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Biology

体外细胞生理学研究中视网膜微动脉的分离

Published: July 14, 2018 doi: 10.3791/57944
Automatic Translation
*1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4, *2
1Centre for Experimental Medicine, Queen's University of Belfast, 2Centre for Biomedical Sciences (Education), Queen's University of Belfast, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Naresuan University, 4School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University of Belfast
* These authors contributed equally

Summary

这篇手稿描述了一个简单的协议, 从大鼠视网膜分离的小动脉, 可用于电生理, 钙成像和压力 myography 研究。

Abstract

视网膜是一种高度新陈代谢的活性组织, 需要大量的血液供应。视网膜循环支持内视网膜, 而脉络膜血管提供感光细胞。视网膜灌注的改变导致许多视力障碍, 包括糖尿病视网膜病变、青光眼和视网膜分支静脉闭塞。了解通过视网膜控制血液流动的分子机制, 以及这些在眼部疾病中是如何改变的, 可能会导致确定治疗这些疾病的新靶点。视网膜动脉是视网膜的主要阻力血管, 因此, 通过管腔直径的变化, 对视网膜血流动力学调控起着关键作用。近年来, 我们已经开发出了一种从大鼠视网膜中分离小动脉的方法, 适用于多种应用, 包括细胞生理学研究。这项准备工作已经开始对如何控制视网膜的血液流动产生新的洞察力, 并使我们能够确定在眼部疾病中发生的一些关键变化。本文介绍了大鼠视网膜小动脉的分离方法, 包括用于膜片钳电生理学、钙成像和压力 myography 研究的协议。这些血管也可以用于 PCR, 西方印迹和免疫组化的研究。

Introduction

了解如何控制在视网膜上的血流量是一个重要的目标, 因为异常的血液流动已牵连到各种视力威胁的视网膜疾病的发病机制1,2,3, 4。视网膜循环, 提供内视网膜神经元和胶质细胞, 有一个结束动脉安排, 所有的血液从视网膜动脉和动脉通过毛细血管到视网膜静脉和最后静脉5。视网膜血流由视网膜动脉和动脉的色调以及视网膜毛细血管壁和后毛细管静脉6、7毛细血管的收缩活动调节;8. 视网膜血管张力的控制是复杂的, 是由循环系统和周围的视网膜组织 (包括血液气体、循环分子和荷尔蒙) 的一系列输入所调制的, 以及释放出的血管活性物质。视网膜血管内皮和 macroglia9,10,11。视网膜微动脉是视网膜的小动脉分支, 由一层血管平滑肌细胞和纵向排列的内皮细胞内衬组成,12,13, 14. 这些血管构成视网膜循环中血管阻力的主要部位, 因此在局部控制视网膜血流方面起着重要作用。视网膜微动脉通过扩张或收缩其管腔直径来调节视网膜毛细血管的血流, 通过血管平滑肌收缩10、15、16的变化介导。了解视网膜微动脉调节视网膜灌注的分子机制, 因此需要准备动脉平滑肌细胞可以在尽可能接近生理的条件下访问和研究。

体外视网膜血管的制备为血管平滑肌细胞提供了通路, 同时仍保留其功能性和与底层内皮的互联性。迄今为止, 大多数使用隔离血管的研究都侧重于大型牛或猪动脉血管 (60-150 µm)。这些可以安装在商业可用的电线或压力 myograph 系统, 以使药物审讯血管平滑肌细胞收缩机制17,18。这些准备工作极大地促进了我们对正常情况下视网膜血管生理学的认识。很少有研究使用从小实验动物中分离出来的视网膜小动脉, 因为它们的直径较小 (~ 8-45 µm) 防止了它们在常规 myography 系统19、20、21、22中的使用。然而, 使用小型实验动物的船只的一个重要好处是, 广泛提供转基因、转基因和视网膜疾病模型。小型实验动物也更适于体内干预研究。

在这里, 我们描述了简单的协议, 以隔离和 cannulating 大鼠视网膜小动脉的压力 myography 实验。还详细介绍了使用这些血管的 Ca2 +成像和电生理学协议。这些可以进一步深入了解血管平滑肌收缩力和视网膜血流的调节。

Protocol

这里所描述的所有实验都是按照1986年《英国动物 (科学程序) 法》中所载的准则进行的, 并得到贝尔法斯特女王大学动物福利和道德审查机构的批准。

1. 视网膜动脉的分离

注意: 下面的协议用于隔离视网膜动脉。本方法对大鼠视网膜小动脉进行了优化, 可用于鼠视网膜。然而, 当使用小鼠时, 血管的产量降低。

  1. 组成一个解决方案的低 Ca2 +包含汉克斯 ' (LCH), 如表 1所示。
    注: 此解决方案可存储3天, 在4摄氏度 (当使用存储 LCH, 确保它 equilibrates 室温和 pH 值是正确的使用前)。
  2. 在组织收集前组装以下设备, 确保视网膜快速显微切割: 锯齿钳、弯剪刀、解剖盘 (硅胶涂层培养皿)、单刃刀片、2套钳 (钝) 1 玻璃巴斯德吸管(火抛光到平滑但不狭窄的尖端), 1 一次性塑料吸管 (与尖端修剪, 以增加孔径 ~ 5-7 毫米), 1 玻璃圆底测试管 (5 毫升) 和持有人。醒酒约50毫升的 LCH 进入玻璃烧杯, 并准备第二个烧杯醒酒废液。
    注: 见规格和制造商详细资料表。
  3. 弄死大鼠使用 CO2后, 心脏穿刺抽血化验 (避免颈椎脱位或脑震荡, 因为这些可能会损害血管的眼睛)。用锯齿钳缩回眼睑, 然后用弯曲的剪刀绕着眼眶肌肉和视神经进行切割。轻轻地从轨道上抽出眼睛, 小心地用剪刀剪掉剩下的附件。
  4. 将眼睛浸入 LCH 溶液中, 在解剖盘上 (如有必要, 眼睛可以在冰上运输 LCH 的溶液)。用一组钝钳将眼睛固定在盘子上, 保持眼眶肌肉附着或视神经;确保锚点尽可能靠近巩膜以稳定眼睛。
  5. 使用刀片, 切开沿锯缘的角膜, 并通过用镊子轻轻地按压巩膜, 取出晶状体。
  6. 将眼杯通过光学盘对称地切成两半。使用闭合钳轻轻 ' 刷 ' 从眼罩的两个一半的视网膜, 照顾, 以消除任何其他附件在光盘。用第二只眼睛重复这个过程, 用塑料吸管和一小滴 LCH 培养基将经解剖的视网膜转移到试管中。
  7. 使用塑料吸管填充试管与 LCH 5 毫升, 并允许视网膜定居到底部。
  8. 通过从试管中除去4毫升溶液, 用塑料吸管添加新鲜 LCH, 清洗组织大约3次。如有必要, 去除多余的组织, 如悬吊韧带、玻璃体的幽默和毛发。
  9. 用 LCH 清洗玻璃巴斯德吸管 (抛光尖端) 的内侧, 防止组织粘附在吸管上。使用相同的吸管, 从试管中取出大约4毫升溶液。然后添加大约2毫升新鲜 LCH。
  10. 轻轻地将组织通过玻璃吸管的尖端, 慢慢地离解 (triturate) 视网膜, 并将其内容排出试管中。注意, 不要在这个阶段引入气泡。
  11. 重复步骤 1.10, 直到视网膜被分解为大约 2-3 毫米2的大小。
  12. 用大约2毫升的 LCH 清洗吸管的内侧, 将其排出试管中。允许内容结算到底部超过 5-10 分钟。
  13. 重复 1.10-1.12 中概述的研磨过程, 再用力一点, 直到组织片的尺寸约为1毫米2 。再次, 让组织解决 5-10 分钟。
  14. 重复步骤 1.10-1.12 第三次与更多的力量, 直到内容完全均匀化, 没有视网膜片保持 (解决方案应成为乳白色的外观)。
    注: 这项技术将产生多达 8 arteriolare 段 (相对没有周围的 neuropile 和一些分支保持完好) 每隔离测量 8-45 µm 直径和 200-2500 µm 长度。
  15. 将少量的隔离物转移到生理记录室或添加荧光染料用于测量胞内 Ca2 +浓度 ([Ca2 +]i; 见第3节)。根据当地处理动物粪便的规则, 处理隔离过程中的眼杯残留物和清除液。
    注: 在隔离后应立即对船只进行试验, 剩余的分离物可以储存在4摄氏度, 可达8小时。

2. 动脉压力 Myography

注: 动脉压力 myography 采用图 1A、 B和材料表中详细的设备进行如下操作。

  1. 将视网膜血管匀浆的整除 (1-2 毫升; 隔离为每节 1) 到生理记录室 (部分填充有名义上的 Ca2 +自由汉克斯的解决方案; 0Ca2 +汉克斯 '; 见表 1) 安装在舞台上的倒置显微镜。在试验前, 让船只在记录室底部沉降至少5分钟。
  2. 在整个记录室进行目视扫描, 以确定动脉 > 200 µm 长度, 并拥有一个开放端, 通过该容器可以空心 (在结果部分进一步探讨了容器类型的识别)。将容器定位在视野的中心。如果不存在合适的容器, 则按照步骤2.1 将另一整除的血管匀浆输送到记录室。
  3. 用细钳和小钨线滑移 (75 µm 直径和 2-4 毫米长度) 将容器的一端固定在容器上 (见图 1C(i))。要做到这一点, 握住钳中的导线, 并在录音室的上方找到镊子。
    1. 在显微镜下识别钳的相应阴影, 把镊子放到浴缸里, 直到电线变得明显。将导线从开端定位到大约200µm, 并将导线垂直于容器的长轴。
      注: 在插管和加压过程中, 钨线的重量足以咬合导管远端止流。
  4. 将动脉移动到记录腔内的适当位置, 使其在浴缸中水平放置, 并与加压套管一致 (见图 1C(ii iv))。这样做, 通过轻轻地轻推咬合钨丝滑与一个额外的部分导线在钳内举行;不要触摸动脉, 因为它将不可逆转地坚持钳。
  5. 如有需要 (对于长动脉段), 在该船只上添加额外的钨线滑块, 使该船只的闭塞和开口端之间的距离不超过200µm;这有助于防止动脉在加压时从视野中移出。如果该船只有任何侧面分支, 这些也应堵塞与额外的钨线滑移。如果一侧分支不能被遮挡, 则丢弃该容器。
  6. 灌注室与 0Ca2 +汉克斯 ' 在37°c, 以消除多余的视网膜组织和温暖的沐浴到生理温度。
    注: 标准的重力馈电浴灌注和在线加热器系统可用于这一目的 (见图 1A)。0Ca2 +汉克斯 ' 是用来促进插管程序, 因为去除外部 Ca2 +确保动脉保持扩张。
  7. 从 filamented 硼硅酸盐玻璃毛细管中制造增压套管 (尖端直径 ~ 3-10 µm 取决于容器的直径是空心的; 较小的船只需要更窄的套管; 请参阅材料表) 使用微电极拉拔和后填充 0Ca2 +汉克斯的解决方案。确保套管的小腿轻轻地向尖端倾斜, 以方便插管。
  8. 通过 Y 连接器和3路丝锥将套管安装在连接到10毫升注射器的吸管支架上;这用于对系统施加压力, 使用连接到 Y 连接器另一侧的压力计 (见图 1B) 来记录气压。
    注: 需要一个 ' 帮助 ' 吸管, 以协助插管过程。从微电极拉拔器上拔出的硼硅酸盐玻璃毛细管上制备吸管, 使其直径为 0.5-2 µm. 重的火擦亮吸管 (经常直到闭合) 使用 microforge。
  9. 使用3轴机械机械手, 小心地将辅助吸管放在直角, 靠近开口端的容器的长轴上 (见图 1D)。将助吸管放在容器上方, 但不接触它。
  10. 将插管吸管放置在容器的开口端 (见图 1D和2A(i)), 使用细机器人;根据显微镜 (20X) 调整焦距的平面, 将尖端置于开口附近。当容器的末端和套管尖端同时处于焦点时, 套管正确定位于插管 (见图 2A(ii))。
  11. 使用细机器人的 x 轴控制将增压套管推进到容器孔径中 (见图 2A(iii))。通过沿 y 轴移动套管来评估插管的成功与否。如果套管留在容器内, 它是成功的空心 (见图 2A(iv))。如果套管在容器外移动, 套管可能在容器上方;如果这样重复步骤 2.10-2.11 与套管在一个较低的平面在 z 轴。
  12. 成功插管后, 轻轻地将助吸管移到容器上, 以抑制动脉。引导动脉壁上的加压套管与帮助吸管, 同时, 因为插管吸管进一步推进到血管腔内的距离约 30-50 µm (见图 2A(v, vi))。
    注: 此过程需要同时控制移动两个机械手 (帮助吸管移向套管, 而套管进入血管腔), 并需要广泛的实践, 以达到高成功率。
  13. 将浴缸溶液改为2毫米 Ca2 + (见表 1) 在37摄氏度的正常汉克斯。通常这会导致动脉的轻微收缩, 并在加压套管周围形成紧密封。然后, 辅助吸管可以从容器中移开。
  14. 允许紧的封印开发15分钟. 使用 USB 摄像机 (和图像采集软件) 连接到显微镜并调整焦点以最大限度地提高容器边界与外部和腔内空间之间的对比度, 查看该容器 (参见图 2B)。在 0.5-5 帧/秒图像的船只。
  15. 在 0 mmHg 记录1分钟后, 通过关闭附加到加压套管的3路分路器将腔内压力增加到所需的水平 (见图 1B), 并通过注射器对系统施加少量的正压。观察压力表上的压强变化。
    注: 压力可以在一步明智的方式增加到 100 mmHg 或到一个价值例如 40 mmHg (近似视网膜动脉压力在体内)23。该船应迅速扩张确认成功插管。请注意, 压力引起的血管收缩 (i. e,肌力反应) 随后将发展15分钟, 但由于这些血管的体积小, 这可能并不总是视觉上可以检测到的。
  16. 在初始加压时仔细监测容器, 以明显泄漏。泄漏源可能来自于动脉的侧向分支或套管的密封不足。
    1. 注意离开血管的腔内内容。随着时间的推移, 随着压力的降低, 更小、更不明显的泄漏可能会变得明显。如果可能的话, 咬合用附加的钨丝卡瓦打开, 注意不要打扰套管。排除有明显渗漏的制剂进行进一步分析。
  17. 根据实验的目的 (前者允许对肌音的发展产生影响), 在 abluminally 之前或之后, 将感兴趣的药物应用于该容器上15分钟的增压, 而后者则能对效果进行分析。稳定状态的肌音)。典型的药物传递系统如图 3A所示。
    1. 将交货插座垂直于感兴趣的容器部分 (如图 1D所示), 距离500µm 远离感兴趣的容器, 以确保出口的最佳角度完全 superfuse 区域 (见图 3B)。确保灌注的变化不会在物理上扰乱血管。
  18. 实验完成后, 应用 0Ca2 +汉克斯10µM wortmannin (肌球蛋白轻链激酶抑制剂) 的解决方案, 最大限度地扩张血管以确定无源直径。
    注: 通过将腔内压力提高到 > 100 mmHg, 可以在实验结束时对插管密封的强度进行测试。即使在这个压力很大的情况下, 大部分船只仍会附着在密封处。
  19. 使用边缘检测进行离线分析以跟踪动脉直径的变化 (参见推荐软件的材料表)。将动脉直径标准化为无源直径, 以进行容器比较。

3. Ca2 +成像

注: 为常规 (microfluorimetry) 和共焦钙2 +成像 (使用材料表中详述的设备) 制备隔离视网膜动脉。

  1. 在5毫升玻璃试管中准备视网膜组织匀浆, 如1节所述。1毫升的视网膜匀浆添加 Fura-2AM (microfluormetric 钙2 +记录) 或 Fluo-4AM (共焦钙2 +成像), 使最终浓度5µM (保护免受光);染料指标优先加载到平滑肌细胞。
  2. 保持在室温下, 在黑暗中2小时, 每 15-20 分钟弹一边, 以重新暂停视网膜组织。此后, 用 LCH 溶液稀释匀浆 1:4, 以减少进一步的染料负荷。
    注: 船只仍可维持6小时 (储存在4摄氏度和黑暗中);但是, 建议尽快开始实验, 以减少染料在内部细胞器中的分裂作用, 或随着时间的推移染料的挤出。
  3. 将 1-2 毫升的视网膜匀浆转移到一个玻璃底记录室 (部分填充 LCH) 安装在与 Ca2 + microfluorimetry 或共聚焦显微系统相连的倒置显微镜的舞台上。
    1. 锚动脉垂直于整个记录室的流动方向, 钨线滑移 (50 µm 直径, 2-4 毫米长度) 间隔 ~ 100-200 µm 沿容器长度分开 (参见图 3C), 使用类似的技术来描述在步骤2.3 中。
  4. 灌注与正常的 Ca2 +汉克斯的解决方案在37摄氏度的浴缸。如图 3C所示, 放置药物递送插座, 并将药物应用于步骤2.17 所述的容器。
  5. 对于常规的 Ca2 +成像, 通过一个油浸泡紫外线目标 (如100X, NA 1.3), 通过光子计数光电倍增管 (PMT) 在 510 nm 处收集发射荧光, 以340/380 纳米光照射船只。
  6. 在每个实验结束时, 用含有 MnCl 的溶液淬火容器来测量背景荧光 (见表 1)。使用背景校正荧光比 (R-F340/F380) 进行分析或转换为胞内 Ca2 + ([Ca2 +]i) 使用 r最小和 r最大测量 (见表 1; 淬火前应用24) 和 Grynkiewicz 方程25。
  7. 对于共焦2 +成像, 激发 Fluo-4 加载的船只在 488 nm 和捕获的结果荧光发射在 490-535 nm 的任何线扫描模式 (xt) 或 xyt 扫描模式 (512 x 512 像素; 建议针孔 300 nm)。规范化测量的荧光记录在时间 t=0s (f/f0)。使用图像分析软件评估在药物应用期间 (Ca2 +]i中的任何变化, 或在特定感兴趣的区域 (ROIs) 中加压离线。
  8. 如果需要, 执行 Ca2 +成像与压力 myography。
    注: 以上描述已为非加压容器优化;然而, 可以将 Ca2 +成像与压力 myography 结合如下。
    1. 根据1节隔离动脉。负载与 Ca2 +指示染料按步骤 3.1-3.2。将微动脉转移到记录室, 并按2节 cannulate。在安装过程中要注意限制暴露在光线下。
    2. 根据上面的步骤3.5 或3.7 度量 Ca2 + 。对容器加压, 并重复测量 Ca2 +.同时测量容器直径取决于所使用的 Ca2 +测量和设备的模式。
      注: 对于共焦的 Ca2 +测量, 可能需要图像分开的区域前和后增压由于染料漂白的长期暴露于光。

4. 膜片钳电生理学

注: 全细胞和单通道记录是可能的个别动脉平滑肌细胞仍然嵌入在他们的父母动脉如下 (使用设备详细的材料表)。

  1. 如步骤1、2.3 和3.3 所述, 在记录室隔离和锚定视网膜微动脉。对于膜片钳记录, 钨线滑移间隔 200-800 µm 沿船分开。
  2. 去除动脉和电拆相邻平滑肌细胞和底层内皮细胞的基底层, 在贴片夹紧前。要做到这一点, superfuse 的容器与一系列的酶解 (表 1) 在37摄氏度的要求持续时间。
    注: 对大鼠视网膜小动脉 (蛋白酶, ~ 8 分钟, 胶原酶, ~ 12 分钟) 的酶暴露持续时间进行了优化, 并取决于药物输送系统的流速 (约1毫升/分) 和所用酶的单位活动。
  3. 评价胶原酶步骤中内皮和平滑肌层的视觉分离的消化水平, 如图 4所示。一旦观察到细胞层的分离 (如图 4B所示), 应用 DNAse I 溶液 (~ 4 分钟), 然后用正常的 Ca2 +汉克斯溶液取代浴液来终止消化。
  4. 通过仔细清扫沿容器表面的细钳闭合的尖端, 除去任何剩余的基板和/或外围 neuropile。
  5. 拉和抛光玻璃毛细血管 (材料表), 填充吸管溶液 (表 1), 并安全地放置在膜片钳 headstage 的吸管持有者。将吸管放置在45°角上, 与记录室相对应, 并使用机动机器人上的粗设置将其推进到容器上。
  6. 选择从血管壁凸出的平滑肌细胞, 其表面没有可见的碎片 (见图 4B)。将贴片吸管的尖端垂直放置在感兴趣的细胞上, 并逐渐降低, 使用机器人的细/慢运动与平滑肌膜接触。
    1. 通过在采集软件中使用膜 (密封) 测试协议 (5-10 mv 负步骤, 从 0 mv, 频率25赫), 从细胞运动的视觉上评估细胞和吸管之间的接触, 以及测量出的吸管阻力的变化; 见图 5A(i)).
  7. 当密封电阻增加5倍 (例如,从2上升到 10 MΩ;图 5A(ii)) 通过 y 形连接器、3路水龙头、注射器和导管附着在吸管托架上, 将负压瞬态应用于吸管支架的背面 (与在微动脉加压中使用类似的方式组装), 见图 1B)。
  8. 重复应用负压直到 gigaseal (> 1 GΩ电阻; 如在采集软件中的膜测试所示) 形成 (图 5A(iii))。注意, 这个过程可能需要 1-5 分钟。如果一个 gigaseal 无法形成, 选择一个不同的细胞修补钳使用新鲜的贴片吸管。
  9. 根据正在执行的实验 (通常为0、-40 或-80 mV), 通过采集软件对单元格应用保留电位。
  10. 在当前配置中研究 (单元格) 单通道活动。另外, 在 gigaseal 形成后, 通过快速缩回细胞表面的贴片吸管来产生内出斑块。
    1. 由于膜的自由端可以在这些条件下重新退火, 通过机械手的快速垂直运动 (粗设置) 将吸管从浴缸中取出。迅速返回通过半月板, 以去除改造后的膜只留下补丁内的吸管尖端。
  11. 将采集软件上的采样频率设置为5赫, 并激活连续记录模式以记录通道活动。应用任何电压变化, 如果需要通过软件或放大器。
  12. 如有需要, 如步骤2.17 所述, 将药物应用于容器/膜修补程序。
  13. 如果需要膜拉伸, 使用通过3路水龙头和 y 连接器连接到压力计的注射器, 对吸管的后部施加负压。
  14. 根据标准程序, 分析单通道记录的开放概率和酉电导率26。
  15. 对于整个细胞电流记录拉和抛光吸管根据材料表, 填充含有两性霉素 b 的吸管溶液 (添加3毫克的两性50µL 的二甲基亚砜; 将3-6 µL 添加到1毫升的全细胞吸管溶液中; 油脂实验混合)按步骤 4.6-4.9 形成密封。
  16. 由于两性霉素 B 的包含, 没有必要在吸管尖端的膜破裂, 以获得整个细胞的访问。监控接入, 将逐步获得, 使用膜测试协议在采集软件 (-20 mv 步骤从-40 mv, 采样频率25赫; 见图 5B)。
  17. 某些软件中电容瞬变的自动拟合产生了访问电阻和电池电容的实时测量 (或者, 瞬态的相对衰减可以用眼睛来评估)。一旦进入电阻降到 < 15 MΩ, 执行系列电阻补偿 (图 5C) 使用全细胞参数表盘 (电容和串联电阻) 的放大器。
    1. 为此, 请使用自动管接头值初始设置刻度盘 (请参见图 5C(ii)), 然后增加串联电阻补偿表盘 (如果放大器上有可用的预测和校正) 重新调整整个电池补偿同时减少电容瞬态 (见图 5C(iii))。
    2. 注意不要过度补偿 (如图 5C(iv) 所示)。通常, 有可能在穿孔补丁模式下对串联电阻进行75% 的补偿 (要求将滞后补偿设置在最大值)。
  18. 如果没有可用的自动管接头, 请首先将整个单元格参数拨为 15 pF 和 15 mΩ (这些单元格的典型值), 然后调整以生成输出, 如图 5C(ii) 所示。将系列电阻补偿表盘增加到 ~ 75%, 并根据图 5C(iii) 调整全单元参数刻度盘。
  19. 在开始试验之前, 请注意电池电容的测量, 无论是从最初的自动配件或从拨号后手动补偿。
    注意: 此值用于将电流正常化为单元格大小。对串联电阻的补偿可能需要在试验期间进行调整, 因为由于进一步将两性霉素 B 纳入修补程序, 进入可能会继续改善。
  20. 如步骤2.17 所述, 将药物应用于容器。根据实验要求应用电压协议 (步骤或坡道)。
    注: 典型的电压步进协议, 持续时间为 0.1-1 秒, 是从持有电位在 10-20 mV 增量每 5-十年代, 以产生一个家庭的电压激活电流。或者使用坡道协议来测量在一个 ' 扫 ' 的一系列电压的电流, 通过缓慢地将电压 (100-200 mv/秒) 从例如, -80 到 +80 mv (应用每 5-10 s) 与离线采样的电流在 10 mV 间隔期间在坡道。
  21. 可以将 Ca2 +成像与补丁钳录音相结合, 如下所示。根据1节隔离动脉。负载与 Ca2 +指示染料按步骤 3.1-3.2。按第4节装入记录室。在这些过程中, 注意限制暴露在光线下。
    注: 到目前为止, 由于在酶解离过程中基底膜和容器完整性的丧失, 使得膜片钳与压力 myography 研究无法结合

Representative Results

图 6A显示了大鼠视网膜血管树的示意图。通过对大鼠视网膜全装制剂的共聚焦成像, 对一阶 (30-45 µm)、二阶 (20-30 µm) 和前毛细血管小动脉 (8-20 µm) 的直径范围进行了实验证实免疫组化标记对于α平滑肌肌动蛋白 (图 6B)。视网膜脱离后, 可根据其口径和血管平滑肌细胞的排列, 确定原发性、二次和前毛细血管小动脉。在明亮场显微镜下, 第一和第二阶小动脉在视觉上看起来相似, 但可以根据其大小进行区分 (图 6C)。前毛细血管小动脉是制备过程中最小的动脉血管, 由于血管平滑肌纤维的稀疏排列, 其易辨认。孤立的动脉可以清楚地区分从毛细血管和静脉内隔离。毛细血管是明显的网状小口径 (4-10 µm 直径) 的船只, 而静脉是薄壁和缺乏平滑肌细胞覆盖 (图 6C)。原发性, 二次和前毛细血管微动脉适用于压力 myography, Ca2 +成像和膜片钳研究。

图 7显示了一个压力 myography 实验, 其中一个主要的大鼠视网膜动脉被空心和腔内压力上升到 40 mmHg。动脉在这个压力下保持, 以允许在增加 0Ca2 +汉克斯 ' 10 µM wortmannin, 以获得血管的被动直径之前, 肌音的发展。图 7A显示了实验过程中不同时间点动脉的显微照片。图 7B使用定制的边缘检测软件27绘制了一个完整的时间-路线记录, 显示了随时间推移船只直径的变化。立即加压后的血管扩张, 然后是一个活跃的肌性收缩, 达到稳定状态的水平后15分钟. 添加 0Ca2 +汉克斯 '/wortmannin 溶液扩张船回到一个类似的水平在初始压力步骤后立即观察到。如上所述, 药物可能会被应用到血管加压之前或之后, 以调查在这些血管的发展和维持肌音的基础机制。使用这种方法, 我们以前已经表明, 伸展激活瞬态受体电位辣椒 2 (TRPV2) 通道和 l-和 T 型电压门控 Ca2 +通道发挥中心作用, 促进肌音的发展在第一和二级大鼠视网膜小动脉20,21,22。我们还报告说, 大电导 Ca2 +活化钾通道 (浅滩通道)19,28和 Kv1-含电压门控 K+通道的行为, 以反对肌活动这些血管, 因为每一个这些通道添加特定抑制剂触发血管收缩 (图 7C)。

图 8显示了在接触收缩肽 endothelin-1 (Et-1) 之前和之后视网膜微动脉的常规和共焦钙2 +成像的例子。在常规的 fura-2-based 记录 (图 8A) 中, Et-1 (10 nM) 引起视网膜动脉平滑肌层中 [Ca2 +]i的双相增加, 包括一个初始瞬态分量, 其次是一个较低的持续组件。我们以前的特点是瞬态和持续的成分是由于 ca2 +释放从内质网和 Ca2 +从细胞外空间的流入, 分别为29。Fluo-4-based 共焦2 +成像提供了一个更详细的图片 Et-1 在细胞水平的影响。在这些实验中, 很明显, 在我们的 microfluorimetry 研究中观察到的全球 [ ca2 +] 的平滑梯度变化是由 Et-1 激发重复异步 [ca2 +]i的激活而产生的。邻近视网膜动脉平滑肌细胞在血管壁上的振荡 (图 8B, C;30)。

图 9显示了来自视网膜动脉平滑肌细胞的单通道和全细胞贴片钳记录的例子。到目前为止, 我们已经进行了在细胞和内出单通道补丁钳录音22,28。图 9A, B 举例来说, 显示在膜拉伸之前和之后的细胞贴片钳的记录 (由施加负压到贴片吸管产生)。此特殊修补程序包含两个通过机械拉伸激活的通道。我们以前证明, 这些电流可以被抑制使用 TRPV2 通道孔阻断抗体22。通道的酉电导 (249.71 pS) 也与这些电流被 TRPV231的介导相一致。

利用电压阶跃协议可以诱发全电池电压激活电流。图 9C显示了使用这种方法记录的电压激活的 a 型 K+电流的系列。当这些细胞中存在的其他大电流 (例如,浅滩和 Ca+活化的 Cl 电流) 被用特定的药理剂32、33阻断时, 这些电流就变得明显了。电流通过非或微弱电压依赖离子通道通常检查使用电压坡道协议。我们使用这样的协议来识别和表征 TRPV2 电流激活的低张伸展22和通道激动剂 (图 9D) 在视网膜动脉平滑肌细胞。

图 10显示双压力 myography 和共焦钙2 +成像应用于原发性大鼠视网膜动脉。加压触发的频率增加 [Ca2 +]i振荡的个体平滑肌细胞类似那些观察与 Et-1。我们以前已经表明, 这些振荡是由 ca2 +火花 (本地化的 ca2 +发布事件) 的总和触发的, 并有助于生成肌音20。

Figure 1
图 1.大鼠视网膜小动脉压力 myography 的实验设置.A) 实验设备, 包括倒置显微镜、浴缸灌流液的在线加热器、3轴机械和微型机械手、压力计、套管架和空气表。B) 示意图, 显示记录室中 cannulating 吸管和感兴趣的容器的最佳排列。该图还说明了增压设备的基本设置。C) 示意图显示了用细钳夹持的附加钨线卡瓦锚固和移动船只的过程。(i) 将1的st滑动咬合船只。(二、三)使用附加的滑移, 以微移的咬合滑移 (箭头指示的方向) 和附带的船只进入最佳方向显示 (iv)。D) 示意图, 显示在插管前安排的与容器有关的咬合钨线滑移、助吸管和套管的最佳定位。药物输送系统的出口位于离船500µm 的距离, 以减少药物应用过程中的运动工件。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.压力 myography 的插管过程.a) 显微照片显示在 (i) 之前, (ii)-(v) 和插管 (vi) 后在录音室中锚定的视网膜动脉。蓝色箭头指示套管的移动方向, 而绿色箭头指示帮助器吸管的移动方向。B) 显微照片显示在加压中以红色突出显示的肌内活动记录的最佳区域。注意, 调整光线和焦点以增加容器壁的对比度, 可以更好地跟踪船只边缘, 进行自动分析。刻度条指示50µm.请点击这里查看这个数字的大版本。

Figure 3
图 3.送药.A) 用于提供药物的设备, 显示与多通道输送歧管相连的溶液储层, 由3路丝锥控制, 并附着在3轴机械机械手上。B) 图显示了药物输送歧管与记录室的最佳垂直定位。C) 显微照片在记录室抛锚的船只, 显示出药物出口的理想定位。缩放栏代表100µm.请点击这里查看这个数字的大版本。

Figure 4
图 4.酶消化视网膜小动脉修补钳记录。视网膜动脉的光显微照片 (a) 和后 (B) 酶消化。注意平滑肌细胞 (SMCs) 与底层内皮细胞 (ECs) 的物理分离 (由箭头表示)。适用于贴片夹紧的平滑肌细胞用星号表示。缩放栏代表10µm.请点击这里查看这个数字的大版本。

Figure 5
图 5.单通道和全细胞贴片钳记录.A) 在 "密封试验" 协议期间观察到的测试电流的说明: (i) 贴片吸管进入外部沐浴培养基, (ii) 吸管尖端接触血管平滑肌细胞血浆膜, (iii.) 吸力是适用于吸管的背部, 使 gigaseal 形成。在使用膜片钳放大器的吸管电容补偿后, 单通道电流现在可以在细胞配置中记录下来, 或者通过快速取出吸管来创建一个 ' 内出 ' 补丁, 可以切除膜片。B) 在应用两性霉素 b 全细胞穿孔膜片钳技术时, 与细胞内部电通路发展有关的当前变化 (一): (ii) 两性霉素 b 分割成膜, 进入电阻下降和电容瞬变在极化电压步骤 (从-40 到-60 mV) 变得更大;(iii) 一旦进入电阻 (Ra) 下降到 < 15 MΩ, 通常需要 5-10 分钟后 gigaseal 形成, 试验是可能的。C) 在全细胞记录之前, 必须使用膜片钳放大器上的相关刻度来补偿接入电阻和电池电容。通过膜片钳软件中的自动功能提供的访问电阻和电池电容的值可用于指导此过程: (i) 显示在 B (iii) 突出区域的补偿之前的电容瞬态;(ii) 显示在补偿接入电阻和电容时, 通常观察到的电容瞬态减少;(iii) 系列电阻补偿应改正至 75%, 并对接入电阻和电容补偿进行微调, 使所产生的瞬态在高于和低于当前高原水平的这一步。(四) 应注意确保接入电阻不超过补偿 (由瞬态的 "铃声" 显示), 有时如果在实验过程中继续改进, 则可能发生这种情况。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6.离体大鼠视网膜小动脉的鉴定。A) 图示显示大鼠视网膜微血管树的排列。B) 大鼠视网膜小动脉和静脉的共焦图像在αSMA (红色; 细胞核染色蓝色; 缩放条代表50µm)。C) 1°、2°和前毛细血管小动脉的光显微图, 毛细管网络和静脉 (鳞片棒代表10µm)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7.动脉压力 myography 录音。a) 空心视网膜动脉的图像显示 (i) 休息直径 (约35.6 µm), (ii) 加压后膨胀, (iii) 肌血管收缩的发展和 (iv) 膨胀由于增加了10µm wortmannin 在 0Ca2 +汉克斯的解决方案。缩放栏代表10µm. B) 时间路线情节的船只直径的完整实验显示在 A (抽样2.5 帧/秒)。C) 在稳态肌音 (直径38.7 µm) 下不同动脉的直径迹, 显示 Kv1 通道抑制剂 correolide (10 µm) 和浅滩通道抑制剂 iberiotoxin (100 nM) 的影响 (取样于0.5 帧/秒)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8.Et-1 对 [Ca2 +] 的影响我大鼠视网膜小动脉信号活性的实验。A) 常规 fura-2-based 记录, 显示 Et-1 (10nM) 对全球 [Ca2 +]i的影响。基部 [Ca2 +]我是82毫微米在这个1°动脉。B) Fluo-4-based 共焦图像显示 Et-1 对 [Ca2 +]i在细胞水平上的影响。C) 标准荧光强度 (f/f0) 的图, 在 B 中标记的细胞中测量。这个数字已经从 Tumelty等。30以允许。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 9
图 9.大鼠视网膜动脉平滑肌细胞的单通道和全细胞贴片钳位记录。a、 b) 在 (a) 和 (b) 期间, 从同一膜贴片上的单通道录音, 将负压 (-45 mmHg) 应用于贴片吸管。该修补程序中存在两个通道 (酉电流 12.81 pA; 酉电导率 249.71 pS), 在拉伸条件下活化作用显著增加。从上部面板 (i) 中选取的区域在下部面板 (ii) 的较快时间基础上显示。C) A 型 K+通道电流 (i) 的系列记录在全细胞模式中, 在浅滩和 Ca2 +激活的 Cl 通道抑制剂的存在下, 引起响应 20 mv 电压步长增量之间-80 mv 到 +80mV (二)。D) 在-80 mv 和 +80 mv 之前 (黑线) 和 (红线) 应用 TRPV2 通道激动剂 delta-9-tetrahydrocannabinol (Δ9) 期间, 由电压坡道引起的整个细胞电流 (i)。所用的电压坡道协议显示在下面板 (ii)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 10
图 10.2 +共焦成像在大鼠视网膜动脉加压前和之后.代表共焦扫描 (i) 的视网膜动脉平滑肌细胞下 (A) 非加压和 (B) 加压条件获得从不同地区的同一船只。(二) 按时间绘制的 (i) 所示, 在单个细胞 a e 中记录的规范化荧光 (f/f0) 的变化。星号表示单个亚细胞 ca2 +火花, 增加的频率后加压和 summate 触发细胞 Ca2 +振荡。请单击此处查看此图的较大版本.

复合物 (mM) 低钙2 +汉克斯 ' 0Ca2 +汉克斯 ' 普通汉克斯 分离酶蛋白酶 分离酶胶原酶 分离酶 DNAse 淬火液 Rmin 解决方案 Rmax 解决方案 细胞附细胞外液 细胞连接的吸管溶液 全细胞胞外液 全细胞吸管溶液
纯净水 (电阻) ≥15 MΩ厘米 ≥15 MΩ厘米 ≥15 MΩ厘米 ≥15 MΩ厘米 ≥15 MΩ厘米 ≥15 MΩ厘米 ≥15 MΩ厘米 ≥15 MΩ厘米 ≥15 MΩ厘米 ≥15 MΩ厘米 ≥18 MΩ厘米 ≥15 MΩ厘米 ≥18 MΩ厘米
Nacl 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140
氯化钾 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 138
d-葡萄糖 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
氯化镁2 1。3 1。3 1。3 1。3 1。3 1。3 1。3 1。3 1。3 1。3 1。3 1。3 1
HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
CaCl2 0。1 2 0。1 0。1 0。1 10 2 2 2 0。2
EGTA 4 0。5
MnCl 10
Ionomycin 0.01
Koh 140 130
d-葡萄糖酸 130 130
氢氧化钠 10
Penitrem A 0.0001 0.0001 0.0001
4-氨基吡啶 10
尼莫地平 0.01 0.01
氟 西 汀 0。1
9-蒽酸 1
两性霉素 B 300-600 微克毫升-1
蛋白酶型 XIV ~ 0.01% (0.4-0.6 mg/40 毫升)
胶原酶1A 型 0.1% (6 mg/60 毫升)
DNAse 我 20 KU (20 ul 1 亩/毫升库存20毫升)
Ph 7。4 7。4 7。4 7。4 7。4 7。4 7。4 7。4 7。4 7。4 7。4 7。4 7。2
滴定与 氢氧化钠 氢氧化钠 氢氧化钠 氢氧化钠 氢氧化钠 氢氧化钠 氢氧化钠 氢氧化钠 氢氧化钠 三 三 氢氧化钠 Koh

表 1.试验中所用溶液的组成, 包括用于单通道 (TRPV2) 和全电池 (A 型) 电流的外部和吸管溶液的例子。

Discussion

上面所述的协议需要实践, 但在进行最小故障排除时应该可以实现。在平均的一天, 我们将获得 6-8 可用的动脉从隔离和实现 3-4 成功的实验。但是, 如果遇到问题, 可以采取一些步骤来帮助提高成功率。有时我们发现, 特别是当使用小鼠 (< 8 周), 小动脉的产量可能是低的。为了规避这个问题, 我们建议离心视网膜组织 (10-三十年代在 500 x g) 之间的每个步骤 1.12-1.14 步研磨。这通常有助于提高血管的产量, 但也会增加在制剂中的细胞碎片数量。

当 cannulating 容器为压力 myography 研究, 重要的是检查的微动脉的任何侧面分支, 可能已被切割接近分岔地点。这是在试验过程中造成渗漏和压力损失的常见原因。[Ca2 +]i协议可能出现的主要问题是染料加载的水平。不良的染料负载导致低信噪比, 而超载导致正常 Ca2 +稳态的中断。为了减少上述任一问题的可能性, 可以去除小整除的视网膜匀浆, 并在装货协议期间定期检查隔离血管。在进行膜片钳实验时, gigaseal 形成的成功率高度依赖于基底叶片的消化率。当最初测试这个协议或使用新的大量的酶, 可能需要调整酶消化的浓度/持续时间。仔细监测内皮和平滑肌层的分离将确保足够的消化, 以消除足够的基础层流, 以获得进入。仔细的监测也是必要的, 以避免过度消化, 这可能表明, 当船只开始收缩。如果发生这种情况, 平滑的肌肉细胞往往过于脆弱的补丁钳录音。在应用酶时, 必须包括 DNAse I, 以确保在隔离过程中清除从受损细胞中释放出来的 DNA 链。DNA 片段是粘性的, 导致钳在清洁过程的最后阶段 (步骤 4.4) 中坚持动脉, 经常导致船只损失。对容器的清洗技术上是困难的, 最好是在高放大率 (20X) 的情况下, 用最合适的尖端直径的闭合钳进行温和清扫运动。在清扫之间, 用实验室卷清洁镊子。

正如前面所强调的, 这篇手稿中概述的各项议定书的发展背后的一个主要动机是更好地理解为什么视网膜血管疾病中的血液流动被打乱。迄今为止, 我们的大部分工作都集中在糖尿病眼病28,33。用1节所述方法, 可以从糖尿病实验性啮齿动物模型的视网膜中分离出微动脉。在对糖尿病动物的孤立性视网膜小动脉进行实验时, 重要的是要密切复制血管在体内所经历的高血糖条件。因此, 我们通常会提高我们的隔离和实验解决方案的 d-葡萄糖水平为25毫米。血管基底膜增厚是34、35糖尿病视网膜血管中公认的现象。当使用长时间糖尿病 (> 1 月疾病持续时间) 的动物时, 经常需要增加酶浓度或消化时间, 以使膜片钳记录方法得到应用。

使用体外孤立的视网膜微动脉研究视网膜血管生理学和病理生理学的一个重要局限性是周围视网膜 neuropile 的丢失。尽管视网膜胶质细胞和神经细胞的去除使视网膜血管平滑肌细胞容易进入细胞生理学研究, 但血管对血管活性介质的反应在视网膜的缺失和存在时会发生显著变化。组织。例如, 腺苷三磷酸盐 (ATP) 的作用为这一点提供了一个很好的例证。在孤立的大鼠视网膜小动脉, ATP 的增加触发了血管的强健收缩36, 而在一个完整的 neuropile 存在, 血管扩张37。因此, 在可能的情况下, 我们通常会尝试用体外视网膜全支架和体内测量血管直径和血流量16、37来验证我们分离的动脉制剂的主要发现。.值得注意的是, 最近出现的新方法研究的小动脉和毛细血管在整个灌注猪视网膜前体 38,39。这种制剂可能会大大提高我们对视网膜 neuropile 调节视网膜动脉和毛细管音的理解, 以及视网膜血流动力学的变化如何调节视网膜的神经元活动。

虽然本文所描述的程序主要是利用孤立的大鼠视网膜小动脉来了解动脉平滑肌细胞生理学, 我们目前正在开发的协议, 也使研究内皮细胞功能在这些船只。在初步工作中, 我们已经成功地修改了视网膜动脉段的酶消化, 以产生可行的内皮细胞管, 适合于 Ca2 +影像学和 patchclamp 记录研究。插管的两端孤立的动脉, 使腔内分娩的药物, 将来也可以使血管内皮依赖性的舒张反应, 在这些血管中进行调查。

Disclosures

乔安娜柯恩博士现在是美敦力 (美国明尼苏达州的双胞胎城市) 的雇员, 她目前的工作与这里提出的不冲突。

Acknowledgments

本文件所述各项议定书的拟订得到下列供资机构的赠款的支持: BBSRC (BB/I026359/1), 争取视力 (1429 和 1822), 青少年糖尿病研究基金会 (2-2003-525), 威康信托基金 (074648/Z/04),英国心脏基金会 (PG/11/94/29169), HSC R & D 分裂 (STL/4748/13) 和 MRC (MC_PC_15026)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers Fisherbrand 15409083 Or any equilavent product
Curved Scissors Fisher Scientific 50-109-3542 Or any equilavent product
Disposable plastic pipette/ transfer Sarstedt 86.1174 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture
Dissecting microscope Brunel Microscopes LTD Or any equilavent product
Forceps World Precision Instruments Dumont #5 14095 Any equivalent fine forceps
Pasteur pipette Fisherbrand 11546963 Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip
Petri dish Sigma-Aldrich P7741 Or any equilavent 10cm product
Pipette teat Fisherbrand 12426180 Or any equilavent product
Purified water supply Merek Milli-Q Integral Water Purification System Or any equilavent system
Round bottomed test tube Fisherbrand 14-958-10 B 5 mL; any equilavent product
Seratted forceps Fisher Scientific 17-467-230 Or any equilavent product
Single edge blades Agar Scientific T585 Or any equilavent product
Sylgard Dow Corning 184 Or any pliable surface 
Testtube rack Fisherbrand Derlin 10257963 Or any equilavent product
Pressure myography
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  x2 (or any equilavent product)
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Analysis software  Image J https://downloads.imagej.net/fiji/ Free imaging software
Analysis plugin Myotraker  https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 Custom plugin for imageJ Freely available for download
Cannulation pipette glass World Percision instruments TW150F-4 Or any equilavent product
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
Fluo-4-AM Thermo Fisher Scientific F14201 Make 1 mM stock in DMSO
Forceps World Precision Instruments Dumont #7 14097 Any equivalent fine forceps
Fura-2-AM Thermo Fisher Scientific F1221 Make 1 mM stock in DMSO
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
Helper pipette glass World Percision instruments IB150F-3 Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclypse TE 300 Or any equilavent product
Manometer Riester LF1459 Or any equilavent product
Microelectrode puller Sutter instruments P97 Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope Glassworks Fine Point F-550 Or any equilavent product
Micromanipulator Sutter instruments MP-285 Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder Molecular Devices 1-HL-U Or any equilavent product
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W558818 75μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Or any equilavent product
USB camera  Logitech  HD Pro Webcam C920 Or any equilavent product
Video capture software Hypercam version 2.28.01 Or any equilavent product
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Patch clamping
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  Or any equilavent product
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve)
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200a Or any equilavent product
Analogue digital converter Axon Digidata 1440A Or any equilavent product
Collagenase Type 1A Sigma-Aldrich C9891  0.1mg/mL in LCH
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
DNAse I Millipore 260913 Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) 
Faraday cage Custom made Any equilavent commerical product
Fine forceps Dumont No. 7 Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
Headstage Molecular Devices CV203BU Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclypse TE 300 Or any equilavent product
Microelectrode puller Sutter instruments P97 Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope Glassworks Fine Point F-550 Or any equilavent product
Micromanipulator Sutter instruments MP-285 Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Patching software Molecular Devices Pclamp v10.2 Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder Molecular Devices 1-HL-U Or any equilavent product
Protease Type XIV Sigma-Aldrich P5147  0.01mg/mL in LCH
Single channel pipette glass World Percision instruments IB150F-3 Or any equilavent product
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W557418 50μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Any equilavent product to fit
USB camera  Logitech  HD Pro Webcam C920 Or any equilavent product
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
Whole cell pipette glass Warner Instruments GC150TF-7.5 Or any equilavent product
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product
x40 lens Nikon 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 Or any equilavent product
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Ca2+ imaging
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  Or any equilavent product
Acquisition software  Cairn Research Ltd. Acquisition Engine V1.1.5 Or any equilavent product; microfluorimetry
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Analysis software for confocal imaging Image J https://downloads.imagej.net/fiji/ Free imaging software
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Confocal microscope Leica Geosystems SP5  Or any equilavent product; confocal
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
Fine forceps Dumont No. 7 Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000 Or any equilavent product; microfluorimetry
Monochromator  Cairn Research Ltd. Optoscan Or any equilavent product; microfluorimetry
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Software for confocal microscope Leica Geosystems LAS-AF version 3.3. Or any equilavent product; confocal
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W557418 50μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Any equilavent product to fit
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
x100 lens Nikon x100 N.A. 1.3 oil Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens Leica Geosystems HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D Or any equilavent product; confocal
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product; microfluorimetry
x63 lens Leica Geosystems HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS ∞/0.17/E Or any equilavent product; confocal
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Pipettes Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation
Helper pipette World Percision instruments IB150F-3 Inner diameter: 0.86 mm
Ramp: 261
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 56
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 0.5-2 μm
Polishing: yes
Final Resistance: >10 MΩ
Cannulation pipette World Percision instruments TW150F-4 Inner diameter: 1.17 mm
Ramp: 290
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 58
Time: 150
No of cycles: 4
Tip diameter: 3-10 μm
Polishing: no
Final Resistance: <1 MΩ
On-cell patching World Percision instruments IB150F-3 Inner diameter: 0.86 mm
Ramp: 261
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 56
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 0.5-2 μm
Polishing: yes
Final Resistance: >5 MΩ
Whole-cell patching Warner Instruments GC150TF-7.5 Inner diameter: 1.17 mm
Ramp: 296
Pressure: 200
Heat: 287
Pull : 0
Velocity: 50
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 2-3 μm
Polishing: helpful but not necessary
Final Resistance: 1-2 MΩ

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References

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Curtis, T. M., McLaughlin, D., O'Hare, M., Kur, J., Barabas, P., Revolta, G., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., McGahon, M. K. Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies. J. Vis. Exp. (137), e57944, doi:10.3791/57944 (2018).

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