Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Imagem latente FITC-dextrano como repórter por exocitose regulada

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

Aqui detalhamos um método para a imagem latente de célula viva de exocitose regulada. Este método utiliza FITC-dextrano, que acumula em organelas lisossoma-relacionados, como repórter. Este método simples também permite distinguir entre diferentes modos de exocitose regulada em células que são difíceis de manipular geneticamente.

Abstract

Regulamentado exocitose é um processo pelo qual cargo, que é armazenado em grânulos secretórios (GV), é liberado em resposta a um gatilho secretora. Regulamentado exocitose é fundamental para a comunicação intercelular e é um mecanismo-chave para a secreção de hormônios, neurotransmissores, mediadores inflamatórios e outros compostos, por uma variedade de células. Pelo menos três mecanismos distintos são conhecidos por exocitose regulada: exocitose completo, onde um único SG totalmente funde-se com a membrana plasmática, exocitose beijo-and-run, onde um único SG transitoriamente funde-se com a membrana plasmática, e exocitose composto, onde vários SGs fundem-se com o outro, antes ou depois da fusão de SG com a membrana plasmática. O tipo de exocitose regulada empreendida por uma célula, muitas vezes é ditado pelo tipo de gatilho secretora. No entanto, em muitas células, um único gatilho secretora pode ativar vários modos de exocitose regulada simultaneamente. Apesar de sua abundância e importância do outro lado, espécies e tipos de células, os mecanismos que determinam os diferentes modos de secreção são em grande parte não resolvidos. Um dos principais desafios em investigar os diferentes modos de exocitose regulada, é a dificuldade em distinguir entre eles, bem como explorá-los separadamente. Aqui nós descrevemos o uso de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano como um repórter de exocitose e células vivas de imagem, para diferenciar entre os diferentes caminhos de exocitose regulamentado, enfocando a exocitose composto, baseado na robustez e duração dos eventos exocytic.

Introduction

Exocitose regulamentado é o mecanismo primário pelo qual prontamente fez carga é liberada a partir de uma célula secretória em resposta a um gatilho específico. A carga é pré-formada e isolada em vesículas secretoras, no qual é armazenado até um gatilho retransmite o sinal para a liberação do conteúdo do GV. Diferentes tipos de sinais podem resultar em diferentes modos de exocitose regulamentado, ou modos diferentes de exocitose regulamentado podem ocorrer simultaneamente. Três modos principais de exocitose regulamentado são conhecidos: exocitose completo, que envolve completa fusão de um único grânulo secretor com a membrana plasmática; beijo e executar exocitose, que envolve fusão transiente do grânulo secretor com a membrana plasmática, seguida por sua reciclagem; e exocitose composto, que se caracteriza pela fusão de homotypic dos vários GV antes (ou seja, multigranular exocitose) ou sequencial (ou seja, sequencial exocitose) a fusão com a membrana plasmática1. Exocitose composto é considerado o mais extenso modo de liberação de carga2, pois permite a rápida secreção de carga, incluindo o de GV que estão localizado distal da membrana plasmática. Exocitose composto tem sido documentada em ambas as células endócrinas e exócrinas3,4,5,6,7,8,9, bem como em células do sistema imunológico. Em células do sistema imunológico, tais como eosinófilos10,11,12 e neutrófilos13, composto exocitose permite a liberação rápida e robusta de mediadores que são obrigados a matar patógenos invasores, tais como bactérias ou parasitas. Mastócitos (MCs) implantar exocitose composto para a eficiente liberação de mediadores inflamatórios pré-armazenadas durante inata de respostas imunes, anafilaxia e outras reações alérgicas14,15,16 , 17. uma vez que os diferentes modos de exocitose podem ocorrer simultaneamente18,19, tornou-se um desafio para distingui-los em tempo real ou para identificar suas machineries respectivos fusão, portanto, elucidar seus mecanismos subjacentes.

Aqui nós apresentamos um método, baseado na célula viva imagem de célula carregada FITC-dextrano, que permite o rastreamento em tempo real de eventos exocytic e distinguindo entre seus modos diferentes. Em particular, nosso método permite monitoramento exclusivo de exocitose composto.

FITC-dextrano é um conjugado do fluoróforo sensíveis ao pH FITC com o dextran de polissacarídeo glucan. Dextranos fluorescente etiquetados foram mostrados para entrar na célula pela micropinocytosis20,21 e macropinocitose22,23. Como compartimentos endocítica maduro em lisossomos, mostrou que FITC-dextrano acumula-se no lisossomo com nenhuma degradação aparente. No entanto, como FITC é altamente sensíveis ao pH fluoróforo24e o lúmen do lisossomo é ácido, fluorescência FITC-dextrano sacia ao atingir o lisossoma24. Assim, estabelecendo dextranos como lisossoma direcionados a carga, juntamente com a sensibilidade de pH de FITC, lançaram as bases para o uso do FITC-dextran em estudos do lisossoma exocitose25,26,27 , 28 , 29.

Em vários tipos de células, incluindo MCs, neutrófilos, eosinófilos, as células T citotóxicas, melanossomas e outros, as SGs exibir características dos lisossomos em são classificados como organelas relacionadas lisossoma (LROs) ou secretora lisossomos30,31 . Desde LROs têm um pH ácido luminal, FITC-dextrano pode ser usado para visualizar seu exocitose, como resultado de pH mais elevado associado com a exteriorização dos LROs. Com efeito, FITC-dextrano tem sido usado para monitorar a exocitose em MCs18,32,33. Neste método, FITC-dextrano é adicionado à cultura de pilha, retomada pelas células por pinocitose e classificado para o GV. Como é em lisossomos, fluorescência FITC é saciada no GV quando eles estão dentro da célula. No entanto, após fusão de SG com a membrana plasmática e consequente exposição ao meio externo, o FITC-dextrano recupera a sua fluorescência como o SG pH sobe, permitindo que o simples acompanhamento de eventos exocytic pela microscopia célula viva. Aqui, nós ajustamos esse método para ativar o controle exclusivo de exocitose composto.

Dois outros métodos têm sido utilizados anteriormente para rastrear exocitose composto. Microscopia eletrônica foi o primeiro método para caracterizar estruturas exocytic que sugeriu a ocorrência de diferentes modos de exocitose. Em particular, as observações de "túneis secretoras" nas células acinares pancreáticas34 e MCs35,36,37 deram origem à hipótese de exocitose composto. No entanto, enquanto a alta resolução da microscopia eletrônica tem o poder de revelar vesículas fundidas, não pode acompanhar a dinâmica da sua fusão e, portanto, não é possível definir se eles correspondem a fusão SG durante a exocitose composto ou fusão dos grânulos recapturados seguindo sua endocitose. Este obstáculo é superado em outros métodos que podem medir exocitose em células vivas, tais como as medições de braçadeira do remendo da membrana plasmática da capacidade11,13,38,39 ou amperometry 40 da mídia. No entanto, remendo de aperto requer uma afinação especial e pode não ser adequado para todos os tipos de célula. Amperometry medições são capazes de rastrear exocitose somente se a carga é liberada em muito estreita proximidade com o eletrodo. Portanto, utilizando imagens de células vivas oferece uma vantagem sobre esses métodos, que não só permite rastreamento em tempo real de exocitose, mas também permite rápida e simples de aquisição de dados da célula inteira.

O rastreamento de FITC-dextran por microscopia célula viva também oferece algumas vantagens para outra célula viva métodos baseados em imagens. Por exemplo, um método amplamente utilizado é a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) de células carregadas com uma sonda fluorescente de SG ou expressando uma fluorescente com a proteína-tag SG carga ou membrana proteína26,41, 42 , 43. a força deste método reside na sua capacidade de monitorar exclusivamente os eventos que ocorrem perto da membrana plasmática (aqui referida como pegada), portanto, exocytic eventos. No entanto, isto também é a desvantagem desse método porque apenas a fração de células que fica ao lado da lamela e perto da lente do microscópio pode ser fotografada44. Se tais pegadas na verdade representam a superfície inteira da membrana celular é ainda discutível45,46,47. A este respeito, usar um corante de pH sensíveis tais como FITC-dextrano e um microscópio de fluorescência padrão ou um microscópio confocal com uma pinhole aberto permite que a imagem da célula inteira, assim, capturar os eventos de total exocytic que ocorrem naquela cela.

Repórteres de sensíveis ao pH adicionais que são usados para estudar a exocitose regulada por células inteiras de imagem ou TIRFM incluem carga SG ou proteína de membrana SG fundido a phlourin, uma variante GFP sensíveis ao pH. Exemplos incluem NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin e synapto-phluorin48,,49,50,,51,52. Enquanto expressão destas sondas pode representar mais de perto a composição endógena do GV, isso implica transfecção de células e, portanto, pode ser menos apropriado para células que são difíceis de transfect. Portanto, quando estudar as células que são difíceis de transfect ou sob condições experimentais que exigem várias manipulações do genoma, a utilização de um composto que pode simplesmente ser completada no meio de cultura de células, tais como FITC-dextrano, é vantajosa . FITC-dextran também oferece uma vantagem sobre laranja de acridina (AO), outro corante sensíveis ao pH que foi usado para o rastreamento de exocitose por célula viva microscopia53,54,55,56 , 57 , 58. AO tem sido mostrado para induzir a fotólise de vesículas que resultam em flashes falsos, que não correspondem à real secreção processos de27. Em contraste, FITC-dextrano reflete melhores eventos de secreção, provavelmente devido a sua baixa produção foto-induzida de oxigênio reativo27.

Uma abordagem alternativa para estudar exocitose é, notavelmente, seguindo-se o afluxo de um corante, do meio externo para o SG através do poro de fusão que abre durante este processo. Neste caso, o corante é adicionado ao meio externo juntamente com o gatilho secretora. Então, quando abre o poro de fusão, o corante difunde-se para o SG59,60. Uma vantagem deste método é que ele também oferece a capacidade de estimar o tamanho de poro de fusão, pelo uso de corantes de tamanho variável. Por exemplo, dextranos de peso molecular diferente (MW), conjugada com fluorophores diferentes, podem ser usados como corantes extracelulares, no qual o tamanho máximo do dextran que pode penetrar o SG corresponderia ao tamanho do poro da fusão,59, 61 , 62 , 63 , 64. Além disso, esta abordagem não requer o uso de uma sonda de pH sensíveis. No entanto, uma desvantagem significativa é que o sinal à relação de ruído é muito baixo, já que uma grande quantidade de corante está presente nos meios de comunicação durante a aquisição de imagens, resultando em fundo elevado.

No geral, o uso de dextran-FITC como um marcador para exocitose supera várias desvantagens em métodos anteriormente relatados, como sinal-ruído ratio, toxicidade, rastreamento dinâmico e complexidade.

Aqui nós descrevemos o uso do FITC-dextran para monitorar exocitose composto na linha de 3 mastócitos RBL - 2H (aqui referida como RBL, estabelecido principalmente por Eccleston et al 65 e mais clonados por Barsumian et al . 66), em resposta a imunoglobulina E (IgE) / ativação de antígeno (Ag).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. preparações

  1. Preparação de meios de cultura RBL
    1. Misturar 500 mL de glicose baixa Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) com 56 mL de soro fetal bovino (FBS), 5,5 mL de solução de penicilina-estreptomicina-nistatina, 5,5 mL de solução de L-glutamina 200 mM. Isso resulta em baixos de glicose DMEM suplementado com 10% FBS, estreptomicina 100 µ g/mL, 100 unidades/mL penicilina, 12 nistatina unidades/mL e 2 mM L-glutamina.
    2. Os meios de filtro usando um top-vácuo filtro de 0,22 µm de tamanho de poro e loja a 4 ° C.
  2. Manutenção de células RBL.
    1. Desenvolvem-se células RBL para uma confluência máxima de 90% em um prato de 10 cm. Se a cultura de células saudável, as células devem ter uma forma de fuso com protuberâncias ocasionais.
    2. Para célula dividir, separar as células do prato aspirando a mídia e substituindo com 2 mL de solução de EDTA/trypsine B. Incubar durante 5-10 minutos em um ambiente umidificado de 5% CO2 a 37 ° C.
    3. Uma vez que as células têm destacado, neutralizar a tripsina, adicionando 2 mL de meio de cultura, utilizando uma pipeta e dividir as células em um 1:2-1: relação de 10.
  3. Preparação de 20 x reserva do Tyrode
    1. Prepare um estoque de 20 x 20 mM MgCl2solução de 54 mM KCl, 2,74 M NaCl e 8mm NaH2PO4 em água bidestilada (DDW). Misture bem e armazenar a 4 ° C.

2. cultura de células RBL para microscopia célula viva

  1. Preparação da solução de dextran-FITC.
    1. Misture 1 mg de pó FITC-dextrano (150 K) por 1 mL de meio de cultura (ver passo 1.1.1). Para uma completa lamela septada, prepare-se 3 mL.
    2. Usando uma unidade de filtro de seringa de acetato de celulose com tamanho de poro 0,22 µm, filtre o FITC-dextrano dissolvido.
    3. Adicione o rato IgE a uma concentração de 1 µ g/mL.
  2. Semeadura de células RBL para a imagem latente
    1. Na véspera da imagem latente, aspirar a mídia do prato cultura e substituir com 2 mL de solução de EDTA/trypsine B. Incubar durante 5-10 minutos em um ambiente umidificado de 5% CO2 a 37 ° C. Uma vez que as células têm destacado, neutralize a tripsina, adicionando 2 mL de meio de cultura.
    2. RBL contagem células usando um hemocytometer e ajustar o volume de acordo com meios de cultura para obter uma concentração de célula de 7,5 x 105/mL.
    3. Adicione 10 µ l de suspensão de células para uma lamela septada pré-preenchido com FITC-dextrano fresca complementadas meios de cultura (isso resulta em propagação de 7,5 x 103 células em uma câmara).
    4. Desenvolvem-se células RBL durante a noite em uma humified atmosfera de 5% CO2 a 37 ° C. As células devem permanecer em um nível secundário confluente para certificar-se que as células são separadas e que é fácil de identificar cada célula individualmente sob o microscópio.
  3. Transfecção de células RBL - opcionais.
    1. Para eventos exocytic em combinação com outras proteínas fluorescente etiquetadas de imagem, consulte protocolo de Transfeccao para células RBL em Lorena et al 67

3. microscopia de célula de exocitose de viver

  1. Preparação das soluções:
    1. Preparar a solução-tampão de um final Tyrode diluindo a solução estoque em DDW em um 01:20 diluição e suplemento com pH de Hepes 20 mM 7, 1.8 mM CaCl2, 1mg/mL BSA e 5,6 mM de glicose.
    2. Recentemente, preparar um reagente de secretagogue 20 x no buffer do Tyrode [1 µ g/mL dinitrophenyl conjugada com albumina de soro humano (DNP-tem (Ag)) no nosso caso, para uma concentração de 1 x 50 ng/mL].
    3. Prepare uma solução de cloreto de amónio de 400mm, dissolvendo o pó em buffer de Tyrode.
  2. Preparação das células.
    1. Lave a lamela septadas 3 vezes por meios de comunicação da câmara de aspiração e recarga-lo com 300 µ l de tampão de Tyrode, pré-aquecido a 37 ° C. Finalmente, repor a câmara com 300 µ l de tampão de Tyrode, pré-aquecido a 37 ° C.
    2. Coloca a lamela septadas na câmara de incubadora do microscópio. Certifique-se que a câmara é estável.
  3. Configurando o microscópio
    1. Para escolher uma região de interesse para rastrear, ligue a fonte de luz fluorescente (tradicionalmente uma lâmpada de mercúrio) e escolher o filtro adequado de fluorescência (escolher o filtro para fluorophores verde para visualização FITC-dextran). Uma vez que a região de interesse está em foco e é no meio do campo de visão, desligue a fonte de luz para evitar o branqueamento foto e toxicidade.
      Nota: Alguns do FITC-dextrano incorporado nas células podem reter fluorescência. Isso ocorre porque FITC-dextran também pode ser ordenado para não-lisossomal compartimentos tais como endossomos.
    2. Liga a iluminação adequada para a excitação de FITC. Se usando um microscópio baseados em laser, ligue a 488 nm do laser. Emissões devem ser reunidas em torno de 500-550 nm (FITC picos de emissão em 510-520 nm).
    3. Quando usando um microscópio confocal, abra o pinhole ao máximo. Isto permitirá utilizar a toxicidade e menor potência de laser para evitar descoramento e irá garantir a captura de eventos de exocitose de todos os aviões da célula.
    4. Calibre o intervalo de tempo entre aquisições de imagem.
      1. Diferentes células podem variar em sua cinética da exocitose regulada68. Para imagens específicas de exocitose composto, recomendamos um intervalo de tempo pelo menos 5 segundos. No entanto, como regra geral, para permitir a rápida imagem, certifique-se que o tempo de aquisição de um único quadro é rápido.
      2. Quando usando um microscópio confocal de varredura a laser, definir a direção de varredura para bi-direcional, não permitem uma média e definir a resolução de 512 x 512 (recomendado; as último duas disposições contribuirá também para minimizar a descoloração e toxicidade).
  4. Imagem de exocitose.
    1. Células de imagem para durações desejadas, dependendo do tipo de célula ou secretagogue. Nas células RBL provocadas com IgE/Ag, a maioria dos eventos de exocytic ocorreram dentro de 15-20 min de ativação.
    2. Para a ativação das células, adicione 16 µ l do 20 x solução de secretagogue para a câmara.
  5. Confirmando a presença de FITC-dextrano nas células.
    1. Para confirmar a presença e localização de FITC-dextran para o GV, adicione 16 µ l de solução de cloreto de amónio (tenha cuidado para não mover a câmara para não perder o foco) para a câmara suavemente (isto fará uma concentração final de 20 mM). Isto irá induzir alcalinização do GV e dequenching de fluorescência FITC, que ocorrerá dentro de segundos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figura 1a representa esquematicamente como FITC-dextrano pode atuar como um repórter para regulada exocitose e recapitular os diferentes modos de eventos exocytic. Primeiro, as células são incubadas com FITC-dextrano, que é internalizada por pinocitose e classificado para o GV. Desde que o GV de MCs são LROs, seu baixo pH amortece a fluorescência de FITC, mostrado aqui como preto granulado (A-C, eu). Quando as células são acionadas por um secretagogue e o fusível do GV com a membrana plasmática, um poro de fusão é formado, permitindo efluxo de prótons e alcalinização do GV. Como consequência, FITC recobra sua fluorescência (um, II). Exocitose completo se manifestará em um curto período (menos de 5 s) fluorescente evento como membrana do SG exteriorizados desmorona totalmente na membrana plasmática e FITC-dextrano difunde-se afastado do meio de cultura (uma, III). Durante um evento de beijo e executar exocytic, membrana do SG apenas transitoriamente funde-se com a membrana plasmática, resultando em um poro de fusão de curta duração e, portanto, apenas uma breve explosão de fluorescência como o SG desconecta rapidamente e seu lúmen rapidamente re-acidifica (B, III - IV). Finalmente, durante a exocitose composto, uma série de GV sequencialmente fundem-se uns com os outros (fusão de SG seguinte), bem como com a membrana plasmática, com a manutenção de um poro aberto fusão. Como resultado, uma massa muito maior de FITC-dextrano é dequenched, resultando em uma explosão de grande e longa vida de fluorescência (C, III-IV) que decai quando a sonda se difunde para o meio externo (C, V).

Nós temos usado este modelo e confirmaram suas previsões por células de controle de imagem e as células que estão esgotadas de Rab5, que temos demonstrado para ser crucial para homotypic SG-SG fusão69 e exocitose composto33. Definindo o tempo de aquisição de uma imagem a cada 15 s, esperávamos detectar principalmente contínuos eventos de secreção, ou seja, compostos exocitose. De fato, como mostrado na figura 1B, nosso dados revelam que, enquanto no controle células muitos eventos de grande e de longa duração exocytic, pode ser gravado, apenas alguns eventos foram registrados em Rab5 knockdown células (shRab5). Além disso, eventos que foram gravados em células de shRab5 foram significativamente menores no tamanho em comparação com os eventos registrados nas células de controle. Digno de nota, a capacidade secretória das células shRab5 permanece inalterada sob a mesma condições69, sugerindo que, enquanto shRab5 inibe a exocitose composto, não aboliu secreção. Portanto, fluorescência de FITC-dextrano de imagens em intervalos de tempo permite a detecção específica de exocitose composto. Além disso, a imagem lançamento FITC-dextrano permite capturar a natureza sequencial de exocitose composto. Como indicado pela seta na Figura 1b, seguindo um flash de luz, um segundo flash começa como um flash fraco que é adjacente ao primeiro. Isto pode ser inferido como a fusão de uma SG com um SG que já está em processo de fusão com a membrana plasmática (ou seja, exocitose sequencial). Daí, como o grânulo segundo funde-se com o primeiro grânulo que já está ligado à membrana plasmática por um poro de fusão, o pH do grânulo do segundo também aumenta, e a fluorescência FITC dequenches, produzindo uma segunda explosão de fluorescência. Tal cenário de lançamento FITC-dextrano durante fusão sequencial do GV adjacente é apresentado na Figura 1C.

Outro exemplo de fusão sequencial do GV durante a exocitose composto é mostrado na Figura 2. RBL células foram co transfectadas com um formulário (CA) constitutivamente ativo de Rab5a e WT SNAP-23, condições sob qual exocitose composto torna-se mais robusta33. Imagem de Rab5a o CA, o que é essencial para a fusão de SG-SG e está revestindo grande GV33,69, juntamente com FITC-dextrano, permite melhor visualização da fusão de um grânulo menor com um grânulo de CA-Rab5a decorado a maior.

Desde FITC-dextrano é saciada quando armazenado dentro do SG, é necessário implementar uma técnica de verificação que FITC-dextran está realmente presente no GV. Isso se torna ainda mais essencial para plástico um experimento sob condições que são esperados para abolir a secreção. Para superar este obstáculo, 20 mM de cloreto de amónio foi adicionado à câmara no final de cada experimento. Este tratamento eleva o pH dentro do GV, permitindo a fluorescência FITC. Como mostrado na Figura 3, após a adição de cloreto de amónio, aos meios de comunicação, FITC dextrano torna-se visível e co é localizado com mRFP-tag neuropeptídio Y, que é um repórter de SG em RBL células70.

Figure 1
Figura 1: deteção específica de compostos exocitose. (a) um diagrama descrevendo como alterações na fluorescência FITC-dextrano recapitular os diferentes modos de exocitose regulada. (b) Live cell que Imaging do FITC-dextran em células RBL transfectada com NPY-mRFP e pSilencer ou shRab5, conforme indicado. Transfecção foi realizada como descrito anteriormente,67,70. Brevemente, 1.5 x 107 células RBL foram resuspended no buffer de transfeccao (DMEM suplementado com pH 20 mM tubos de K 7, 10 µM Ca2 + acetato de, mM 2 Mg2 + acetato, glutamato de potássio de 128 mM) contendo 15 µ g NPY-mRFP e ou 30 µ g de pSilencer ou 15 µ g de shRab5A e 15 µ g de shRab5B/C. Transfection foi alcançado por eletroporação em 300 V e um comprimento de pulso 20 mseg. As células foram imediatamente replated em meio de cultura contendo 1 mg/mL FITC-dextrano. Após 24 h, as células foram sensibilizadas com 1 µ g/mL de IgE e incubadas durante mais de 24 h. As células foram então lavadas três vezes em buffer de Tyrode completo e ativadas por 50 ng/mL de DNP-HSA (Ag). As células foram visualizadas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo. A seta branca nas imagens pSilencer aponta para uma explosão de fluorescência FITC e o círculo branco marca um SG descarregada. A seta branca nas imagens shRab5A/B/C indica minutos fluorescentes eventos que ocorrem nas células Rab5-knockdown, susceptíveis de ser indicativo de exocitose completo. Digno de nota, a intensidade da imagem ShRab5 foi aumentada para permitir a detecção do sinal. Imagens foram adquiridas por um microscópio confocal, equipado com uma câmara aquecida (37 ° C) e controlador de CO2 (4,8%) e um objetivo de Corr W C-Apochromat x63/1.2, sob a configuração de pinhole aberto. Para os filmes completo, consulte Klein et al . 33 (c) um diagrama esquemático do processo de fusão homotypic SG mostrado em (b). Em detalhe, como o primeiro SG funde-se com a membrana plasmática e estabelece um poro de fusão, ele começa a alcalinizar ao liberar seu conteúdo FITC-dextrano. Assim, quando um segundo SG funde-se com o primeiro de uma forma sequencial, a fluorescência do primeiro SG desvanece-se devido à liberação de FITC-dextrano. No entanto, o segundo SG alcaliniza, que resulta em um flash FITC que aparece adjacente ao primeiro SG. Esta figura era adaptada de Klein et al . 33 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: imagem dupla de mStr-CA-Rab5 e FITC-dextrano. RBL células foram co transfectadas com 20 µ g de HA-wt-SNAP23 e 10 µ g de mStr-CA Rab5A. As células foram pré-incubadas com FITC-dextrano e IgE e provocadas com Ag, conforme descrito na Figura 1. (a) uma série de imagens para capturar um evento de fusão entre um extinto SG (seta branca) e um SG que já se fundiu com a membrana plasmática e, portanto, é fluorescente. A 15,8 minutos, o extinto SG tem fundido com sua vizinha SG e começou a ganhar a fluorescência. As áreas de box são ampliadas no canto inferior esquerdo de cada ponto de tempo. (b) apresentação do mSTR-CA Rab5A (em vermelho) e FITC-dextrano (em verde) de pontos de tempo correspondente indicado na alínea a, demonstrando a fusão entre as duas imagens do GV. foram adquiridas pela microscopia confocal (pinhole aberto) usando um plano-apochromat x63-at 1.4 objetivo. Esta figura era adaptada de Klein et al . 33 para o filme completo, consulte Klein et al . 33 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagem dupla de NPY-mRFP e FITC-dextrano durante alcalinização do SG por NH4CL. RBL células foram transfectadas com shRab5, pré-incubadas com FITC-dextrano e IgE e provocadas com Ag, conforme descrito na Figura 1. (a) células foram visualizadas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Designado vezes nas imagens são minutos após disparo com Ag. Imagens foram adquiridas pela microscopia confocal, usando um plano-apochromat x63-at 1.4 objetivo. (b) análise quantitativa do experimento mostrado em (a). Cada linha nos gráficos é a fluorescência média de FITC em uma região de interesse (ROI) ao longo de uma única célula. A seta aponta para o tempo de NH4Cl (20mm) adição. Barras = 5 µm. Esta figura era adaptada de Klein et al . 33 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aqui descrevemos como rastreamento fluorescência do FITC-dextrano carregado em GV pode ser usada para capturar especificamente eventos exocitose composto. Isto foi conseguido, definindo o microscópio para adquirir uma imagem a cada 15 segundos, garantindo que somente os eventos de longa duração serão registrados ao longo do tempo e, portanto, excluindo eventos curtos que corresponderiam a exocitose completo ou exocitose beijo e correr. Para estabelecer o método, nós mostramos aquele nocaute das isoformas de Rab5 que são expressos nas células RBL e são fundamentais para exocitose composto, elimina a capacidade de capturar eventos de lançamento de FITC-dextrano, enquanto a secreção total pela célula não é afetada.

A desvantagem mais proeminente do método é que ele só se aplica às células contendo ácido do GV. No entanto, a vantagem mais proeminente do método é que é baseado na simples incubação das células com FITC-dextrano, sem exigir do transfection. Outros repórteres sensíveis ao pH que são usados para estudar a exocitose regulamentado e envolvem carga SG ou membrana SG proteína-fundiram a phlourin, uma variante GFP sensíveis ao pH (tais como NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin e synapto-phluorin48, 49,50,,51,52), podem mais estreitamente representam a composição endógena do GV. No entanto, sua utilização implica transfecção de células, que pode ser menos apropriado para células que são difíceis de transfect. Portanto, quando estudar as células que são difíceis de transfect ou sob condições experimentais que exigem várias manipulações do genoma, a utilização de um composto que pode simplesmente ser completada em meio de cultura de células, tais como FITC-dextrano, é vantajosa. Nosso protocolo pode exigir ajustes específicos de célula para acomodar as diferenças na cinética de exocitose de célula diferentes tipos de68. Portanto, o intervalo de tempo escolhido para aquisição de imagens deve ser otimizado. Para células RBL, temos afinação o microscópio para capturar uma nova imagem a cada 15 segundos, o que, em IgE/Ag desencadeou células RBL nos permitiu Visualizar somente eventos de longa duração, permitindo o acompanhamento exclusivo de eventos composto de exocitose.

Outro fator que precisa ser considerado é o tipo de dextran para ser usado. Uma variedade de dextranos que variam em seus pesos moleculares estão disponíveis. Portanto, é importante escolher o dextran apropriado como repórter, tendo em conta os potenciais efeitos que diferentes dextranos podem ter sobre as células. Por exemplo, dextranos de baixo peso molecular foram mostrados para ativar MCs e induzir secreção71,72,73,74. Portanto, dextranos de baixo peso molecular não seria apropriados repórteres para MC secreção. Diferenças na reatividade da célula para dextranos também se observaram em ratos de diferentes estirpes75, ou sob diferentes condições co-estimulatória71,76,77,78. Aqui, nós escolhemos usar um 150 K FITC-dextran que anteriormente foi estudado em linhagem celular RBL e demonstrou ser ineficaz na indução de secreção de18,79.

A fonte de luz a ser selecionado é também crucial para o protocolo. Quando usando um microscópio confocal, a fonte de luz é tradicionalmente baseados em laser. Assim, para evitar toxicidade, é imperativo escolher um poder do laser de baixa. A potência do laser desejado difere entre microscópios, dependendo do tipo e idade do laser. Além disso, a potência do laser desejado também é dependente do tipo de detector usado. Por exemplo, ao usar um detector comum como um detector de baseado em tubo fotomultiplicador, um laser de potência maior será necessário que ao usar um detector de híbridas modernas (como um tubo fotomultiplicador e um detector de híbrido de foto-diodos de avalanche). Recomendamos usar a potência do laser mais baixa possível e não superior a 10% da potência do laser.

Em resumo, monitoramento do dequenching de SG carregado FITC-dextrano pelo tempo que lapso-microscopia em configurações cuidadosamente escolhidas nos permitiu exclusivamente captura exocitose composto em RBL MCs, facilitando enormemente a identificação das entidades moleculares que Regule este processo. Esse método pode ser mais ajustado para distinguir cheio de beijo e executar exocitose reduzindo e cuidadosamente calibrando o intervalo de tempo entre aquisições de imagem para permitir que a distinção dos flashes curta duração associado com beijo e correr exocitose do flashes ainda mais curtos que acompanham a exocitose completo. Tais condições seriam capturar composto e beijo e executar exocitose que poderia então ser distinguida com base na duração do sinal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não declaram nenhum interesse financeiro concorrente

Acknowledgments

Agradecemos a generosa oferta do cDNA-Dr. U. Ashery. Agradecemos os Drs G. massa, L. Mittleman, M. Shaharbani e Y.Zilberstein do Sackler Cellular & Molecular Imaging Center por sua inestimável ajuda com microscopia. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de ciência Binacional EUA-Israel (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel e S.J.Galli) e conceder a Israel Science Foundation, fundada pela Academia de Ciências (para R.Sagi-Eisenberg Israel 933/15 ) e bolsas NIH U19 AI 104209 e R01 AR067145 (de S.J. Galli).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

Tags

Biologia questão 136 FITC-dextrano exocitose regulamentado composto de exocitose imagem de célula viva organelas relacionadas com lisossomo pinocitose
Imagem latente FITC-dextrano como repórter por exocitose regulada
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, O., Roded, A., Hirschberg,… More

Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter