים שונים של אקסוציטוזה. בפרט, תצפיות המנהרות"הפרשה" בתאי הלבלב acinar34 , MCs35,36,37 הולידה ההשערה של תרכובת אקסוציטוזה. עם זאת, בעוד הרזולוציה הגבוהה של מיקרוסקופ אלקטרונים יש את הכוח כדי לחשוף את שלפוחית מאוחה, זה לא יכולים לאתר את הדינמיקה של פיוז'ן שלהם, ולכן אינו יכול להגדיר אם הם תואמים SG פיוז'ן במהלך אקסוציטוזה תרכובת או פיוז'ן של גרגרי כבש מחדש בעקבות אנדוציטוזה שלהם. זה מכשול בשיטות אחרות שיכול למדוד אקסוציטוזה בתאים חיים, כגון תיקון המידות קלאמפ של קרום פלזמה קיבוליות11,13,38,39 או amperometry 40 של המדיה. עם זאת, תיקון מחבר חובק למעקה דורש מלכודת מיוחדת, לא יכול להיות מתאים לכל סוגי תאים. מדידות Amperometry מסוגלים לעקוב אחר אקסוציטוזה רק אם המטען הוא שוחרר במרחק מאוד קרוב אל האלקטרודה. לכן, באמצעות הדמיה תא חי מציע יתרון על פני שיטות אלה, זה לא רק מאפשר מעקב בזמן אמת אחר אקסוציטוזה, אבל זה גם מאפשר רכישה מהירה ופשוטה של נתונים כל התא.

המעקב של FITC-לתוספי על ידי מיקרוסקופ תא חי מציע גם כמה יתרונות אחרים תא חי שיטות דימות מבוססות. לדוגמה, השיטה הנפוצה היא גמורה פלורסצנטיות מיקרוסקופ (TIRFM) של תאים נטען עם מכשיר בדיקה SG פלורסנט או ביטוי של פלורסנט מתויג חלבון SG מטען או קרום חלבון26,41, 42 , 43. כוחו של שיטה זו נעוץ יכולתה לפקח באופן בלעדי האירועים המתרחשים בקרבת קרום פלזמה (המכונה בזאת טביעת רגל), ומכאן exocytic אירועים. עם זאת, זהו גם החיסרון של שיטה זו כי רק השבר תאים סמוכים coverglass, קרוב המיקרוסקופ יכול להיות עם תמונה44. אם טביעות הרגל כזה אכן מייצגים על פני קרום התא כולו נמצא עדיין שנוי במחלוקת45,46,47. בהקשר זה, באמצעות צבע רגיש pH כמו FITC-לתוספי, מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה או מיקרוסקופ קונפוקלי עם חריר פתוח מאפשר הדמיה של התא כולו, וכך לתפוס את האירועים exocytic הכולל המתרחשים בתא.

כתבים pH רגישים נוספים המשמשים ללמוד אקסוציטוזה מוסדר על ידי הדמיה התא כולו או TIRFM כוללות SG מטען או חלבון ממברנלי SG דבוקה phlourin, pH רגיש GFP משתנה. דוגמאות כוללות NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin synapto-phluorin48,49,50,51,52. בעוד הביטוי של הגששים אלה עשוי לייצג באופן הדוק יותר ההרכב אנדוגני של SGs, זה כרוך תרביות תאים של תאי, וייתכן ולכן פחות מתאים תאים שקשה transfect. לכן, כאשר הלומדים תאים זה קשים transfect או בתנאים ניסיוני הדורשים מספר מניפולציות גנומית, השימוש של מתחם זה ניתן להשלים פשוט לתוך התרבות התא האמצעי, כגון FITC-לתוספי, יש יתרון . FITC-לתוספי מציע גם יתרון על פני acridine כתום (AO), צבע pH רגיש אחר שבו נעשה שימוש עבור המעקב של אקסוציטוזה מאת חיים התא מיקרוסקופ53,54,55,56 , 57 , 58. אאו הוכח לגרום פוטוליזה של שלפוחית שבו התוצאה הבזקים כוזבים, אשר מתאימה ההפרשה בפועל מעבדת27. לעומת זאת, FITC-לתוספי משקף אירועים הפרשת יותר, כנראה בגלל הייצור הנוצרות על-ידי צילום נמוכה של חמצן תגובתי27.

ראוי לציין, גישה חלופית ללמוד אקסוציטוזה זה לאתר זרם של צבע, של המדיום חיצוניים לתוך ס ג דרך הנקבובית פיוז'ן שנפתח במהלך תהליך זה. במקרה זה, לצבוע מתווסף המדיום חיצוני לצד ההדק הפרשה. לאחר מכן, עם פתיחת הנקבובית פיוז'ן, לצבוע מפזרת לתוך ה59,ג60. יתרון ברור של שיטה זו הוא כי הוא מציע גם את היכולת לאמוד את גודל הנקבוביות פיוז'ן, על ידי שימוש צבעים בגודל משתנה. לדוגמה, ניתן להשתמש dextrans של משקל מולקולרי שונה (MW), מצומדת כדי fluorophores שונים, כמו צבעי חוץ-תאית, לפיה הגודל המרבי של לתוספי שיכולים לחדור את ס ג להתאים לגודל של פיוז'ן נקבובית59, 61 , 62 , 63 , 64. בנוסף, גישה זו אינה דורשת שימוש בדיקה pH-רגיש. עם זאת, חיסרון משמעותי הוא האות לרעש יחס הוא נמוך מאוד, שכן כמות גדולה של צבע קיים בתקשורת במהלך רכישת תמונות, וכתוצאה מכך רקע.

בסך הכל, השימוש של FITC-לתוספי סמן אקסוציטוזה מתגבר על מספר חסרונות בשיטות שדווחה בעבר, כגון אות לרעש יחס, רעילות, מעקב דינמי ומורכבות.

כאן נתאר את השימוש FITC-לתוספי לפקח אקסוציטוזה מתחם בקו 3 תא פיטום RBL - 2H (בזאת המכונה RBL, בעיקר שקבע אקלסטון. et al. 65 ו לשכפל עוד יותר על-ידי. Barsumian et al. 66), בתגובה אימונוגלובולין E (IgE) / הפעלה אנטיגן (Ag).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכשירים

  1. הכנת RBL תרבות המדיה
    1. מיקס 500 מ של סוכרים נמוכה Dulbecco של ששינה בינוני הנשר (DMEM) עם 56 מ של סרום שור עוברית (FBS), 5.5 mL של פניצילין-סטרפטומיצין-ניסטטין פתרון, מ 5.5 לגלוטמין 200 מ מ פתרון. התוצאה גלוקוז נמוך DMEM בתוספת 10% FBS, סטרפטומיצין µg 100/mL, 100 יחידות/mL פניצילין, 12 יחידות/mL ניסטטין ו- 2 מ מגלוטמין.
    2. לסנן את המדיה באמצעות מסנן העליון-ואקום של 0.22 µm גודל הנקבוביות וחנות ב 4 º C.
  2. תחזוקת RBL תאים.
    1. לגדול RBL תאים confluency מקסימלית של 90% בקערה 10 ס מ. אם התרבות תאים בריאים, התאים צריך צורת ציר עם בליטות מפעם לפעם.
    2. עבור תא פיצול, לנתק את התאים מתוך קערה על ידי כ רפה בעברית התקשורת והחלפה 2 מ של trypsine/EDTA פתרון Incubate נולד ב 5-10 דקות באווירה humidified של 5% CO2 ב 37 º C.
    3. ברגע התאים יש תלושים, לנטרל את טריפסין על-ידי הוספת 2 מ של תרבות התקשורת, באמצעות פיפטה של, ואת לפצל את התאים ב- 1:2-1: יחס 10.
  3. הכנת 20 x המאגר של Tyrode
    1. להכין מלאי 20 x פתרון של 54 מ מ אשלגן כלורי, 20 מ מ MgCl2, 2.74 מ' NaCl ו- 8 מ מ NaH2PO4 במים מזוקקים כפול (DDW). מערבבים היטב ולאחסן ב 4 º C.

2. התרבות של תאים RBL מיקרוסקופ תא בשידור חי

  1. הכנת FITC-לתוספי פתרון.
    1. מערבבים 1 מ ג של אבקת FITC-לתוספי (150 K) לכל 1 מ"ל של תרבות התקשורת (ראה שלב 1.1.1). עבור coverglass chambered, מלא להכין 3 מ.
    2. באמצעות יחידת מסנן אצטט תאית מזרק עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.22, לסנן את FITC-לתוספי מומס.
    3. להוסיף העכבר IgE ריכוז של µg 1/mL.
  2. זריעה RBL תאים עבור הדמיה
    1. יום לפני הדמיה, תשאף המדיה מן המנה תרבות ולהחליף עם 2 מ של trypsine/EDTA פתרון ב' Incubate במשך 5-10 דקות באווירה humidified של 5% CO2 ב 37 º C. ברגע התאים יש תלושים, לנטרל את טריפסין על-ידי הוספת 2 מ"ל של תרבות התקשורת.
    2. RBL ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולכוונן את העוצמה בהתאם עם תרבות המדיה להגיע לריכוז תא של 7.5 x 105/mL.
    3. להוסיף 10 µL של השעיה תא אל coverglass chambered מראש מלא FITC טריים-לתוספי שיושלם תרבות המדיה (התוצאה היא זריעה של 7.5 x 103 תאים בתוך תא).
    4. לגדל תאים RBL בן לילה באווירה humified של 5% CO2 ב 37 º C. התאים צריכים להישאר ברמה תת confluent על מנת לוודא כי התאים מופרדים, כי זה קל לזהות את כל תא בנפרד תחת המיקרוסקופ.
  3. תרביות תאים תאים RBL - אופציונלי.
    1. לקבלת הדמיה exocytic אירועים בשילוב עם חלבונים מתויגות fluorescently אחרים, ראה פרוטוקול תקנים עבור תאים RBL. Azouz et al. 67

3. חיים התא מיקרוסקופ של אקסוציטוזה

  1. אופן ההכנה של פתרונות:
    1. הכן בופר של Tyrode הסופי באמצעות דילול הפתרון מניות ב DDW ב- 1:20 דילול, תוספת עם 20 מ מ Hepes pH 7, 1.8 מ"מ CaCl2, 1 מ"ג/מ"ל BSA ו- 5.6 מ מ גלוקוז.
    2. להכין טרי ריאגנט secretagogue 20 x במאגר של Tyrode [1 dinitrophenyl µg/mL מצומדת כדי האנושי אלבומין (DNP-יש (Ag)) במקרה שלנו, על ריכוז 1 x 50 ng/mL].
    3. להכין פתרון אמוניום כלוריד 400 מ על ידי המסת אבקה במאגר של Tyrode.
  2. הכנה של התאים.
    1. לשטוף את coverglass chambered 3 פעמים על ידי כ רפה בעברית התקשורת מן החדר ואת מילוי זה עם 300 µL מאגר של Tyrode, prewarmed ל- 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, לחדש את התא עם 300 µL מאגר של Tyrode, prewarmed ל- 37 מעלות צלזיוס.
    2. מניחים את coverglass chambered בתא חממה של המיקרוסקופ. ודא כי החדר הוא יציב.
  3. הגדרת המיקרוסקופ
    1. כדי לבחור אזור עניין כדי לעקוב אחר, להפעיל את מקור האור פלורסנט (באופן מסורתי מנורת כספית) ובחרו את המסנן קרינה פלואורסצנטית המתאים (בחר את המסנן עבור fluorophores ירוק לצפייה FITC-לתוספי). ברגע האזור עניין נמצא המוקד במרכז שדה הראייה, לבטל את מקור האור כדי למנוע הלבנת-צילום ורעילות.
      הערה: חלק FITC-לתוספי שולבו בתאים עשוי שומרים על ידי קרינה פלואורסצנטית. זה בגלל FITC-לתוספי עשוי גם מיון כדי התאים הלא-lysosomal כגון endosomes.
    2. הפעל את תאורה המתאימים עירור FITC. אם באמצעות מיקרוסקופ מבוססת לייזר, הפעל את 488 ננומטר לייזר. פליטה צריך להיות התאספו סביב 500-550 ננומטר (פליטת FITC פסגות-510-520 ננומטר).
    3. כאשר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, לפתוח את חריר למקסימום. זה יאפשר שימוש כוח לייזר נמוכה למניעת הלבנת ורעילות, יבטיח לכידתו של אקסוציטוזה אירועים מ כל המטוסים של התא.
    4. כיילו את מרווח הזמן בין התמונה רכישות.
      1. תאים שונים עשויים להשתנות ב שלהם קינטיקה של אקסוציטוזה מוסדר68. עבור הדמיה ספציפית של תרכובת אקסוציטוזה, אנו ממליצים על מרווח זמן לפחות 5 שניות. עם זאת, כלל אצבע, כדי לאפשר הדמיה מהר, ודא בזמן רכישת מסגרת אחת מהירה.
      2. בעת שימוש מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר, להגדיר את הכיוון סריקה דו כיווני לא מאפשרים חישוב ממוצע, הגדרת רזולוציית-512 x 512 (מומלץ; הוראות שני האחרון תסייע גם כדי למזער את הלבנת ורעילות).
  4. הדמיה של אקסוציטוזה.
    1. התמונה תאים עבור משכי הזמן הרצויה, בהתאם לסוג התא או secretagogue. בתאים RBL מופעלות עם IgE/Ag, אירועים exocytic רוב להתרחש תוך 15-20 דקות של הפעלת.
    2. לצורך הפעלה של תאי, להוסיף 16 µL מתוך 20 x secretagogue פתרון אל התא.
  5. המאשר FITC-לתוספי נוכחות בתאים.
    1. כדי לאשר את הנוכחות ואת לוקליזציה של FITC-לתוספי SGs, להוסיף µL 16 של פתרון אמוניום כלוריד (להיות להיזהר לא לעבור את החדר על מנת לא לאבד את המיקוד) לתא בעדינות (זה יהפוך ריכוז סופי של 20 מ מ). זה יכריח את alkalization של SGs ו dequenching של FITC פלורסצנטיות, אשר תתרחש בתוך שניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1a מייצג סכמטי איך FITC-לתוספי עשוי לפעול בתור עיתונאי מוסדר אקסוציטוזה וזה מסכם את הדברים על מצבים שונים של אירועים exocytic. ראשית, תאים מודגרת עם FITC-לתוספי, אשר על ידי פינוציטוזה, ממוין to SGs. מאז SGs של MCs הם LROs, pH נמוך שלהם dampens על ידי קרינה פלואורסצנטית של FITC, המוצג כאן שחור גרגירים (A-C, אני). כאשר תאים מופעלות על ידי secretagogue את הפתיל SGs עם קרום פלזמה, נוצרת נקבובית פיוז'ן, המאפשר בזרימת של פרוטונים alkalization של SGs. כתוצאה מכך, FITC חוזר שלה פלורסצנטיות, (II). אקסוציטוזה מלא יתגלה קצר (פחות מ- 5 s) אירוע פלורסנט כמו הקרום של ס ג יהיו exteriorized מתמוטטת לחלוטין לתוך קרום פלזמה ו FITC-לתוספי מפזרת משם במדיום תרבות (A, III). במהלך אירוע exocytic נשיקה-וברח, הממברנה של ס ג רק transiently ולספות עם קרום פלזמה, וכתוצאה מכך נקבובית פיוז'ן קצרת ימים, ולכן רק התפרצות קצרה של קרינה פלואורסצנטית כמו ס ג במהירות לניתוק, לומן שלה במהירות מחדש acidifies (B, III - IV). לבסוף, במהלך אקסוציטוזה מורכבים, סדרה של SGs נתיך ברצף אחד עם השני (להלן ג fusion), כמו גם עם קרום פלזמה, עם תחזוקה של נקבובית פתוחה פיוז'ן. כתוצאה מכך, מסה גדולה של FITC-לתוספי הוא dequenched, וכתוצאה מכך קרינה פלואורסצנטית גדול ומאריך פרץ (C, III-IV) כי נרקב כאשר המכשיר מפזרת לתוך האמצעי חיצוני (C, V).

יש להשתמש מודל זה ואנו אישר את תחזיות על-ידי הדמיה שליטה תאים ותאים זה דלה של Rab5, אשר אנחנו הראו להיות קריטי עבור homotypic SG-SG פיוז'ן69 ו אקסוציטוזה מתחם33. על-ידי הגדרת רכישת זמן לתמונה כל 15 s, אנו אמורים לזהות בעיקר רציפה האירועים של הפרשת, קרי, מתחם אקסוציטוזה. אכן, כפי שמוצג באיור 1B, שהוקלטה שלנו הנתונים מראים, כי תוך כדי שליטה תאים אירועים רבים וגדולים לטווח ארוך exocytic, רק כמה אירועים נרשמו בתאים תמונות ציפורים Rab5, (shRab5). יתר על כן, אירועי שהוקלטו בתאים shRab5 היו קטנים משמעותית לעומת אירועים שנרשמו בתאים שליטה. ראוי לציין, יכולת הפרשה של התאים shRab5 נשאר שהודעה תחת אותו תנאי69, טוען כי בעוד shRab5 מעכב אקסוציטוזה מורכב, זה לא לבטל את ההפרשה. לכן, זריחה FITC-לתוספי הדמיה במרווחים זמן מאפשר זיהוי ספציפי אקסוציטוזה מורכבים. יתר על כן, שחרור FITC-לתוספי הדמיה מאפשר לכידה של מהות אקסוציטוזה מתחם רציפים. כפי שמציין החץ איור 1b, בעקבות הבזק של אור, פלאש השני מתחיל כמו פלאש חלש הסמוכה אל הראשונה. זה שניתן להסיק אותו כמו הפיוז'ן SG עם ס"ג זה כבר בתהליך היתוך עם קרום פלזמה (קרי, אקסוציטוזה רציפים). לפיכך, כמו גרגר השני פתילים עם גרגר הראשון כבר מחובר אליו קרום פלזמה על ידי היתוך נקבובית, ה-pH של גרגר השני מגביר גם ואת זריחה FITC dequenches, מניב פרץ השני של זריחה. תרחיש של שחרור FITC-לתוספי במהלך פיוז'ן רציפים של SGs הסמוך מוצג באיור 1ג'.

דוגמה נוספת של פיוז'ן רציפים של SGs במהלך אקסוציטוזה מתחם מוצג באיור2. תאים RBL היו שיתוף transfected עם טופס (CA) צורונים פעילים Rab5a ותנאי WT SNAP-23, תחת אילו אקסוציטוזה מתחם הופך להיות עמידים יותר33. הדמיה של Rab5a CA, אשר חיוני פיוז'ן SG-SG, ציפוי גדולות SGs33,69, יחד עם FITC-לתוספי, מאפשר כאחראית של היתוך גרעיני של גרגר קטן עם גרגר גדול יותר CA-Rab5a מעוצבים.

מאז FITC-לתוספי הוא מתרצה כאשר הוא מאוחסן בתוך ס ג, זה הכרחי ליישם שיטה לאימות כי FITC-לתוספי הוא אכן נוכח SGs. זה הופך חיוני אף יותר כאשר preforming ניסוי בתנאים אשר צפויים לבטל את ההפרשה. כדי להתגבר על המכשול הזה, 20 מ מ של אמוניום כלוריד נוספה התא בקצה של כל ניסוי. טיפול זה מעלה את ה-pH בתוך SGs, המאפשר FITC זריחה. כפי שמוצג באיור 3, לאחר תוספת של אמוניום כלוריד לתקשורת, FITC לתוספי הופך גלוי, הוא שותף מקומי עם מתויג mRFP neuropeptide Y, אשר כתב SG RBL תאים70.

Figure 1
איור 1: זיהוי ספציפי של תרכובת אקסוציטוזה. (א) דיאגרמה המתארת כיצד שינויים FITC-לתוספי פלורסצנטיות מסכם את הדברים על מצבים שונים של אקסוציטוזה מוסדר. (b) חיים תא שהדמיה של FITC-לתוספי בתאים RBL transfected עם NPY-mRFP pSilencer או shRab5, כפי שמצוין. תרביות תאים בוצע כפי שתואר לעיל67,70. בקצרה, 1.5 x 10 תאים RBL7 היו resuspended במאגר תרביות תאים (בתוספת 20 מ מ K-צינורות pH 7, 10 מיקרומטר Ca2 + אצטט, 2 מ מ מ ג2 + אצטט, 128 מ"מ אשלגן גלוטמט DMEM) המכילה µg 15 NPY-mRFP, או µg 30 של pSilencer או 15 µg של shRab5A, µg 15 shRab5B/סי תרביות תאים הושגה על ידי אלקטרופורציה ב 300 V ואורך דופק 20 אלפיות שניה. התאים היו מיד replated תרבות בינוני המכיל 1 מ"ג/מ"ל FITC-לתוספי. לאחר 24 שעות, התאים היו רגיש עם 1 µg/mL של IgE, מודגרות עבור עוד 24 שעות. התאים היו לאחר מכן שטף שלוש פעמים במאגר של Tyrode מלא, מופעל על ידי 50 ננוגרם למ"ל של DNP-HSA (Ag). התאים היו דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ. מצביע החץ הלבן של תמונות pSilencer פרץ של זריחה FITC וסימון העיגול הלבן של SG משוחררים. החץ הלבן של תמונות shRab5A/B/C מציין אירועי פלורסנט דקה המתרחשים בתאים Rab5-נוקאאוט, סביר להניח אינדיקטיבית אקסוציטוזה מלאה. ראוי לציין, העוצמה של תמונת ShRab5 היה גדל כדי לאפשר זיהוי של האות. תמונות נרכשו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם חדר מחומם (37 מעלות צלזיוס), בקר2 CO (4.8%), יעד קור W C-עדשה אפוכרומטית x63/1.2, תחת הגדרה חריר פתוח. סרטים מלאים, להפנות קליין. et al. 33 (ג) תרשים כללי של תהליך היתוך homotypic SG שמוצג (b). בפירוט, ס ג הראשון ולספות עם קרום פלזמה, יוצר נקבובית פיוז'ן, זה מתחיל alkalize תוך כדי לשחרר את התוכן FITC-לתוספי שלה. לכן, בזמן ס ג השני בין עם הראשון באופן רציף, ידי קרינה פלואורסצנטית של נמוג SG הראשונה בשל שחרורו של FITC-לתוספי. עם זאת, ס ג השנייה alkalizes, שתוצאתה פלאש FITC המופיע בסמוך ס ג הראשון. איור זה הותאם מ. קליין ואח 33 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הדמיה כפולה של mStr-CA-Rab5 ו- FITC-לתוספי. תאים RBL היו שיתוף transfected עם 20 µg של HA-wt-SNAP23 ו 10 µg של Rab5A mStr-CA. התאים היו מודגרות מראש עם FITC-לתוספי, IgE, מופעלות עם Ag כמתואר באיור1. (א) סדרה של תמונות לכידת אירוע היתוך בין quenched ס ג (חץ לבן) ו- SG כי יש כבר התמזגו עם קרום פלזמה ולכן פלורסנט. ב- 15.8 דקות, ס ג quenched התמזגו עם ס ג השכנות שלה, החלו לצבור קרינה פלואורסצנטית. האזורים התחומים מוגדלות בפינה השמאלית התחתונה של כל נקודת זמן. (b) מצגת של Rab5A mSTR-CA (באדום) וגם FITC-לתוספי (בירוק) מן הנקודות הזמן המתאים מוצג ב (א), הממחיש את המיזוג בין שתי תמונות SGs. נרכשו על ידי קונפוקלית (חריר פתוח) באמצעות תוכנית-עדשה אפוכרומטית x63-נה 1.4 אובייקטיבי. איור זה הותאם מ. קליין ואח 33 ראו הסרט המלא, קליין. et al. 33 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הדמיה כפולה של NPY-mRFP ו- FITC-לתוספי במהלך alkalization של ס ג ב NH4Cl. תאים RBL היו transfected עם shRab5, מודגרות מראש עם FITC-לתוספי, IgE, מופעלות עם Ag, כמתואר באיור1. (א) התאים היו דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ. המיועד פעמים של תמונות הם דקות לאחר מפעילה עם Ag. תמונות נרכשו על ידי שימוש של התוכנית-עדשה אפוכרומטית x63-נה 1.4 מטרת מיקרוסקופיה קונפוקלית. (b) ניתוח כמותי של הניסוי המוצג ב (א). כל שורה בגרפים נגמר זריחה הממוצע של FITC-אזור בעל עניין (ROI) לתא בודד. החץ מצביע על הזמן של NH4בנוסף קלרנית (20 מ מ). ברים = 5 מיקרומטר. איור זה הותאם מ. קליין ואח 33 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן נתאר איך איתור זריחה של FITC-לתוספי נטען לתוך SGs ניתן ללכוד במיוחד אקסוציטוזה מתחם אירועים. זה הושג על ידי הגדרת המיקרוסקופ לרכוש תמונה כל 15 שניות, ובכך להבטיח כי רק לטווח ארוך אירועים יתועדו לאורך זמן ולכן למעט אירועים קצרה שיתאימו באופן מלא אקסוציטוזה או נשיקה-וברח אקסוציטוזה. כדי ליצור את השיטה, הראנו את נוקאאוט של איזופורמים Rab5 מבוטאים בתאים RBL, ו הם מרכזי עבור מתחם אקסוציטוזה, מבטלת את היכולת לצלם אירועים של שחרור FITC-לתוספי, בעת ההפרשה הכללית על-ידי התא אינו מושפע.

החיסרון הבולט של השיטה היא כי חל רק על תאים המכילים SGs חומצי. היתרון הבולט של השיטה זאת, כי הוא מבוסס על דגירה פשוטה של התאים עם FITC-לתוספי, ללא צורך תרביות תאים. עיתונאים pH רגישים נוספים המשמשים ללמוד אקסוציטוזה מוסדר ואף כרוך SG מטען או ס ג ממברנה התמזגו חלבונים phlourin, variant GFP pH רגיש (כגון NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin ו- synapto-phluorin48, 49,-50,-51,-52), עשוי יותר מקרוב לייצג את הרכב אנדוגני SGs. עם זאת, השימוש בהם כרוך תרביות תאים של תאי, אשר עשוי להיות פחות מתאים תאים שקשה transfect. לכן, כאשר הלומדים תאים זה קשים transfect או בתנאים ניסיוני הדורשים מספר מניפולציות גנומית, השימוש של מתחם זה ניתן להשלים פשוט במדיום התרבות תאים, כגון FITC-לתוספי, הוא יתרון. פרוטוקול שלנו עשויים לדרוש התאמות ספציפיות תא כדי להכיל את ההבדלים קינטיקה של אקסוציטוזה של סוגי תאים שונים68. לפיכך, מרווח הזמן שבחרת עבור רכישת התמונה צריכה להיות מוטבת. עבור תאים RBL, יש לנו הגדרת מיקרוסקופ כדי ללכוד תמונה חדשה כל 15 שניות, אשר ב- IgE/Ag עורר RBL תאים אפשרה לנו לדמיין רק אירועים לטווח ארוך, ובכך לאפשר את המעקב אחר בלעדית אקסוציטוזה מתחם אירועים.

גורם נוסף שצריך לקחת בחשבון הוא סוג לתוספי כדי לשמש. מגוון רחב של dextrans משתנים במשקולות מולקולרית שלהם הינם זמינים. לכן, חשוב לבחור את המתאימה לתוספי ככתב, לוקח בחשבון את תופעות אפשריות שייתכן dextrans שונים על תאי. לדוגמה, משקל מולקולרי נמוך dextrans הוכחו להפעיל MCs, זירוז הפרשת71,72,73,74. לכן, משקל מולקולרי נמוך dextrans לא יהיה לכתבים המתאימים עבור הפרשת MC. הבדלים בין תא תגובתיות לכיוון dextrans נרשמו גם זנים שונים עכברוש75, או תחת תנאים שונים co-stimulatory71,76,77,78. . הנה, בחרנו להשתמש של 150 K FITC-לתוספי בעבר יש כבר למד את שורת התאים RBL, הוכח להיות יעיל תוך גרימת הפרשת18,79.

מקור האור שייבחר חיונית גם הפרוטוקול. כאשר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, מקור האור הוא באופן מסורתי מבוססת לייזר. לכן, כדי למנוע רעילות, זה הכרחי כדי לבחור כוח לייזר נמוך. עוצמת הלייזר הרצוי שונה בין מיקרוסקופים, בהתאם לסוג גיל לייזר. יתר על כן, עוצמת הלייזר הרצוי הוא גם תלוי בסוג של גלאי בשימוש. לדוגמה, בעת השימוש גלאי נפוצות כגון גלאי מבוסס שפופרת האופטיקה, לייזר כוח גבוה יותר יהיה צורך יותר בעת שימוש גלאי היברידית מודרנית (כמו צינור האופטיקה של גלאי היברידית צילום-דיודות מפולת שלגים). אנו ממליצים על שימוש את עוצמת הלייזר הנמוך ביותר האפשרי, שלא יעלה על 10% של עוצמת הלייזר.

לסיכום, ניטור של dequenching של ס ג טעון FITC-לתוספי זמן שלשגות-מיקרוסקופיה תחת הגדרות שנבחרו בקפידה אפשרה לנו כדי באופן בלעדי לכידת אקסוציטוזה מתחם ב RBL MCs, מאוד והקלה על זיהוי של גופים מולקולריים זה לווסת את התהליך הזה. שיטה זו יכולה להיות מכוונת נוספת כדי להבדיל מלא לבין אקסוציטוזה נשיקה-וברח על ידי הפחתת ומכייל בקפידה את מרווח הזמן בין התמונה רכישות כדי לאפשר את ההבחנה של הבזקים קצרת ימים המשויך נשיקה-וברח אקסוציטוזה מן הבזקים קצרים אפילו המלוות אקסוציטוזה מלאה. תנאים שילכוד מורכבות וגם נשיקה-וברח אקסוציטוזה כי אז יכול להיות מכובד מבוסס על משך הזמן של האות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום עניין פיננסי מתחרות

Acknowledgments

אנו מודים Ashery U. ד ר על מתנה נדיבה של cDNA. אנו מודים ד"ר ג מסה, ל' וקולאז'ים, מ' שהרבני ו Y.Zilberstein ממלון הסלולר סקלר & מרכז הדמיה מולקולרית על שלהם בפז סיוע עם מיקרוסקופ. העבודה הזאת נתמכה על ידי ארצות הברית-לאומית הקרן הלאומית למדע (גרנט 2013263 ר שגיא-אייזנברג, אני Hammel של S.J.Galli), מענק 933/15 של הקרן הלאומית למדע, שנוסדה על ידי ישראל האקדמיה למדעים (כדי R.Sagi-אייזנברג ) ומענקים NIH U19 AI 104209 ו- AR067145 R01 (כדי סניף Galli).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 136 FITC-לתוספי אקסוציטוזה מוסדר מתחם אקסוציטוזה תא חי הדמיה הקשורות ליזוזום organelles פינוציטוזה
הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, O., Roded, A., Hirschberg,… More

Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter