Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av netthinnen arterioler for Ex Vivo celle fysiologi studier

Published: July 14, 2018 doi: 10.3791/57944
Automatic Translation
*1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4, *2
1Centre for Experimental Medicine, Queen's University of Belfast, 2Centre for Biomedical Sciences (Education), Queen's University of Belfast, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Naresuan University, 4School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University of Belfast
* These authors contributed equally

Summary

Dette manuskriptet beskriver en enkel protokoll for isolering av arterioler fra rotte netthinnen som kan brukes i elektrofysiologiske, kalsium bildebehandling og trykk myography studier.

Abstract

Netthinnen er en svært metabolsk aktive vev som krever en betydelig blodtilførsel. Netthinnen sirkulasjon støtter indre netthinnen, mens choroidal fartøyene forsyning av fotoreseptorer. Endringer i netthinnen perfusjon bidra til mange sight-truende lidelser, inkludert diabetisk retinopati, grønn stær og retinal gren vene occlusions. Forstå molekylære mekanismer involvert i kontrollen av blodstrøm gjennom netthinnen og hvordan dette er endret under okulær sykdom kunne føre til identifisering av nye mål for behandling av disse forholdene. Netthinnen arterioler er viktigste motstand fartøyene av netthinnen, og derfor spiller en viktig rolle i å regulere retinal hemodynamics gjennom endringer i luminal diameter. De siste årene, har vi utviklet metoder for å isolere arterioler fra rotte netthinnen som er egnet for en rekke applikasjoner, inkludert celle fysiologi studier. Dette preparatet har allerede begynt å gi ny innsikt i hvordan blodstrøm styres i netthinnen og har tillatt oss å identifisere noen av de viktige endringene som oppstår under okulær sykdom. I denne artikkelen vi beskriver metoder for isolering av rotte retinal arterioler og inkludere protokoller for bruk i patch-klemme elektrofysiologi, kalsium bildebehandling og trykk myography studier. Disse fartøyene er også mottagelig for bruk i PCR-, vestlige blotting og immunohistochemistry-baserte studier.

Introduction

Forstå hvordan blodstrøm er kontrollert i netthinnen er et viktig mål siden unormal blodstrøm har vært innblandet i patogenesen av en rekke sight-truende retinal sykdommer1,2,3, 4. Netthinnen sirkulasjon, som leverer den indre retinal nevroner og gliacellene, har en slutt arterien ordning, med alle blod fra netthinnen arterier og arterioler passerer gjennom kapillærene retinal venules og til slutt årer5. Blodstrøm i netthinnen er regulert av tonen i netthinnen arterier og arterioler samt kontraktile aktiviteten til pericytes på veggene i netthinnen kapillærene og post kapillært venules6,7, 8. kontroll av netthinnen vaskulær tone er kompleks og modulert av en rekke innganger fra sirkulasjonssystemet og omkringliggende netthinnens vev, inkludert blod gasser, sirkulerende molekyler og hormoner, og vasoactive stoffer ut fra den netthinnen vaskulære endotelet og macroglia9,10,11. Netthinnen arterioler er små arteriell grenene av netthinnen og består av en enkelt lag av vaskulær glatte muskelcellene og en indre foring av langs ordnet endotelceller12,13, 14. disse fartøyene form hovednettstedet vaskulær motstand i netthinnen sirkulasjon og derfor spille en viktig rolle i kontroll av netthinnen blodstrøm. Netthinnen arterioler regulere kapillær blodstrøm i netthinnen av utvidelsen eller constricting deres luminal diameter, formidlet av endringer i vaskulær glatt muskel contractility10,15,16. Forstå molekylære mekanismer gjennom hvilke retinal arterioler regulere retinal perfusjon derfor krever forberedelser der den arterioler glatte muskelcellene kan nås og studerte under forhold så nær fysiologiske som mulig.

Ex vivo forberedelser av isolerte retinal blodårer gir tilgang til vaskulær glatt muskelceller, mens du fremdeles beholder sin funksjonalitet og tilkoblinger med underliggende endotelet. De fleste studier ennå med isolert skip har fokusert på store storfe eller svin arteriell fartøy (60-150 µm). Dette kan monteres i kommersielt tilgjengelig wire eller press myograph systemer å aktivere farmakologiske avhør av vaskulær glatt muskel celle kontraktile mekanismer17,18. Slike forberedelser har sterkt bidratt til vår kunnskap om retinal vaskulær fysiologi under normale forhold. Noen studier har brukt retinal arterioler isolert fra små forsøksdyr som deres mindre diameter (~ 8-45 µm) forhindrer bruken i konvensjonelle myography systemer19,20,21,22. En viktig fordel, men er ved å bruke fartøy fra små forsøksdyr bredt tilgjengeligheten av genetisk modifisert, transgene og retinal sykdom modeller. Liten forsøksdyr er også mer mottagelig for i vivo intervensjon studier.

Her beskriver vi enkel protokoller for å isolere og cannulating rotten retinal arterioler for press myography eksperimenter. Ca2 + bildebehandling og elektrofysiologi protokoller bruker disse fartøyene er også detaljert. Dette kan gi ytterligere innsikt i regulering av vaskulær glatt muskel contractility og blodstrøm i netthinnen.

Protocol

Alle eksperimenter beskrevet her ble utført i samsvar med retningslinjer i UK dyr (vitenskapelig prosedyrer) Act av 1986 og ble godkjent av Queen's University of Belfast dyrevelferd og etiske gjennomgang kroppen.

1. isolering av netthinnen arterioler

Merk: Følgende protokollen brukes til å isolere retinal arterioler. Denne metoden er optimalisert for rotte retinal arterioler, men kan brukes med musen netthinne. Avkastningen av skip, er imidlertid lavere ved mus.

  1. Utgjør en løsning av lav Ca2 + inneholder Hanks' (LCH) som vist i tabell 1.
    Merk: Denne løsningen kan lagres i opptil 3 dager på 4 ° C (når bruker lagret LCH, kontroller at det equilibrates til romtemperatur og pH er riktig før bruk).
  2. Montere følgende utstyr før samling av vev for å sikre rask microdissection av netthinnen: taggete tang, buede saks, disseksjon parabolen (silikon-belagt bensin fat), enkelt kantet blad, 2 sett med tang (sløv) 1 glass Pasteur Pipetter (brann polert til en glatt, men ikke smale tips), 1 disponibel plastikk pipe (med spissen trimming av for å øke blenderen til ~ 5-7 mm), 1 glass rundt bunnen reagensglasset (5 mL) og holder. Dekanter ca 50 mL av LCH i et glass beaker og forberede en andre kanne Dekanter avfall væsker.
    Merk: Se Tabell av materialer spesifikasjoner og forord.
  3. Euthanize rotta bruker CO2 etterfulgt av cardiac punktering til exsanguinate (unngå cervical forvridning eller hjernerystelse som kan skade blodkar i øyet). Trekke øyelokkene med taggete tang, og bruker den buede saksen til å kutte rundt orbital musklene og gjennom den optiske nerven. Forsiktig ekstra øynene fra bane å ta vare for å skjære gjennom eventuelle gjenværende vedlegg med saks.
  4. Sett øynene i LCH løsning på disseksjon parabolen (øyne kan transporteres på is i en løsning av LCH om nødvendig). Bruke en stump tang for å forankre øyet til rett ved å holde orbital muskel tilbehør eller synsnerven; Kontroller at forankring poenget er så nær som mulig til sclera å stabilisere øyet.
  5. Bruker bladet, skjære gjennom hornhinnen langs ora serrata og fjern objektivet ved å trykke forsiktig på sclera med tang.
  6. Kutt det øye cup i halvparten symmetrisk gjennom fiberoptisk platen. Bruke lukket tang forsiktig 'pensel' ut Netthinne fra de to halvdelene av eyecup ta vare for å fjerne eventuelle gjenværende vedlegg på fiberoptisk platen. Gjenta prosessen med det andre øyet og overføre dissekert netthinnen i reagensglasset hjelp plastikk pipe og en liten dråpe LCH medium.
  7. Bruke plastikk pipe fylle reagensglasset med LCH til ~ 5 mL og tillate netthinnen å bosette til bunnen.
  8. Vask vevet ca 3 ganger ved å fjerne ~ 4 mL løsning fra røret og legge frisk LCH med plastikk pipe. Der det er nødvendig, fjerne overflødig vev som suspensory leddbånd, glassporselen humor og hår.
  9. Vask innsiden av glasset Pasteur Pipetter (polert tips) med LCH hindre at vevet stikker til pipette. Bruker den samme pipette, fjerne ca 4 mL løsning fra reagensglasset. Deretter Legg ca 2 mL frisk LCH.
  10. Forsiktig distansere (triturate) Netthinne ved å tegne vevet gjennom spissen av glasset Pipetter sakte og utvise innholdet i reagensglasset. Merk, prøver ikke å innføre bobler på dette stadiet.
  11. Gjenta trinn 1.10 til netthinnen er brutt opp til en størrelse på ca 2-3 mm2.
  12. Vasker innsiden av pipette med ca 2 mL LCH og utvise dette i reagensglasset. Tillate innholdet til å bosette til bunnen over 5-10 min.
  13. Gjenta føden prosessen som beskrevet i 1.10-1.12 med litt mer kraft til vev bitene er ca 1 mm2 i størrelse. Igjen, la vevet betale for 5-10 min.
  14. Gjenta trinn 1.10-1.12 en tredje tid med mer kraft til innholdet er fullt homogenisert og ingen biter av netthinnen forblir (løsningen bør bli melkeaktig i utseende).
    Merk: Denne teknikken vil gi opp til 8 arteriolare segmenter (relativt fri for rundt neuropile og med noen greiner resterende intakt) per isolasjon måler 8-45 µm i diameter og 200-2500 µm i lengde.
  15. Overføre en liten mengde av isolere til en fysiologisk opptak kammer eller legge fluorescerende fargestoffer for måling av intracellulær Ca2 + konsentrasjon ([Ca2 +]i, se avsnitt 3). Kast restene av øyet kopper og løsning fjernet under isolasjon prosessen i samsvar med lokale bestemmelser om håndtering av animalsk avfall.
    Merk: Det er lurt å eksperimentere på fartøy umiddelbart etter isolasjon, overskudd isolere kan lagres ved 4 ° C i opptil 8 timer.

2. arterioler trykk Myography

Merk: Arterioler press myography utføres slik bruk i figur 1A, B og Tabell for materiale.

  1. Overføre en aliquot av netthinnen fartøy homogenate (1-2 mL; isolert som angitt i del 1) til en fysiologisk opptak kammer (delvis fylt med standardoppløsning Ca2 +gratis Hanks' løsning, 0Ca2 + Hanks'; se tabell 1) montert på scenen av en invertert mikroskop. La fartøyene å bosette seg på bunnen av opptak kammeret i minst 5 minutter før eksperimentering.
  2. Se gjennom hele innspillingen kammeret å identifisere arterioler > 200 µm i lengde og inneha åpen ende som fartøyet kan være cannulated (identifikasjon av fartøyet er videre undersøkt i resultatinndelingen). Plasser fartøyet i midten av synsfeltet. Hvis det finnes ingen passende fartøy, overføre en annen aliquot av fartøyet homogenate i innspillingen kammeret som trinn 2.1.
  3. Forankre en ende av fartøyet fine tang og en liten tungsten wire slip (75 µm diameter og ~ 2-4 mm i lengde) plassert over fartøyet (se figur 1 c(i)). Dette holder ledningen i tang og finne tang ovenfor opptak kammeret.
    1. Identifisere tilsvarende skyggen av Tang under mikroskopet, lavere tang i badekaret før kabelen blir tydelig. Plasser ledningen over fartøyet ca 200 µm fra den åpne enden og slipp ledningen vinkelrett på den lange aksen av fartøyet.
      Merk: Vekten av tungsten ledningen er nok å occlude fartøyet distally stoppe flyten av luminal innholdet under cannulation og pressurization.
  4. Flytte til arteriole til en passende stilling innenfor opptak kammeret slik at det ligger vannrett over badekaret med den åpne enden i tråd med pressurization kanyle (se figur 1 c(ii-iv)). Gjør dette ved å forsiktig nudging occluding wolfram wire slip med en ekstra del av wire holdt i tang; ikke berør arteriole som det vil irreversibelt følge tang.
  5. Der det er nødvendig (for lang arteriole segmenter), legge ekstra tungsten wire slips over fartøyet slik at avstanden mellom okkludert og åpne endene av fartøyet er mindre enn 200 µm; Dette hjelper for å forhindre arteriole flytte ut av synsfeltet på pressurization. Hvis fartøyet har noen sidegreiner, bør disse også være okkludert med ekstra tungsten wire følgesedler. Hvis en side gren ikke kan være okkludert forkaste fartøyet.
  6. Perfuse kammeret med 0Ca2 + Hanks' på 37 ° C til å fjerne overflødig netthinnen vev og varme bad til fysiologiske temperaturer.
    Merk: En standard gravitasjon-matet bad perfusjon og innebygd varmtvannsberedere system kan brukes for dette formålet (se figur 1A). 0Ca2 + Hanks' brukes til å forenkle cannulation prosedyren, siden fjerning av eksterne Ca2 + sikrer at arterioler forblir dilated.
  7. Dikte pressurization cannulas fra filamented Borosilikatglass kapillærene (tips diameter ~ 3-10 µm avhengig av diameteren på fartøyet til å være cannulated, mindre fartøyer krever smalere cannulas, se Tabellen for materiale) bruker en microelectrode avtrekker og tilbake-fyll med 0Ca2 + Hanks' løsning. Sikre skaft av kanyle er konisk forsiktig mot spissen for å lette cannulation.
  8. Montere kanyle i en pipette holder knyttet til 10 mL sprøyte via en Y-kontakt og en 3-veis kran; Dette brukes til å presse systemet, press registreres ved hjelp av en manometer knyttet til den andre siden-armen av Y-kontakten (se figur 1B).
    Merk: En 'hjelper' pipette er nødvendig for å hjelpe med cannulation prosessen. Dikte pipette fra en Borosilikatglass kapillær trakk på en microelectrode avtrekker en tips diameter på 0,5 - 2 µm. brann tungt polsk Pipetter (ofte til lukket) med et microforge.
  9. Plasser hjelper pipette vinkelrett på lang-aksen av fartøyet nær den åpne enden ved hjelp av en 3-akse mekanisk manipulator (se figur 1 d). Plasser hjelper pipette like over skipet, men ikke berøre det.
  10. Plasser cannulation pipette på den åpne enden av fartøyet (se figur 1 d og 2A(i)) med en fin micromanipulator; Plasser tuppen umiddelbart ved åpningen, som vurdert ved å justere flyet av fokus på mikroskopet (på 20 X). Når begge slutten av fartøyet og kanyle spissen er i fokus samtidig kanyle er riktig plassert for cannulation (se figur 2A(ii)).
  11. Forhånd pressurization kanyle inn fartøyet blenderåpning hjelp av x-aksen kontroller av den fine micromanipulator (se figur 2A(iii)). Vurdere suksessen til cannulation ved å flytte kanyle langs y-aksen. Hvis kanyle forblir i fartøyet er det vellykket cannulated (se figur 2A(iv)). Hvis kanyle flyttes utenfor skipet, trolig kanyle over fartøyet; så Gjenta trinn 2.10-2.11 med kanyle på et lavere fly i z-aksen.
  12. Etter vellykket cannulation forsiktig lavere hjelper pipette vateret å holde arteriole. Guide arterioler veggen over pressurization kanyle med hjelper pipette, samtidig som cannulation pipette er avansert videre inn i fartøyet lumen til en avstand på ca 30-50 µm (se figur 2A(v, vi)).
    Merk: Denne fremgangsmåten krever samtidig, kontrollerte bevegelse av både manipulators (hjelper pipette går mot kanyle mens kanyle flytter til fartøyet lumen) og krever omfattende praksis for å oppnå høy suksessrate.
  13. Endre bad løsningen til normal Hanks' inneholder 2 mM Ca2 + (se tabell 1) på 37 ° C. Vanligvis fører dette til en liten innsnevring av arteriole og dannelsen av en tett forsegling rundt pressurization kanyle. Den hjelper pipette kan flyttes fra fartøyet.
  14. Tillate en tett forsegling å utvikle for 15 min. fartøyet bruker et USB-kamera (og image oppkjøpet programvare) knyttet til mikroskopet og justere fokus for å maksimere kontrasten mellom fartøyet grensene og ekstern og intraluminal områder (se Finne 2B). Bilde fartøyet i 0,5 - 5 rammer/s.
  15. Etter 1 min opptak på 0 mmHg, øke intraluminal trykket til ønsket nivå ved å lukke 3-veis kranen festet til pressurization kanyle (se figur 1B) og bruke en liten mengde positivt trykk på systemet via sprøyten. Observere trykket endre på manometer.
    Merk: Trykk kan legges på trinn klok måte 100 mmHg eller en verdi for eksempel 40 mmHg (tilnærmet retinal arterioler press i vivo)23. Fartøyet skal raskt dilate bekrefter vellykket cannulation. Merk, press-indusert vasokonstriksjon (dvs, myogenic svaret) vil senere utvikle over en periode på 15 min, men på grunn av den lille størrelsen på disse fartøyene, dette kan ikke alltid være visuelt synlig.
  16. Nøye overvåke fartøyet under første pressurization for åpenbare lekkasje. Kilder av lekkasje kan stamme fra kløyvde sidegreiner eller utilstrekkelig tetting av kanyle på innsiden av arteriole.
    1. Se etter intraluminal innholdet forlater fartøyet. Mindre, mindre opplagt lekkasjer kan bli tydelig over tid som en dråpe i press på manometer. Hvis mulig, occlude åpning med ekstra tungsten wire slips ta vare ikke for å forstyrre kanyle. Utelukke preparater med åpenbare lekkasje fra videre analyse.
  17. Bruke stoffet av interesse abluminally på skipet før, eller følgende, 15 min pressurization avhengig av målene for eksperimentet (tidligere tillater effekter på utvikling av myogenic tonen bestemmes, sistnevnte kan analyse av effekter på stabil myogenic tone). En typisk stoffet leveringssystem er avbildet i figur 3A.
    1. Plasser levering uttaket vinkelrett på delen av fartøyet interessepunkter (som vist i figur 1 d) på avstand ~ 500 µm fra fartøyet rundt å ta vare for å sikre at uttaket er optimalt vinklet til fullt superfuse området (se Finne 3B). Kontroller at endringer i perfusjon ikke forstyrr fysisk fartøyet.
  18. Etter at et eksperiment, bruk en løsning av 0Ca2 + Hanks' inneholder 10 µM wortmannin (myosin lys kjeden kinase inhibitor) for å dilate maksimalt skipet for å bestemme passiv diameter.
    Merk: Styrke cannulation segl kan testes ved avslutningen av eksperimentet ved å heve intraluminal trykket for > 100 mmHg. Fleste skip forblir festet selv til denne høytrykk indikerer en tett forsegling.
  19. Utfører frakoblet analyse bruker kantregistrering spore endringer i arterioler diameter (se Tabell for materiale for foreslåtte programvare). Normalisere arteriole diameteren til passiv diameteren for sammenligning mellom fartøy.

3. Ca2 + Imaging

Merk: Isolert retinal arterioler er forberedt for konvensjonelle (microfluorimetry) og AC confocal Ca2 + imaging som følger (med utstyr i Tabellen for materiale).

  1. Forberede retinal homogenates i 5 mL test røret som beskrevet i del 1. 1 mL av netthinnen homogenate legge Fura - 2 AM (microfluormetric Ca2 + opptak) eller Fluo - 4 AM (AC confocal Ca2 + imaging) for å gi en endelig konsentrasjon på 5 µM (beskytte fra lys); fargestoff indikatorer laste fortrinnsvis inn glatte muskelcellene.
  2. Opprettholde ved romtemperatur i mørket 2t flicking siden av røret hvert 15-20 min å re suspendere netthinnen vev. Deretter fortynn homogenate 1:4 LCH løsning for å redusere ytterligere fargestoff lasting.
    Merk: Fartøy være levedyktig for opptil 6 h (når lagret på 4 ° C og i mørket); Det anbefales imidlertid at eksperimenter er startet så snart som mulig å redusere virkningen av compartmentalization av fargestoff i interne organeller eller utelukkelse av fargestoff over tid.
  3. Overføre 1-2 mL retinal homogenate til et glass bunn opptak kammer (delvis fylt med LCH) montert på scenen av en invertert mikroskop koblet til en Ca2 + microfluorimetry eller AC confocal mikroskopi system.
    1. Forankre arterioler vinkelrett på retningen av flyt over opptak kammeret, med tungsten wire slips (50 µm diameter, 2-4 mm i lengde) linjeavstand ~ 100-200 µm hverandre langs fartøy (se Figur 3 c) bruker en lignende teknikk som beskrevet i trinn 2.3.
  4. Perfuse bad med normal Ca2 + Hanks' løsning på 37 ° C. Plasser stoffet levering uttaket som avbildet i Figur 3 c og bruke narkotika fartøy som beskrevet i trinn 2,17.
  5. For konvensjonelle Ca2 + bildebehandling, belyse skipet med 340/380 nm lys via et nedsenking UV oljeobjektiv (f.eks 100 X, NA 1.3) og samle slippes ut fluorescens på 510 nm via et foton teller photomultiplier tube (betaling).
  6. På slutten av hvert eksperiment, måle bakgrunn fluorescens ved å slukke fartøyet med en MnCl som inneholder løsning (se tabell 1). Bruk bakgrunn-korrigert fluorescens prosenter (R-F340/F380) for analyse eller konvertere til intracellulær Ca2 + ([Ca2 +]jeg) bruker Rmin og Rmax målinger (se tabell 1, anvendt før slukke 24) og Grynkiewicz ligning25.
  7. For AC confocal Ca2 + bildebehandling, opphisse Fluo-4 lastet fartøy 488 nm og fange resulterende fluorescens utslipp 490-535 nm i enten linje Skann modus (xt) eller xyt skanning moduser (512 x 512 bildepunkter, foreslåtte pinhole 300 nm). Normalisere målinger til fluorescens innspilt på tiden t = 0 (F/F0). Vurdere endringer i [Ca2 +]jeg under stoffet søknader eller pressurization frakoblede i bestemte områder av interesse (ROIs) ved hjelp av analyseprogramvare.
  8. Hvis nødvendig, utføre Ca2 + bildebehandling press myography.
    Merk: Beskrivelsen ovenfor er optimalisert for uten skip; men er det mulig å kombinere Ca2 + imaging press myography som følger.
    1. Isolere arterioler som angitt i del 1. Legg Ca2 + indikator fargestoffer per trinn 3.1-3.2. Overføre arterioler til opptak kammeret, og cannulate henhold til punkt 2. Pass på å begrense lyseksponering under montering prosedyren.
    2. Mål Ca2 + per trinn 3.5 eller 3.7 ovenfor. Pressurize fartøyet og gjenta målingen av Ca2 +. Samtidig måling av fartøyet diameter er avhengig av Ca2 + måling og utstyr.
      Merk: For AC confocal Ca2 + måling kan det være nødvendig å bilde separate områder pre- og post pressurization på grunn av bleking av fargestoffet under lange eksponeringer til lys.

4. Patch-klemme elektrofysiologi

Merk: Hele celler og én kanal innspillingen er mulig fra personlige arterioler glatt muskelceller fortsatt innebygd i deres overordnede arterioler slik (med utstyr i Tabellen for materiale).

  1. Isolere og forankre retinal arterioler i innspillingen kammer som beskrevet i trinn 1, 2,3 og 3.3. For oppdateringen-klemme opptak fordelt tungsten ledningen blankettene 200-800 µm hverandre langs fartøyet.
  2. Fjern basale lamina rundt arteriole og elektrisk uncouple tilstøtende glatte muskelcellene og underliggende endotelceller før oppdateringen clamping. Å gjøre det superfuse fartøyet med en sekvensiell serie med enzym løsninger (tabell 1) på 37 ° C for nødvendige varigheten.
    Merk: Varigheten av enzymet eksponering er optimalisert for rotte retinal arterioler (protease, ~ 8 min; collagenase, ~ 12 min) og avhenger inntakets stoffet levering systemet (~ 1 mL/min på vår organisering) og enhet aktiviteter bunken av enzymer som brukes.
  3. Evaluere fordøyelsen på visuelle separasjon av endothelial og glatt muskel lag under collagenase trinn som vist i Figur 4. Når separasjon av cellen lagene er observert (som vist i figur 4B), bruke DNAse jeg løsning (~ 4 min) deretter avslutte fordøyelsen ved utskifting av bad løsningen med normal Ca2 + Hanks' løsning.
  4. Fjern alle gjenværende tråder basale lamina og/eller eksterne neuropile ved å forsiktig feie lukket tips av fine tang langs overflaten av fartøyet.
  5. Trekk og polsk glass kapillærene (Tabell for materiale), fyll med Pipetter løsning (tabell 1) og sted trygt i pipette innehaveren av oppdateringen-klemme headstage. Plasser Pipetter i 45° vinkel i forhold til opptak kammeret og gå videre mot fartøyet bruke innstillingen grov på en motorisert micromanipulator.
  6. Merk en glatt muskelcelle stikker fra fartøyet veggen og som er fri for synlige rusk (se figur 4B). Plasser tuppen av oppdateringen pipette vertikalt over cellen rundt og lavere gradvis med fine/treg bevegelse av micromanipulator for å gjøre kontakt med glatt muskel membranen.
    1. Vurdere kontakten mellom cellen og pipette visuelt fra cellen bevegelse og en endring i pipette motstanden målt ved hjelp av membran (stempel) testprotokollen i oppkjøpet programvare (5-10 mV negativt sprang fra 0 mV, frekvens 25 KHz – se figur 5A(i)) .
  7. Når segl motstanden har økt 5-fold (f.eks stiger fra 2 til 10 MΩ; Figur 5A (ii)) bruke negative trykket transiently på baksiden av pipette holderen via en y-kontakt, 3-veis trykk, sprøyten og rør knyttet til pipette holderen (samlet i en lignende måte som brukes i pressurization av arterioler, se figur 1B).
  8. Gjenta anvendelser av negative trykket til en gigaseal (> 1 GΩ motstand, som indikert av membran testen i oppkjøpet programvare) er dannet (figur 5A(iii)). Legg merke til at denne prosessen kan ta 1-5 minutter. Hvis en gigaseal ikke skjemaet, velger du en annen celle til oppdateringen klemmen med en fersk oppdatering pipette.
  9. Bruke et holdingselskap potensielle på cellen via oppkjøpet programvaren som eksperimentet utføres (vanligvis 0,-40 eller-80 mV).
  10. Studien (på-celle) enkeltkanals aktivitet i den aktuelle konfigurasjonen. Eventuelt generere innsiden ut oppdateringer av raskt trekke oppdateringen pipette fra celleoverflaten etter gigaseal formasjon.
    1. Som de ledige endene av membranen kan re anneal under disse forholdene kan du fjerne pipette fra bad via rask vertikal bevegelse av manipulatoren (grov innstilling). Raskt tilbake gjennom meniscus fjerne reformerte membranen forlate bare oppdateringen inne pipette spissen.
  11. Angitt samplingsfrekvens på oppkjøp programvare 5 kHz og aktivere kontinuerlig opptaksmodus til posten kanal aktivitet. Bruke spenninger endringer hvis nødvendig via programvaren eller forsterkeren.
  12. Om nødvendig bruke narkotika fartøyet/membran patch som beskrevet i trinn 2,17.
  13. Hvis membran strekk, gjelde negative trykket bakre av pipette bruker sprøyten festet til en manometer via en 3-veis trykk og y-kontakten.
  14. Analysere enkeltkanals innspillinger for åpne sannsynlighet og enhetlig konduktans i samsvar med standard prosedyrer26.
  15. For hele cellen gjeldende opptak trekk og polsk Pipetter per Tabell av materialer, fylle med Pipetter løsning som inneholder amfotericin B (legge til 3 mg av amfotericin B 50 µL av DMSO, legge til 3-6 µL av denne 1 mL av hele celle pipette løsning, sonicate for å blande) og en forsegling som trinn 4.6-4,9.
  16. På grunn av innbefattingen av amfotericin B er det ikke nødvendig å ruptur membranen i pipette spissen hele cellen tilgang. Overvåke tilgang, som vil være fikk gradvis, med membran testprotokollen i oppkjøpet programvaren (-20 mV trinn 40 mV, samplingfrekvens 25 KHz – se figur 5B).
  17. Automatisk montering av kapasitive transienter i noen programvare gir sanntid målinger av tilgang motstand og celle kapasitans (alternativt den relative tilbakegang for transienter kan vurderes av øyet). Når access motstanden faller til < 15 MΩ, utføre serien motstand kompensasjoner (figur 5C) med hele celle parameteren ringer (kapasitans og serien motstand) på forsterkeren.
    1. Vil bruke automatiserte passende verdier først sette ringer (se figur 5C(ii)) så øke serien motstand kompensasjon-dial (prediksjon og korrigering på forsterkeren) å justere hele cellen kompensasjoner samtidig redusere kapasitiv forbigående (se figur 5C(iii)).
    2. Ta vare ikke å over-kompensere (som vist i figur 5C(iv)). Vanligvis er det mulig å kompensere serien motstand med 75% i perforert oppdateringen modus (krever lag kompensasjon angis med maksimum).
  18. Hvis ingen automatisk montering er tilgjengelig, start ved å angi parameterne hele celle ringer 15 pF og 15 mΩ (typisk verdier for disse cellene) og deretter justere for å produsere resultatene som vises i figur 5C(ii). Øke serien motstand kompensasjon ringe ~ 75% og justere parameterne hele celle ringer som figur 5C(iii).
  19. Før du setter eksperimentering Merk cellen kapasitans målingen fra første automatisk montering eller ringe etter manuell kompensasjon.
    Merk: Denne verdien brukes til å normalisere havstrømmer til Cellestørrelse. Kompensasjon for serien motstand må justeres under eksperimentering som access kan fortsette å øke på grunn av ytterligere innlemmelse av amfotericin B i oppdateringen.
  20. Bruke narkotika fartøy som beskrevet i trinn 2,17. Bruke spenning protokoller (trinn eller ramper) som eksperimentelle krav.
    Merk: Typisk spenning trinn protokoller, 0.1 - 1 s i varighet, brukes fra holder potensial i 10-20 mV øker hvert 5-10 s å produsere en rekke spenning-aktivert strømninger. Alternativt bruke rampen protokoller for å måle strøm på en rekke spenninger i en "fei" av en gradvis spenningen sakte (100-200 mV/s) fra f.eks -80 til 80 mV (brukt hvert 5-10 s) med frakoblede utvalg av gjeldende 10 mV mellomrom under rampen.
  21. Er det mulig å kombinere Ca2 + bildebehandling med patch-klemme innspillingen på følgende måte. Isolere arterioler som angitt i del 1. Legg Ca2 + indikator fargestoffer per trinn 3.1-3.2. Montere i innspillingen kammer som angitt i del 4. Pass på å begrense lyseksponering under disse prosedyrene.
    Merk: Ennå det er ikke mulig å kombinere patch-klemme med press myography studier på grunn av av kjelleren membran og fartøyet under av enzymatisk dissosiasjon

Representative Results

Figur 6A viser en skjematisk tegning av rotte retinal vaskulær treet. Diameter områdene av første orden (30-45 µm), andre orden (20-30 µm) og pre kapillær arterioler (8-20 µm) har blitt bekreftet eksperimentelt i vårt laboratorium av AC confocal avbildning av rotte retinal hele-mount forberedelser immunohistochemically merket for α-glatt muskel utgangen (figur 6B). På dissosiasjon av netthinnen, kan primær, sekundær og pre kapillær arterioler identifiseres basert på deres kaliber og ordningen vaskulær glatt muskel cellemembraner. De første og andre arterioler vises visuelt like under lyse-feltet mikroskopi, men kan skilles basert på størrelsen (figur 6C). De pre kapillær arterioler er minste arteriell fartøyene i utarbeidelse og lett gjenkjennelig på grunn av deres enklere arrangement av vaskulær glatt muskel fiber. De isolerte arterioler kan være tydelig differensiert fra kapillærene og venules i isolasjon. Kapillærene er tilsynelatende som en meshwork av små caliber (4-10 µm i diameter) fartøy, mens venules er tynne vegger og mangler glatt muskel celle dekning (figur 6C). Primær, sekundær og pre kapillær arterioler passer for press myography, Ca2 + bildebehandling og patch-klemme studier.

Figur 7 viser et press myography eksperiment der en primær rotte retinal arteriole har vært cannulated og intraluminal trykket hevet til 40 mmHg. Arteriole er deretter opprettholdt på dette presset å tillate utviklingen av myogenic tone før tilsetning av 0Ca2 + Hanks' som inneholder 10 µM wortmannin å få passiv diameteren på fartøyet. Figur 7A viser photomicrographs av arteriole på ulike tidspunkt i løpet av eksperimentet. Full tid-banerekord viser endringen i fartøy diameter over tid har vært tegnet i figur 7B bruker egendefinerte laget kantregistrering programvare27. Umiddelbart etter pressurization fartøyet dilaterer, som etterfølges av en aktiv myogenic innsnevring som når en stabil nivå etter 15 min. tillegg av 0Ca2 + Hanks'/ wortmannin løsning dilaterer fartøyet tilbake til et nivå som er lik observert umiddelbart etter det første trykk trinnet. Som beskrevet ovenfor, kan narkotika brukes til skip før eller følgende pressurization å undersøke mekanismene bak utvikling og vedlikehold av myogenic tone i disse fartøyene. Bruker denne tilnærmingen, vi har tidligere vist at strekk-aktivert forbigående reseptor potensielle Vanilloid 2 (TRPV2) kanaler og L - og T-type spenning-gated Ca2 + kanaler spille en sentral rolle i tilrettelegge myogenic tone utvikling i første og Second Bestill rotte retinal arterioler20,21,22. Vi har også rapportert at store-konduktans Ca2 + aktivert kalium kanaler (BK kanaler)19,28 og Kv1 inneholder spenning-gated K+ kanaler lov til å motsette seg myogenic aktivitet i disse fartøyene, siden tillegg av bestemte hemmere for hver av disse kanalene utløser vasokonstriksjon (figur 7C).

Figur 8 viser eksempler på konvensjonelle og AC confocal Ca2 + bildebehandling i netthinnen arterioler før og følgende eksponering for vasoconstrictor peptid, endothelin-1 (Et-1). I konvensjonell fura-2-baserte opptak (figur 8A), Et-1 (10 nM) utløser en bifasisk økning i [Ca2 +]jeg i netthinnen arterioler glatte muskulaturen laget, bestående av et innledende forbigående komponent etterfulgt av en lavere vedvarende komponent. Vi har tidligere preget forbigående og vedvarende komponentene som Ca2 + utgivelse fra det endoplasmatiske retikulum og Ca2 + tilstrømningen fra ekstracellulære plass, henholdsvis29. Fluo-4-baserte AC confocal Ca2 + imaging gir et mer detaljert bilde av virkningene av Et-1 på cellenivå. I disse eksperimentene er det tydelig at glatt gradert endringer i globale [Ca2 +]jeg observert i vår microfluorimetry studier resultatet fra Et-1 stimulere aktivering av repeterende asynkron [Ca2 +]jeg svingninger i den nærliggende retinal arterioler glatte muskelcellene langs fartøyet veggen (figur 8B, C, 30).

Figur 9 viser eksempler på én kanal og hele celler oppdateringen klemme opptak fra netthinnen arterioler glatt muskelceller. Hittil har vi gjennomført både på cellen og innsiden ut enkeltkanals oppdateringen klemme opptak22,28. Figur 9A, B for eksempel viser en på-celle oppdateringen klemme opptak før og følgende membran strekningen (generert ved å bruke negative trykket oppdateringen pipette). Denne bestemte oppdateringen inneholder to kanaler som aktiveres mekanisk strekningen. Vi har tidligere vist at disse strømmer kan bli hemmet bruker TRPV2 kanal pore-blokkerende antistoffer22. Den enhetlige konduktans av kanalene (249.71 pS) er også i overensstemmelse med disse strømmer blir formidlet av TRPV231.

Hele celle spenning-aktivert strømmer kan kan fremkalles med spenning trinn-protokollene. Figur 9C viser en familie av spenning-aktivert A-type K+ strøm spilt inn med en slik tilnærming. Disse strømmer blir tydelig når andre store strøm presenterer i disse cellene (f.eks BK og Ca+-aktivert Cl- strøm) er blokkert ved hjelp av bestemte farmakologiske agenter32,33. Strømmer gjennom ikke- eller svakt spenning-avhengige ionekanaler er vanligvis undersøkt ved hjelp av spenning rampen protokoller. Vi har brukt slike protokoller å identifisere og karakterisere TRPV2 strøm aktivert ved hypotonisk strekk22 og kanal agonister (figur 9 d) i netthinnen arterioler glatt muskelceller.

Figur 10 viser dobbelt press myography og AC confocal Ca2 + imaging brukes i en primær rotte retinal arteriole. Pressurization utløser økt frekvens av [Ca2 +]jeg svingninger i den personlige glatte muskelcellene ligner observert med Et-1. Vi har tidligere vist at disse svingninger utløses ved summering av Ca2 + gnister (lokalisert Ca2 + utgivelsen hendelser) og bidra til generasjon av myogenic tone20.

Figure 1
Figur 1 . Eksperimentell oppsett for press myography i rotte retinal arterioler. A) eksperimentelt utstyr inkludert invertert mikroskop, innebygd ovn for bad perfusate, 3-akse mekanisk og mikro-manipulators, manometer, kanyle holder og luft tabell. B) skjematisk diagram viser det optimale arrangementet av cannulating pipette og fartøy av interesse i innspillingen kammeret. Dette diagrammet illustrerer også grunnleggende oppsettet av pressurization utstyr. C) skjematisk diagram vist forankring og flytte fartøyet med ekstra tungsten wire følgesedler i fine tang. (i) dråpe 1m slip til occlude fartøy. (ii, iii) Bruk flere følgesedler til å finjustere skjule slip (retning pilens) og tilhørende fartøyet i optimal retning vises i (iv). D) skjematisk diagram viser optimal plassering av skjule tungsten wire slip, hjelper pipette og kanyle i forhold til fartøyet som arrangeres før cannulation. Utløpet av stoffet levering systemet er plassert i en avstand på ~ 500 µm fra fartøyet å redusere bevegelse gjenstander under medikament programmet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Cannulation prosessen for Trykk myography. A) Photomicrographs viser en netthinnen arteriole forankret ned i innspillingen kammeret før (i), (ii)-(v) og følgende cannulation (vi). Blå pil viser bevegelsesretning av kanyle mens den grønne pilen indikerer bevegelsesretning av hjelper pipette. B) Photomicrograph viser optimale regionen for opptak av myogenic aktivitet i pressurization som uthevet i rødt. Legg merke til at justering av lys og fokus å øke kontrasten på fartøyet veggene gir bedre sporing av fartøy kanter for automatisk analyse. Skala bar angir 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Stoffet levering. A) utstyr brukes for narkotika-leveranser viser løsning reservoarer koblet til en flerkanals levering manifold kontrollert av 3-veis kraner og festet til en 3-akse mekanisk manipulator. B) Diagram som viser optimale Vertikal plassering av narkotika-leveranser manifold i forhold til opptak kammeret. C) Photomicrograph av et fartøy forankret ned i innspillingen kammeret viser ideelle plasseringen av stoffet levering uttaket. Skala linjen representerer 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Opptak enzymatisk fordøyelsen av netthinnen arterioler for oppdateringen klemme. Lys micrographs av en netthinnen arteriole før (A) og etter (B) enzymatisk fordøyelsen. Merk fysisk separasjon (angitt med piler) i den glatte muskelcellene (SMCs) fra underliggende endotelceller (ECs). Glatte muskelcellene egnet for oppdateringen clamping angis med en stjerne. Skala linjen representerer 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Kanal og hele cellen oppdateringen klemme opptak. A) illustrasjon av testen strøm observert under 'forsegle test' protokollen når: (i) patch pipette inn eksterne bading medium, (ii) pipette tips kommer i kontakt med vaskulær glatt muskel celle plasma membranen og (iii) sugekraft er brukt på baksiden av pipette aktivere gigaseal formasjon. Etter pipette kapasitans kompensasjon bruker oppdateringen klemme forsterkeren, enkeltkanals strømmer kan nå spilles i på-celle konfigurasjonen eller en oppdatering av membranen kan kreditert ved raskt trekke pipette for å opprette en "innsiden ut"-oppdateringen. B) gjeldende endringer knyttet til utviklingen av elektriske tilgang til celle interiøret i anvendelse av amfotericin B hele-cellen perforert oppdateringen klemme teknikk (i): (ii) som amfotericin B partisjoner i membranen, tilgang motstand falls og kapasitans transienter elicited under hyperpolarizing spenning trinn (40--60 mV) bli større; (iii) når access motstand (Ren) har falt til < 15 MΩ, som vanligvis tar 5-10 min etter gigaseal formasjon, er eksperimentering mulig. C) før hele celle opptak, tilgang motstand og celle kapasitans må kompenseres med relevante ringer på oppdateringen klemme forsterkeren. Verdiene for tilgang motstand og celle kapasitans levert av automatiserte funksjoner innen patch-klemme programvare kan brukes til å hjelpe denne prosessen: (i) viser kapasitans forbigående før kompensasjon tatt fra det uthevede området i B(iii); (ii) viser reduksjon i kapasitans forbigående vanligvis observert når access motstand og kapasitans er kompensert; (iii) serien motstand kompensasjon deretter være rettet opp til 75% og tilgang og kapasitans kompensasjoner finjustert slik at resulterende forbigående bør være relativt lik i amplitude ovenfor og nedenfor platå av gjeldende under trinnet. (iv) bekymre burde være tatt å sikre at access motstanden ikke er over kompensert (angitt av tilstedeværelsen av "ringing" av forbigående), som kan oppstå noen ganger hvis fortsetter å forbedre i løpet av eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Identifikasjon av isolerte rotte retinal arterioler. A) illustrasjonen viser ordningen av rotte retinal mikrovaskulær treet. B) AC Confocal bilder av rotte retinal arterioler og venules i flat mount forberedelser farget for αSMA (rød kjerner er farget blå; skala stolper representerer 50 µm). C) lys micrographs av isolerte 1 °, 2 ° og pre kapillær arterioler, capillary nettverket og venule (skala barer representerer 10 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 . Arterioler press myography innspillinger. A) bilder av en cannulated retinal arteriole viser (i) hviler diameter (ca 35,6 µm), (ii) dilatasjon på pressurization, (iii) utvikling av myogenic vasokonstriksjon og (iv) dilatasjon på grunn av 10 µM wortmannin i 0Ca2 + Hanks' løsning. Skala bar representerer 10 µm. B) tid kurs plott av fartøyet diameter for hele eksperimentet vises i A (samplet på 2,5 rammer/s). C) Diameter spore fra en annen arteriole under stabil myogenic tone (diameter 38,7 µm) viser effekten av Kv1 kanal hemmer correolide (10 µM) og BK kanal hemmer iberiotoxin (100 nM) (samplet på 0,5 rammer/s). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 . Effekter av Et-1 på [Ca2 +] jeg signalering aktivitet i rotte retinal arterioler. A) konvensjonelle fura-2-baserte opptak viser effekten av Et-1 (10nM) på globale [Ca2 +]jeg. Basal [Ca2 +]jeg var 82 nM i denne 1 ° arteriole. B) Fluo-4-baserte AC confocal xt bilder viser effekten av Et-1 på [Ca2 +]jeg på cellenivå. C) Plot normalisert fluorescens intensitet (F/F0) målt i celler i B. Dette tallet har blitt endret fra Tumelty et al. 30 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9 . Enkeltkanals og hele celle patch-klemme innspillinger fra rotte retinal arterioler glatt muskel celler. A, B) på celle enkeltkanals opptak fra samme membranen patch før (A) og under (B) bruk av negative trykket (-45 mmHg) til oppdateringen pipetter. To kanaler finnes i patch (enhetlig gjeldende 12.81 pA; enhetlige konduktans 249.71 pS) som viser en betydelig økning i aktivering under strekk forhold. Utvalgte regioner fra øvre panelene vises (i) raskere i nedre paneler (ii). C) familie av en-type K+ kanal strøm (i) registrert i hele cellemodus i nærvær av hemmere av BK og Ca2 +-aktivert Cl- kanal hemmere, elicited svar på 20 mV spenning trinn trinn mellom-80 mV til + 80 mV (ii). D) hele cellen strøm (i) brakt frem av spenning ramper mellom-80 mV og 80 mV før (svart linje) og under (rød linje) anvendelse av den TRPV2 kanal Agonistiske delta-9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC). Spenning rampen protokollen brukes vises i nedre panel (ii). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10 . Ca2 + AC confocal imaging før og etter pressurization av en rotte retinal arteriole. Uten representant AC confocal xt skanner (i) av netthinnen arterioler glatt muskelceller under (A) og (B) under trykk forhold fra forskjellige regioner i samme fartøyet. (ii) endringer i normalisert fluorescens (F/F0) i enkeltceller-e, som indikert i (i), plottet mot tiden. Stjernene angir individuelle subcellular Ca2 + gnister som øke i hyppighet etter pressurization og summate for å utløse mobilnettet Ca2 + svingninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Sammensatte (mM) Lav Ca2 + Hanks' 0Ca2 + Hanks' Normal Hanks' Isolasjon enzym Protease Isolasjon enzym Collagenase Isolasjon enzymet DNAse Slukke løsning Rmin løsning Rmax løsning Cellen knyttet ekstracellulære løsning Cellen knyttet pipette løsning Hele celle ekstracellulære løsning Hele celle pipette løsning
Vann renhet (motstand) ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm
NaCl 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140
kCl 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 138
D-glukose 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
MgCl2 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1
HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
CaCl2 0,1 2 0,1 0,1 0,1 10 2 2 2 0,2
EGTA 4 0,5
MnCl 10
Ionomycin 0,01
KOH 140 130
D-Gluconic acid 130 130
NaOH 10
Penitrem A 0,0001 0,0001 0,0001
4-aminopyridine 10
Nimodipine 0,01 0,01
Fluoxetine 0,1
9-anthracenecarboxylic acid 1
Amfotericin B 300-600 μg mL-1
Protease Type XIV ~0.01% (0,4-0.6 mg/40 mL)
Collagenase Type 1A 0,1% (6 mg/60 mL)
DNAse jeg 20 KU (20 μL 1 MU/mL aksjer i 20 mL)
pH 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.2
titreres med NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH Tris Tris NaOH KOH

Tabell 1. Sammensetningen av løsninger brukes i eksperimentering med eksempler på eksterne og pipette løsninger brukes for én kanal (TRPV2) og hele (A-Type) strøm.

Discussion

Protokollene beskrevet ovenfor krever praksis, men bør være oppnåelig med minimal feilsøking. På en gjennomsnittlig dag ville vi få 6-8 brukbare arterioler fra isolasjon og oppnå 3-4 vellykket eksperimenter. Hvis det oppstår problemer, men er det noen tiltak som kan iverksettes for å forbedre suksessrate. Noen ganger har vi funnet, spesielt når du bruker yngre rotter (< 8 uker), at avkastningen av arterioler kan være lav. For å omgå dette problemet, vil vi foreslå sentrifugering netthinnen vev (10-30 s på 500 x g) mellom hver av føden trinnene i fremgangsmåten 1.12-1.14. Dette ofte bidrar til å forbedre avkastningen av fartøy, men vil også øke mengden av celle rusk i utarbeidelse.

Når cannulating fartøy for press myography studier er det viktig å sjekke arterioler nøye for side-grenene som kan ha vært kløyvde nær bifurkasjonen området. Dette er en vanlig årsak til lekkasje og tap av press under eksperimentering. Hovedproblemet som kan oppstå med [Ca2 +]jeg protokollene er nivået av fargestoff lasting. Dårlig fargestoff lasting fører til lav signal-til-støy-forhold, mens overbelastning fører til avbrudd i normal Ca2 + homeostase. For å redusere sannsynligheten for noen av disse problemene, en liten aliquot av netthinnen homogenate kan fjernes, og isolert fartøy kontrolleres regelmessig under lasting protokollen. Når oppgave oppdateringen-klemme eksperimenter, suksessrate på gigaseal formasjon er svært avhengig av hvor godt har de basale lamina vært fordøyd. Når først teste denne protokollen eller bruke nye masse enzymer kan det være nødvendig å justere konsentrasjon/varigheten av enzymet fordøyelsen. Nøye overvåking separasjon av endothelial og glatt muskel lag vil sikre tilstrekkelig fordøyelsen fjerne nok basale laminal tilgang. Nøye overvåking er også nødvendig for å unngå over fordøyelsen, som kan manifestere som fartøyet begynner å constrict. Hvis dette skjer, er den glatte muskelcellene ofte for skjøre for oppdateringen klemme opptak. Når enzymer, er det viktig å inkludere DNAse I for å sikre fjerning av tråder av DNA frigjort fra skadede celler under isolasjon prosessen. DNA fragmenter er klissete og forårsake tang å følge arteriole under sluttfasen av rengjøringen (trinn 4.4), ofte resulterer i tap av fartøyet. Rengjøring av fartøyer er teknisk vanskelig og er best utført på høy forstørrelse (20 X) med mild feiende bevegelser av stengt tang av fineste mulig tuppens diameter. Mellom feier rulle ren tang med lab.

Som fremhevet tidligere var en viktig motivasjon bak utviklingen av protokollene i dette manuskriptet å bedre forstå hvorfor blodstrøm avbrytes under retinal vascular sykdommer. De fleste av våre arbeid har fokusert på diabetiker øye sykdom28,33. Arterioler kan isoleres fra netthinnen i eksperimentelle gnager modeller av diabetes ved hjelp av metodene beskrevet i delen 1. Når du eksperimenterer på isolerte retinal arterioler fra diabetiker dyr, er det viktig å prøve å kopiere tett hyperglycemic forholdene oppleves av fartøy i vivo. Derfor vil vi normalt øke D-glukose nivåene i isolasjon og eksperimentelle løsninger til 25 mM. Jevning av vaskulær kjelleren membraner er et velkjent fenomen i netthinnen fartøy i diabetes34,35. Når du bruker dyr med langvarig diabetes (> 1 måneder sykdom varighet), er økt enzym konsentrasjoner eller fordøyelsen ganger ofte nødvendig å aktivere programmet patch-klemme opptak metoder.

En viktig begrensning av benytter ex vivo isolert retinal arterioler å studere retinal vaskulær fysiologi og patofysiologi er tapet av det omkringliggende retinal neuropile. Selv om fjerning av netthinnen glial og neuronal cellene gjør enkel tilgang til den retinal vaskulære glatte muskelcellene for cellen fysiologi studier, kan responsen av fartøyene vasoactive meglere endre seg dramatisk i fravær og tilstedeværelsen av retinal vev. Handlingene til adenosin tri-fosfat (ATP), for eksempel gi en god illustrasjon på dette punktet. I isolerte rotte retinal arterioler, tillegg av ATP utløser en robust innsnevring av fartøy36, mens i nærvær av en intakt neuropile, fartøyene dilate37. Derfor mulig vil prøve vi vanligvis å godkjenne viktige funn fra forberedelsene isolert arteriole ex vivo retinal hele-montere og i vivo målinger av fartøyet diameter og blodet flyt16,37 . Av notatet, nye metoder har nylig dukket opp for å studere små arterioler og blodkar i hele perfused svin Netthinne ex vivo38,39. Slike forberedelsene er sannsynlig å forbedre vår forståelse av hvordan retinal neuropile regulerer retinal arterioler og kapillær tone og hvordan endringer i netthinnen haemodynamics modulerer neuronal aktivitet i netthinnen.

Selv om prosedyrene som er beskrevet i denne artikkelen fokuserer på bruk av isolerte rotte retinal arterioler for forståelse arterioler glatt muskel celle fysiologi, utvikler vi for tiden for å også aktivere studiet av endothelial celle funksjon i disse fartøyene. I forarbeidet, har vi vært vellykket i å endre enzymatisk fordøyelsen av netthinnen arterioler segmenter å gi levedyktige endothelial celle rør som er mottakelig for Ca2 + bildebehandling og patchclamp innspillingen studier. Cannulation av de isolerte arterioler i begge ender, slik at intraluminal levering av narkotika, kan i fremtiden også aktivere endotelet avhengige av vasodilatory svar undersøkes i disse fartøyene.

Disclosures

Dr. Joanna Kur er nå ansatt av Medtronic (Vennskapsbyer, Minnesota, USA), hennes nåværende arbeid ikke er i konflikt med som presenteres her.

Acknowledgments

Protokollene som beskrevet i denne hvitboken er støttet av tilskudd fra de følgende virkemiddelaktører: BBSRC (BB/I026359/1), kampen for Sight (1429 og 1822), The juvenil Diabetes Research Foundation (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04) British Heart Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D divisjon (STL/4748/13) og MRC (MC_PC_15026).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers Fisherbrand 15409083 Or any equilavent product
Curved Scissors Fisher Scientific 50-109-3542 Or any equilavent product
Disposable plastic pipette/ transfer Sarstedt 86.1174 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture
Dissecting microscope Brunel Microscopes LTD Or any equilavent product
Forceps World Precision Instruments Dumont #5 14095 Any equivalent fine forceps
Pasteur pipette Fisherbrand 11546963 Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip
Petri dish Sigma-Aldrich P7741 Or any equilavent 10cm product
Pipette teat Fisherbrand 12426180 Or any equilavent product
Purified water supply Merek Milli-Q Integral Water Purification System Or any equilavent system
Round bottomed test tube Fisherbrand 14-958-10 B 5 mL; any equilavent product
Seratted forceps Fisher Scientific 17-467-230 Or any equilavent product
Single edge blades Agar Scientific T585 Or any equilavent product
Sylgard Dow Corning 184 Or any pliable surface 
Testtube rack Fisherbrand Derlin 10257963 Or any equilavent product
Pressure myography
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  x2 (or any equilavent product)
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Analysis software  Image J https://downloads.imagej.net/fiji/ Free imaging software
Analysis plugin Myotraker  https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 Custom plugin for imageJ Freely available for download
Cannulation pipette glass World Percision instruments TW150F-4 Or any equilavent product
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
Fluo-4-AM Thermo Fisher Scientific F14201 Make 1 mM stock in DMSO
Forceps World Precision Instruments Dumont #7 14097 Any equivalent fine forceps
Fura-2-AM Thermo Fisher Scientific F1221 Make 1 mM stock in DMSO
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
Helper pipette glass World Percision instruments IB150F-3 Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclypse TE 300 Or any equilavent product
Manometer Riester LF1459 Or any equilavent product
Microelectrode puller Sutter instruments P97 Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope Glassworks Fine Point F-550 Or any equilavent product
Micromanipulator Sutter instruments MP-285 Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder Molecular Devices 1-HL-U Or any equilavent product
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W558818 75μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Or any equilavent product
USB camera  Logitech  HD Pro Webcam C920 Or any equilavent product
Video capture software Hypercam version 2.28.01 Or any equilavent product
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Patch clamping
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  Or any equilavent product
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve)
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200a Or any equilavent product
Analogue digital converter Axon Digidata 1440A Or any equilavent product
Collagenase Type 1A Sigma-Aldrich C9891  0.1mg/mL in LCH
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
DNAse I Millipore 260913 Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) 
Faraday cage Custom made Any equilavent commerical product
Fine forceps Dumont No. 7 Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
Headstage Molecular Devices CV203BU Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclypse TE 300 Or any equilavent product
Microelectrode puller Sutter instruments P97 Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope Glassworks Fine Point F-550 Or any equilavent product
Micromanipulator Sutter instruments MP-285 Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Patching software Molecular Devices Pclamp v10.2 Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder Molecular Devices 1-HL-U Or any equilavent product
Protease Type XIV Sigma-Aldrich P5147  0.01mg/mL in LCH
Single channel pipette glass World Percision instruments IB150F-3 Or any equilavent product
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W557418 50μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Any equilavent product to fit
USB camera  Logitech  HD Pro Webcam C920 Or any equilavent product
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
Whole cell pipette glass Warner Instruments GC150TF-7.5 Or any equilavent product
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product
x40 lens Nikon 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 Or any equilavent product
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Ca2+ imaging
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  Or any equilavent product
Acquisition software  Cairn Research Ltd. Acquisition Engine V1.1.5 Or any equilavent product; microfluorimetry
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Analysis software for confocal imaging Image J https://downloads.imagej.net/fiji/ Free imaging software
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Confocal microscope Leica Geosystems SP5  Or any equilavent product; confocal
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
Fine forceps Dumont No. 7 Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000 Or any equilavent product; microfluorimetry
Monochromator  Cairn Research Ltd. Optoscan Or any equilavent product; microfluorimetry
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Software for confocal microscope Leica Geosystems LAS-AF version 3.3. Or any equilavent product; confocal
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W557418 50μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Any equilavent product to fit
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
x100 lens Nikon x100 N.A. 1.3 oil Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens Leica Geosystems HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D Or any equilavent product; confocal
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product; microfluorimetry
x63 lens Leica Geosystems HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS ∞/0.17/E Or any equilavent product; confocal
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Pipettes Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation
Helper pipette World Percision instruments IB150F-3 Inner diameter: 0.86 mm
Ramp: 261
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 56
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 0.5-2 μm
Polishing: yes
Final Resistance: >10 MΩ
Cannulation pipette World Percision instruments TW150F-4 Inner diameter: 1.17 mm
Ramp: 290
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 58
Time: 150
No of cycles: 4
Tip diameter: 3-10 μm
Polishing: no
Final Resistance: <1 MΩ
On-cell patching World Percision instruments IB150F-3 Inner diameter: 0.86 mm
Ramp: 261
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 56
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 0.5-2 μm
Polishing: yes
Final Resistance: >5 MΩ
Whole-cell patching Warner Instruments GC150TF-7.5 Inner diameter: 1.17 mm
Ramp: 296
Pressure: 200
Heat: 287
Pull : 0
Velocity: 50
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 2-3 μm
Polishing: helpful but not necessary
Final Resistance: 1-2 MΩ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Diabetes. 44, 603-607 (1995).
  2. Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects. American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).
  3. Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis? Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).
  4. Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease). Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).
  5. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).
  6. Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
  7. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).
  8. Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
  9. Delaey, C., Van de Voorde, J. Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation. Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).
  10. Metea, M. R., Newman, E. A. Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling. Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).
  11. Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).
  12. Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).
  13. Shepro, D., Morel, N. M. Pericyte physiology. The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).
  14. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network. Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).
  15. Matsushita, K., Puro, D. G. Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes. Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).
  16. Needham, M., et al. The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).
  17. Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles. Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).
  18. Delaey, C., Van de Voord, J. Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).
  19. Kur, J., et al. Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).
  20. Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).
  21. Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).
  22. McGahon, M. K., et al. TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).
  23. Guidoboni, G., et al. Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).
  24. Scholfield, C. N., Curtis, T. M. Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina. Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).
  25. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
  26. Sakmann, B., Neher, E. Single Channel Recording, Second Edition. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).
  27. Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis. PLoS One. 9, e91791 (2014).
  28. McGahon, M. K., et al. Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle. Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).
  29. Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
  30. Tumelty, J., et al. Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).
  31. Huynh, K. W., et al. Structural insight into the assembly of TRPV channels. Structure. 22 (2), 260-268 (2014).
  32. McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).
  33. McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes. Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).
  34. Ljubimov, A. V., et al. Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).
  35. Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).
  36. Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
  37. Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).
  38. Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level. Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).
  39. P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).

Tags

Biologi problemet 137 Retinal arteriole isolasjon myogenic tone myography patch-klemme arterioler glatt muskel blodet flyt autoregulation kalsium bildebehandling
Isolering av netthinnen arterioler for <em>Ex Vivo</em> celle fysiologi studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Curtis, T. M., McLaughlin, D.,… More

Curtis, T. M., McLaughlin, D., O'Hare, M., Kur, J., Barabas, P., Revolta, G., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., McGahon, M. K. Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies. J. Vis. Exp. (137), e57944, doi:10.3791/57944 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter