यहां हम विस्तार से विनियमित exocytosis के लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक विधि । इस विधि का उपयोग करता है FITC-dextran, जो lysosome में जमा-संबंधित organelles, एक रिपोर्टर के रूप में । यह सरल तरीका भी कोशिकाओं है कि आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए मुश्किल है में विनियमित exocytosis के विभिंन तरीकों के बीच भेद की अनुमति देता है ।
विनियमित exocytosis एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा कार्गो, जो स्रावी granules (एसजीएस) में संग्रहित है, एक स्रावी ट्रिगर के जवाब में जारी की है । विनियमित exocytosis सेलुलर संचार के लिए मौलिक है और न्यूरोट्रांसमीटर के स्राव के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है, हार्मोन, भड़काऊ मध्यस्थों, और अन्य यौगिकों, कोशिकाओं की एक किस्म से. तीन अलग तंत्र विनियमित exocytosis के लिए जाना जाता है: पूर्ण exocytosis, जहां एक एकल एसजी पूरी तरह से प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़, चुंबन और भागो exocytosis, जहां एक ही एसजी क्षणिक प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़, और यौगिक exocytosis, जहां एक दूसरे के साथ कई एसजीएस फ्यूज, पहले या प्लाज्मा झिल्ली के साथ एसजी संलयन के बाद । एक कोशिका द्वारा किए गए विनियमित exocytosis के प्रकार अक्सर स्रावी ट्रिगर के प्रकार से तय होता है. हालांकि, कई कोशिकाओं में, एक एकल स्रावी ट्रिगर विनियमित exocytosis के एक साथ कई मोड सक्रिय कर सकते हैं. सेल प्रकार और प्रजातियों में उनकी बहुतायत और महत्व के बावजूद, तंत्र है कि स्राव के विभिंन साधनों का निर्धारण काफी हद तक अनसुलझे हैं । विनियमित exocytosis के विभिंन साधनों की जांच में मुख्य चुनौतियों में से एक, उनके बीच भेद करने में कठिनाई के साथ ही उंहें अलग से तलाश है । यहाँ हम fluorescein isothiocyanate के उपयोग का वर्णन (FITC)-dextran एक exocytosis रिपोर्टर के रूप में, और लाइव सेल इमेजिंग, विनियमित exocytosis के विभिन्न मार्ग के बीच अंतर करने के लिए, यौगिक exocytosis पर ध्यान केंद्रित, मजबूती के आधार पर और exocytic घटनाओं की अवधि ।
विनियमित exocytosis प्राथमिक प्रणाली है जिसके द्वारा आसानी से बनाया कार्गो एक स्रावी सेल से एक विशिष्ट ट्रिगर के जवाब में जारी की है । कार्गो पूर्व का गठन किया है और स्रावी बुलबुले, जिसमें यह एक ट्रिगर जब तक संग्रहीत है में तनहा है एसजीएस सामग्री की रिहाई के लिए संकेत रिले । संकेतों के विभिन्न प्रकार विनियमित exocytosis के विभिन्न मोड में परिणाम हो सकता है, या विनियमित exocytosis के विभिन्न मोड एक साथ हो सकता है. विनियमित exocytosis के तीन मुख्य मोड में जाना जाता है: पूर्ण exocytosis, जो प्लाज्मा झिल्ली के साथ एक एकल स्रावी दाना की पूर्ण संलयन शामिल है; चुंबन और भागो exocytosis, जो प्लाज्मा झिल्ली इसके रीसाइक्लिंग के बाद के साथ स्रावी granules के परिवर्तनीय संलयन शामिल है; और यौगिक exocytosis, जो कई एसजीएस पूर्व के homotypic संलयन की विशेषता है (यानी, multigranular exocytosis) या अनुक्रमिक (यानी, अनुक्रमिक exocytosis) प्लाज्मा झिल्ली1के साथ फ्यूजन करने के लिए. यौगिक exocytosis कार्गो रिलीज2का सबसे व्यापक मोड माना जाता है, के रूप में यह कार्गो के तेजी से स्राव के लिए अनुमति देता है, सहित कि एसजीएस से प्लाज्मा झिल्ली से बाहर स्थित हैं । यौगिक exocytosis दोनों exocrine और अंत-स्रावी कोशिकाओं में प्रलेखित किया गया है3,4,5,6,7,8,9, साथ ही में प्रतिरक्षा कोशिकाओं । प्रतिरक्षा कोशिकाओं में, जैसे इयोस्नोफिल्स10,11,12 और न्यूट्रोफिल13, यौगिक exocytosis मध्यस्थों कि हमलावर रोगजनकों को मारने के लिए आवश्यक है की तेजी से और मजबूत रिहाई की अनुमति देता है जैसे बैक्टीरिया या परजीवी । मस्तूल कोशिकाओं (MCs) सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, तीव्रग्राहिता, और अन्य एलर्जी प्रतिक्रियाओं के दौरान पूर्व संग्रहीत भड़काऊ मध्यस्थों के कुशल रिहाई के लिए यौगिक exocytosis तैनात14,15,16 , 17. चूंकि exocytosis के विभिंन तरीकों एक साथ18,19हो सकता है, यह एक चुनौती के लिए वास्तविक समय में उन दोनों के बीच अंतर या उनके संबंधित संलयन मशीनरी की पहचान बन गया है, इसलिए elucidating उनके अंतर्निहित तंत्र ।
यहाँ हम एक विधि वर्तमान सेल के लाइव सेल इमेजिंग पर आधारित है, FITC-dextran, कि वास्तविक समय exocytic घटनाओं की ट्रैकिंग और उनके अलग मोड के बीच भेद की अनुमति देता है । विशेष रूप से, हमारे विधि यौगिक exocytosis की अनंय निगरानी की अनुमति देता है ।
FITC-dextran FITC glucan polysaccharide के साथ पीएच के संवेदनशील fluorophore dextran का एक संयुग्मी है । फ्लोरोसेंट लेबल dextrans को micropinocytosis20,21 और macropinocytosis22,23द्वारा सेल में प्रवेश करते हुए दिखाया गया है । के रूप में endocytic डिब्बों lysosomes में परिपक्व, यह दिखाया गया है कि FITC-dextran कोई स्पष्ट गिरावट के साथ lysosome में जमा । हालांकि, के बाद से FITC एक उच्च पीएच संवेदनशील fluorophore24है, और lysosome लुमेन अंलीय है, FITC dextran प्रतिदीप्ति24तक पहुंचने पर शमन । इस प्रकार, lysosome लक्षित कार्गो के रूप में dextrans की स्थापना, FITC के पीएच संवेदनशीलता के साथ एक साथ लिया, dextran lysosome के अध्ययन में FITC-exocytosis के उपयोग के लिए नींव रखी है25,26,27 , 28 , 29.
MCs, न्यूट्रोफिल, इयोस्नोफिल्स, साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं, melanosomes, और दूसरों सहित कई सेल प्रकार में, एसजीएस प्रदर्शन lysosomal सुविधाओं और lysosome के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं-संबंधित organelles (LROs) या स्रावी lysosomes30,31 . चूंकि LROs एक अंलीय चमकदार पीएच है, FITC-dextran exteriorization के LROs के साथ जुड़े उच्च पीएच का एक परिणाम के रूप में, उनके exocytosis कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । दरअसल, FITC-dextran में MCs18,३२,३३में exocytosis की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस विधि में, FITC-dextran कोशिका संस्कृति, pinocytosis द्वारा कोशिकाओं द्वारा लिया और एसजीएस में हल करने के लिए जोड़ा गया है । जैसा कि यह lysosomes में है, FITC प्रतिदीप्ति जब वे कोशिका के भीतर हैं एसजीएस में बुझती है । हालांकि, प्लाज्मा झिल्ली और बाहरी वातावरण के फलस्वरूप जोखिम के साथ एसजी फ्यूजन पर, FITC-dextran के रूप में अपनी प्रतिदीप्ति फिर से प्राप्त एसजी पीएच उगता है, की अनुमति सरल ट्रैकिंग exocytic की घटनाओं के लाइव सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा । यहां, हम यौगिक exocytosis की अनूठी ट्रैकिंग सक्षम करने के लिए इस विधि समायोजित ।
दो अंय विधियों पहले यौगिक exocytosis ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी exocytic संरचनाओं कि exocytosis के विभिन्न मोड की घटना का सुझाव दिया विशेषता के लिए पहली विधि थी । विशेष रूप से, की टिप्पणियों “स्रावी सुरंगों” अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं में३४ औरMCs ३५,३६,३७ यौगिक exocytosis की परिकल्पना को जंम दिया । हालांकि, जबकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के उच्च संकल्प से जुड़े बुलबुले प्रकट करने की शक्ति है, यह उनके फ्यूजन की गतिशीलता को ट्रैक नहीं कर सकते और इसलिए परिभाषित नहीं कर सकते कि वे यौगिक exocytosis या फिर से कब्जा granules के दौरान एसजी फ्यूजन के अनुरूप उनके endocytosis के बाद । इस बाधा अंय तरीकों कि exocytosis कोशिकाओं में रहने वाले, जैसे प्लाज्मा झिल्ली समाई11,13,३८,३९ या amperometry के पैच दबाना माप के उपाय कर सकते में दूर है मीडिया के ४० । हालांकि, पैच clamping एक विशेष सेट-अप की आवश्यकता है और सभी प्रकार के कक्ष के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । Amperometry माप exocytosis ट्रैक करने के लिए केवल अगर कार्गो बहुत करीब निकटता में इलेक्ट्रोड के लिए जारी किया गया है कर रहे हैं । इसलिए, लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग इन तरीकों पर एक लाभ प्रदान करता है, क्योंकि यह न केवल exocytosis की वास्तविक समय ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी पूरे सेल से डेटा के त्वरित और सरल अधिग्रहण की अनुमति देता है ।
लाइव सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा FITC-dextran की ट्रैकिंग भी अन्य लाइव सेल इमेजिंग आधारित तरीकों के लिए कुछ लाभ प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) कोशिकाओं की एक फ्लोरोसेंट एसजी जांच के साथ भरी हुई है या एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त-एसजी कार्गो या झिल्ली प्रोटीन-टैग26,४१, ४२ , ४३. इस विधि की शक्ति को विशेष रूप से घटनाओं है कि प्लाज्मा झिल्ली के करीब होने की निगरानी करने की क्षमता में निहित है (इस के साथ साथ पदचिह्न के रूप में संदर्भित), इसलिए exocytic घटनाओं । हालांकि, यह भी इस विधि का दोष है क्योंकि केवल सेल अंश है कि coverglass के निकट और माइक्रोस्कोप लेंस के पास है४४imaged किया जा सकता है । क्या इस तरह के पैरों के निशान वास्तव में पूरे सेल झिल्ली की सतह का प्रतिनिधित्व अभी भी बहस४५,४६,४७है । इस संबंध में, FITC-dextran और एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप या एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ एक खुले pinhole के रूप में एक पीएच के प्रति संवेदनशील डाई का उपयोग पूरे सेल के इमेजिंग की अनुमति देता है, इस प्रकार है कि सेल में घटित कुल exocytic घटनाओं पर कब्जा.
पूरे सेल इमेजिंग या TIRFM द्वारा विनियमित exocytosis अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है कि अतिरिक्त पीएच-संवेदी रिपोर्टर एसजी कार्गो या एसजी झिल्ली प्रोटीन phlourin, एक पीएच-संवेदी GFP संस्करण से जुड़े शामिल हैं । उदाहरणों में NPY-phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin, और synapto-phluorin४८,४९,५०,५१,५२शामिल हैं । जबकि इन जांचों की अभिव्यक्ति और अधिक निकटता एसजीएस के अंतर्जात संरचना का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, यह कोशिकाओं के अभिकर्मक जरूरत पर जोर देता है, और इसलिए कम कोशिकाओं है कि transfect के लिए मुश्किल है के लिए उपयुक्त हो सकता है । इसलिए, जब कोशिकाओं है कि transfect के लिए या प्रयोगात्मक शर्तों है कि एकाधिक जीनोमिक जोड़तोड़ की आवश्यकता के तहत, एक यौगिक है कि बस सेल संस्कृति माध्यम में पूरक हो सकता है का उपयोग करने के लिए मुश्किल है अध्ययन, जैसे FITC-dextran, लाभप्रद है . FITC-dextran भी acridine नारंगी (ए ओ), एक और पीएच-संवेदनशील डाई कि लाइव सेल माइक्रोस्कोपी५३,५४,५५,५६ द्वारा exocytosis की ट्रैकिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है पर एक लाभ प्रदान करता है , ५७ , ५८. ए. ओ. ने बुलबुले के photolysis प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है कि झूठी चमक में परिणाम है, जो वास्तविक स्राव के अनुरूप नहीं है27प्रक्रियाओं. इसके विपरीत, FITC-dextran बेहतर स्राव की घटनाओं को दर्शाता है, शायद अपने कम तस्वीर के कारण प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन27के उत्पादन प्रेरित ।
विशेष रूप से, exocytosis अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक डाई की आमद ट्रैकिंग द्वारा है, बाहरी माध्यम से एसजी में फ्यूजन ताकना कि इस प्रक्रिया के दौरान खुलता है के माध्यम से. इस मामले में, डाई स्रावी ट्रिगर के साथ बाहरी माध्यम से जोड़ा जाता है । फिर, जब फ्यूजन ताकना खोलता है, डाई५९,६०एसजी में फैलाना । इस विधि का एक स्पष्ट लाभ यह है कि यह भी फ्यूजन ताकना आकार का अनुमान लगाने की क्षमता प्रदान करता है, चर आकार के रंजक का उपयोग करके । उदाहरण के लिए, विभिंन आणविक वजन के dextrans (मेगावाट), संयुग्मित विभिंन fluorophores के लिए, extracellular रंजक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जिससे dextran का अधिकतम आकार कि एसजी घुसना कर सकते है फ्यूजन ताकना५९के आकार के अनुरूप होता है, ६१ , ६२ , ६३ , ६४. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण एक पीएच के प्रति संवेदनशील जांच के उपयोग की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, एक महत्वपूर्ण नुकसान यह है कि शोर अनुपात करने के लिए संकेत बहुत कम है, डाई की एक बड़ी राशि के बाद से छवियों के अधिग्रहण के दौरान मीडिया में मौजूद है, उच्च पृष्ठभूमि में जिसके परिणामस्वरूप.
कुल मिलाकर, exocytosis के लिए एक मार्कर के रूप में FITC-dextran का उपयोग पहले से सूचना के तरीके में कई कमियां, शोर अनुपात, विषाक्तता, गतिशील ट्रैकिंग और जटिलता के लिए संकेत के रूप में काबू ।
यहां हम FITC-dextran के उपयोग का वर्णन करने के लिए RBL-2H3 मस्तूल सेल लाइन में यौगिक exocytosis की निगरानी (इस के साथ RBL के रूप में संदर्भित, मुख्य रूप से Eccleston एट अल द्वारा स्थापित । ६५ और आगे Barsumian एट अल द्वारा क्लोन । ६६), के जवाब में immunoglobulin E (IgE)/antigen (Ag) सक्रियण ।
यहाँ हम वर्णन कैसे FITC के प्रतिदीप्ति अनुरेखण-dextran एसजीएस में लोड विशेष रूप से यौगिक exocytosis घटनाओं पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस माइक्रोस्कोप की स्थापना के लिए एक छवि हर 15 सेकंड प्राप्त करन…
The authors have nothing to disclose.
हम सीडीएनए के उदार उपहार के लिए Dr. U. Ashery धंयवाद । हम डीआरएस. जी. मास, एल मिटलमैन, एम शहरबन्नी, और Sackler सेलुलर और आणविक इमेजिंग केंद्र से Zilberstein माइक्रोस्कोप के साथ उनकी अमूल्य सहायता के लिए धंयवाद । यह काम संयुक्त राज्य अमेरिका द्वारा समर्थित किया गया था-इसराइल Binational विज्ञान फाउंडेशन (आर सागी-ट्विटर, Hammel, और एस जे Galli) और अनुदान 933/15 से इसराइल विज्ञान फाउंडेशन, विज्ञान के लिए इसराइल अकादमी द्वारा स्थापित (आर. सागी-ट्विटर के लिए अनुदान २०१३२६३ ) और NIH अनुदान U19 ऐ १०४२०९ और R01 AR067145 (to S.J. Galli) ।
DMEM low glucose | Biological Inductries | 01-050-1A | |
Fetal bovine serum | Gibco | 12657 | |
Pen-strep-nystatin solution | Biological Inductries | 03-032-1B | |
L-Glutamine 200 mM solution | Biological Inductries | 03-020-1A | |
FITC dextran 150K | Sigma-Aldrich | 46946-500MG-F | |
Trypsin/EDTA Solution B | Biological Inductries | 03-052-1A | Warm in 37 °C water bath before use |
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size | Sartorius | 16534K | |
Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
DNP-HSA (Ag) | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid direct light exposure |
Hepes buffer 1M, pH 7.4 | Biological Inductries | 03-025-1B | |
CaCl2 | MERK | 102382 | |
Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
Ammonium chloride | MERK | 1145 | |
PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
NaH2PO4 | MERK | 6346 | |
NaCl | MERK | 106404 | |
MgCl2 | MERK | 105833 | |
KCl | MERK | 104936 | |
Electroporator | BTX | ECM830 | |
Confocal microscope, Zeiss | Zeiss | LSM 5 Pascal, Axiovert 200M | Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled airstream incubator |
Confocal microscope, Zeiss | Zeiss | LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 | Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled airstream incubator |
Confocal microscope, Leica | Leica | SP5 | Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab) |
RBL-2H3 cells | RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67 |