Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av Retinal arterioler för Ex Vivo cellstudier fysiologi

Published: July 14, 2018 doi: 10.3791/57944
Automatic Translation
*1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4, *2
1Centre for Experimental Medicine, Queen's University of Belfast, 2Centre for Biomedical Sciences (Education), Queen's University of Belfast, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Naresuan University, 4School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University of Belfast
* These authors contributed equally

Summary

Detta manuskript beskriver ett enkelt protokoll för isolering av arterioler från råtta näthinnan som kan användas i elektrofysiologiska, kalcium imaging och tryck myography studier.

Abstract

Näthinnan är en mycket metaboliskt aktiva vävnader som kräver en betydande blodtillförsel. Retinala cirkulationen stöder inre näthinnan, medan de koroidala kärl leverera fotoreceptorer. Förändringar i retinal perfusion bidrar till många synhotande störningar, inklusive diabetesretinopati, glaukom och retinal gren ven ocklusioner. Förstå de molekylära mekanismerna som är inblandade i kontrollen av blodflödet genom näthinnan och hur dessa förändras under okulär sjukdom kan leda till identifiering av nya mål för behandling av dessa tillstånd. Retinal arterioler är huvudsakliga motstånd blodkärlen i näthinnan, och följaktligen en viktig roll i regleringen av retinal hemodynamiken genom förändringar i luminala diameter. Under de senaste åren har vi utvecklat metoder för att isolera arterioler från råtta näthinnan som lämpar sig för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive cellstudier fysiologi. Detta preparat har redan börjat ge nya insikter i hur blodflödet styrs i näthinnan och har gjort det möjligt för oss att identifiera några av de viktiga förändringar som inträffar under okulär sjukdom. I denna artikel, vi beskriva metoder för isolering av råtta retinal arterioler och inkluderar protokoll för deras användning i patch-clamp elektrofysiologi, kalcium imaging och tryck myography studier. Dessa fartyg är också mottaglig för användning i PCR-, western blotting och immunohistokemi-baserade studier.

Introduction

Förstå hur blodflödet kontrolleras i näthinnan är ett viktigt mål, eftersom onormala blodflödet har varit inblandade i patogenesen vid en mängd synhotande retinala sjukdomar1,2,3, 4. Retinala cirkulationen, som levererar den inre retinala nervceller och stödjeceller, har ett slutet artär arrangemang, med alla blodet från retinala artärer och arterioler passerar genom kapillärerna till retinal venoler och slutligen vener5. Blodflödet i näthinnan regleras av tonen i näthinnans artärer och arterioler samt kontraktila aktiviteten av den pericyter som ligger på väggarna av retinal kapillärer och efter kapillär venoler6,7, 8. kontroll av retinal vaskulär tonen är komplex och moduleras av en rad ingångar från cirkulationssystemet och omgivande näthinnevävnad, inklusive blodgaser, cirkulerande molekyler och hormoner, och vasoaktiva ämnen frigörs från den retinal vaskulär endotel och macroglia9,10,11. De retinala arterioler är små arteriell grenarna av näthinnan och består av ett enda lager av vaskulära glatta muskelceller och ett innerfoder av längdriktningen ordnade endotelceller12,13, 14. dessa fartyg utgör den viktigaste platsen för vaskulär resistens inom retinala cirkulationen och därför spela en viktig roll i den lokala kontrollen av retinal blodflöde. Retinal arterioler reglera kapillär blodflödet i näthinnan av dilating eller bromsande deras luminala diameter, medieras av förändringar i vaskulär glatt muskulatur kontraktilitet10,15,16. Förstå de molekylära mekanismer genom vilka retinal arterioler reglera retinal perfusion kräver därför preparat där arteriolär glatta muskelceller kan nås och studerade under förhållanden så nära fysiologiska som möjligt.

Ex vivo preparat av isolerade retinala blodkärl ger tillgång till vaskulära glatta muskelceller, samtidigt som man behåller sin funktionalitet och sammankoppling med underliggande endotelet. De flesta studier hittills använda isolerade fartyg har fokuserat på stora nötkreatur eller svin arteriell kärl (60-150 µm). Dessa kan monteras i kommersiellt tillgängliga tråd eller trycket myograph system för att aktivera farmakologiska förhör av vaskulär glatt muskulatur cell kontraktila mekanismer17,18. Sådana preparat har kraftigt bidragit till vår kunskap om retinal vaskulär fysiologi under normala förhållanden. Få studier har använt retinal arterioler isolerade från små försöksdjur som sin mindre diameter (~ 8-45 µm) förhindrar deras användning i konventionella myography system19,20,21,22. En viktig fördel, dock är med fartyg från små försöksdjur den stora tillgången på genetiskt modifierade, genmanipulerad och retinal sjukdomsmodeller. Litet laboratoriedjur är också mer mottaglig för i vivo interventionsstudier.

Här beskriver vi enkelt protokoll för isolering och cannulating råtta retinal arterioler för tryck myography experiment. Ca2 + imaging och elektrofysiologi protokoll med hjälp av dessa fartyg är också detaljerade. Dessa kan ge ytterligare insikter om regleringen av vaskulär glatt muskulatur kontraktilitet och blodflödet i näthinnan.

Protocol

Alla experiment beskrivs här utfördes i enlighet med riktlinjerna inom den brittiska djur (vetenskapliga förfaranden) Act från 1986 och godkändes av Queen's University i Belfast djurens välbefinnande och etiska prövningsorganet.

1. isolering av Retinal arterioler

Obs: Följande protokoll används för att isolera retinal arterioler. Denna metod är optimerad för råtta retinal arterioler men kan användas med musen näthinnor. Avkastningen av fartyg, men är lägre när du använder möss.

  1. Göra upp en lösning av låg Ca2 + som innehåller Hanks (LCH) som visas i tabell 1.
    Obs: Denna lösning kan förvaras i upp till 3 dagar vid 4 ° C (när med lagrade LCH, säkerställa att det balanserar till rumstemperatur och pH är rätt före användning).
  2. Montera följande utrustning före samlingen av vävnad för att säkerställa snabb lokalt av näthinnor: tandad tång, böjd sax, dissektion maträtt (silikon-belagd petriskål), enda kanter blad, 2 uppsättningar av tången (trubbigt) 1 glas Pasteur-pipett (brand polerad till en slät men inte smal spets), 1 disponibel plast pipett (med spets trimmade för att öka bländaren till ~ 5-7 mm), 1 glas rund botten provrör (5 mL) och hållare. Häll upp cirka 50 mL LCH i en glasbägare och förbereda en andra bägare att Dekantera avfall vätskor.
    Obs: Se Tabell av material för specifikationer och tillverkaren Detaljer.
  3. Euthanize råtta med CO2 följt av hjärt punktering till exsanguinate (Undvik cervikal dislokation eller hjärnskakning eftersom dessa kan skada blodkärlen i ögat). Återkalla ögonlocken med tandad tång och sedan använda den böjd sax för att klippa runt orbital musklerna och genom synnerven. Försiktigt extrahera ögonen från omloppsbana tar hand för att skära igenom eventuella återstående bilagor med sax.
  4. Placera ögonen nedsänkt i LCH lösning på dissektion skålen (ögon kan transporteras på is i en lösning av LCH vid behov). Använda en uppsättning trubbig pincett för att förankra ögat att skålen genom att hålla den orbital muskel bilagor eller synnerven; Se till att förankra poängen är så nära som möjligt till sklera att stabilisera ögat.
  5. Bladet, skär genom hornhinnan längs den ora serrata och ta bort objektivet genom att trycka försiktigt på sklera med pincett.
  6. Skär i ögat cup i hälften symmetriskt genom synnervspapillen. Använda slutna pincett försiktigt 'borsta' ur näthinnor från de två halvorna av ögonmusslan noga med att ta bort eventuella återstående bilagor på synnervspapillen. Upprepa processen med det andra ögat och överföra de dissekerade näthinnor i provrör med plast pipetten och en liten droppe av LCH medium.
  7. Använd plast pipetten Fyll provröret med LCH till ~ 5 mL och tillåta de näthinnor sedimentera till botten.
  8. Tvätta av vävnaden cirka 3 gånger genom att ta bort ~ 4 mL lösning från röret och lägga till färska LCH med plast pipetten. Vid behov avlägsna främmande vävnad såsom uppskjutande ligament, glaskroppen och hårstrån.
  9. Tvätta insidan av glaset Pasteur-pipett (polerad spets) med LCH att förhindra vävnad fastnar pipetten. Använder samma pipetten, ta bort cirka 4 mL lösning i provrör. Lägg sedan till ca 2 mL färsk LCH.
  10. Försiktigt separera (hackad) näthinnor genom att rita vävnaden genom spetsen av glaset Pipettera långsamt och utvisa innehållet in i provrör. Observera, inte försöka införa bubblor i detta skede.
  11. Upprepa steg 1.10 tills näthinnor bryts upp till en storlek av ca 2-3 mm2.
  12. Tvätta insidan av pipetten med cirka 2 mL av LCH och utvisa detta in i provrör. Låt sedimentera längst över 5-10 min.
  13. Upprepa trituration processen som beskrivs i 1.10-1.12 med lite mer kraft tills vävnaden bitarna är ca 1 mm2 i storlek. Igen, låt vävnaden sedimentera i 5-10 min.
  14. Upprepa steg 1.10-1.12 en tredje gång med mer kraft tills innehållet är fullt homogeniseras och inga bitar av näthinnan förbli (lösningen bör bli mjölkiga till utseendet).
    Obs: Denna teknik kommer att ge upp till 8 arteriolare segment (relativt fritt kring neuropile och med vissa grenar kvar intakt) per isolering mäter 8-45 µm i diameter och 200-2500 µm i längd.
  15. Överföra en liten mängd isolatet in i en fysiologisk inspelning kammare eller Lägg till fluorescerande färgämnen för mätning av intracellulära Ca2 + koncentration ([Ca2 +]jag, se avsnitt 3). Släng resterna av ögat koppar och tas bort under processen isolering enligt lokala regler för hantering av djuravfall.
    Obs: Det är tillrådligt att experimentera på fartyg omedelbart efter isolering, överskott isolat kan lagras vid 4 ° C i upp till 8 h.

2. arteriolär tryck Myography

Obs: Arteriolär trycket myography utförs enligt följande med hjälp av utrustning som beskrivs i figur 1A, B och Tabell för material.

  1. Överför en alikvot av retinala kärl Homogenatet (1-2 mL; isolerat enligt avsnitt 1) till en fysiologisk inspelning kammare (delvis fyllda med nominellt Ca2 +gratis Hanks lösning; 0Ca2 + Hanks'; se tabell 1) monterad på scenen av en inverterade Mikroskop. Lämna fartygen att bosätta sig på botten av inspelning kammaren för minst 5 min före experiment.
  2. Visuellt skanna hela inspelningen kammaren att identifiera arterioler > 200 µm i längd och som har ett öppet slut som fartyget kan vara kanylerade (identifiering av fartygstyp är utforskas ytterligare i resultatavsnittet). Placera kärlet i mitten av synfältet. Om det finns inga lämpliga fartyg över en annan alikvot av fartyget Homogenatet in i inspelningen kammaren enligt steg 2.1.
  3. Förankra ena änden av fartyget med fin pincett och en liten volfram tråd slip (75 µm diameter och ~ 2-4 mm i längd) placeras över fartyget (se figur 1 c(i)). Att göra detta håll tråden i tången och leta upp tången ovan inspelning kammaren.
    1. Identifiera motsvarande skuggan av tången under mikroskopet, lägre tången in i badet tills tråden blir uppenbara. Placera tråden över på fartyget cirka 200 µm från den öppna änden och släpp tråden som är vinkelrät mot den långa axeln av fartyget.
      Obs: Vikten på volframtråd räcker att Täpp fartyget distalt stoppa flödet av luminala innehållet under kanylering och trycksättning.
  4. Flytta arteriole till en lämplig position inom inspelning kammaren så att den ligger horisontellt över badet med den öppna änden i linje med trycksättning kanylen (se figur 1 c(ii-iv)). Gör detta genom att försiktigt puffa ockluderande volfram tråd slip med ett nytt avsnitt av tråd hålls inom tången; vid inte arteriole som det irreversibelt följer tången.
  5. Vid behov (för lång arteriole segment), lägga till ytterligare volfram tråd glider över fartyget så att avståndet mellan fartyget ockluderad och öppna ändar är inte mer än 200 µm; Detta hjälper till att förhindra den arteriole flytta ut ur synfältet vid trycksättning. Om fartyget har någon sidogrenar, bör dessa också vara ockluderas med extra volfram tråd följesedlar. Om en sida gren inte kan vara ockluderas kassera fartyget.
  6. BEGJUTA kammaren med 0Ca2 + Hanks vid 37 ° C ta bort ovidkommande retinala vävnaden och att värma badet till fysiologiska temperaturer.
    Obs: En standard gravity matad bad perfusion och i-line värmesystem kan användas för detta ändamål (se figur 1A). 0Ca2 + Hanks' används för att underlätta förfarandet kanylering, eftersom avlägsnande av externa Ca2 + säkerställer att förbli arterioler dilaterad.
  7. Fabricera trycksättning kanyler från filamented borosilikatglas kapillärer (spets diameter ~ 3-10 µm beroende på diametern på fartyget att vara kanylerade; mindre fartyg kräver smalare kanyler; se Tabell för material) med en mikroelektrod avdragare och back-Fyll med 0Ca2 + Hanks lösning. Se till att skaftet av kanylen är avsmalnande försiktigt mot spetsen att underlätta kanylering.
  8. Montera kanylen i en pipett hållare bifogas en 10 mL spruta via en Y-koppling och en 3-vägs kran; Detta används för att trycksätta systemet, pressar som spelas in med manometer ansluten till den andra sidan-armen av Y-kontakten (se figur 1B).
    Obs: 'Helper' pipett är skyldig att bistå med att kanylering. Fabricera pipetten från en kapillär borosilikatglas drog på en mikroelektrod avdragare till en spets diameter 0,5 - 2 µm. brand tungt polska pipetten (ofta tills stängt) använder en microforge.
  9. Noggrant placera helper pipetten i rät vinkel mot fartyget lång-axel nära den öppna änden med en 3-axlig mekaniska manipulator (se figur 1 d). Placera helper pipetten ovanför fartyget, men inte röra den.
  10. Placera kanylering pipetten på den öppna änden av fartyget (se figur 1 d och 2A(i)) med hjälp av en fin micromanipulator; Placera spetsen direkt anslutning till öppningen, utvärderad genom att justera med fokus på mikroskopet (vid 20 X) plan. När båda i slutet av fartyget och kanyl spets är i fokus samtidigt kanylen är rätt placerad för kanylering (se figur 2A(ii)).
  11. Avancera trycksättning kanylen i öppningens fartyget med hjälp av x-axeln kontrollerna av de fina micromanipulator (se figur 2A(iii)). Utvärdera kanylering genom att flytta kanylen längs y-axeln. Om kanylen förblir inom fartyget är det framgångsrikt kanylerade (se figur 2A(iv)). Om kanylen flyttar utanför fartyget, är kanylen sannolikt att ligga över fartyget. så upprepa steg 2.10-2.11 med kanylen på ett lägre plan i z-axeln.
  12. Vid lyckad kanylering försiktigt sänka helper pipetten på fartyget att hindra arteriole. Vägleda arteriolär väggen över trycksättning kanylen med helper pipetten, samtidigt som kanylering pipetten är avancerade vidare till fartyget lumen till ett avstånd av cirka 30-50 µm (se figur 2A(v, vi)).
    Obs: Denna procedur kräver samtidig, kontrollerad rörelse av båda manipulatorer (helper pipett riktning mot kanylen medan kanylen flyttar in i fartyget lumen) och kommer att kräva omfattande praxis att uppnå en hög framgång.
  13. Ändra den bad-lösningen till normala Hanks innehållande 2 mM Ca2 + (se tabell 1) vid 37 ° C. Detta medför oftast en liten förträngning av arteriole och bildandet av en tät förslutning runt trycksättning kanylen. Helper pipetten kan sedan flyttas bort från fartyget.
  14. Tillåta en tät förslutning att utveckla för 15 min. Visa fartyget med hjälp av en USB-kamera (och förvärvet bildbehandlingsprogram) bifogas mikroskopet och justera fokus för att maximera kontrasten mellan fartyget gränserna och de extern och intraluminal utrymmen (se Figur 2B). Bild fartyget på 0,5 - 5 bildrutor/s.
  15. Efter 1 min inspelning med 0 mmHg, öka intraluminal trycket till önskad nivå 3-vägs kranen bifogas trycksättning kanylen (se figur 1B) och applicera en liten mängd övertryck till systemet via sprutan. Iaktta trycket ändra på manometern.
    Obs: Tryck kan läggas i en steg klokt sätt upp till 100 mmHg eller med ett värde till exempel 40 mmHg (tillnärma retinal arteriolär trycket i vivo)23. Fartyget bör snabbt vidgas bekräfta lyckad kanylering. Observera att tryckinducerad vasokonstriktion (dvs, myogenic svaret) därefter kommer att utvecklas under en period av 15 min, men på grund av den lilla storleken på dessa fartyg, detta kanske inte alltid är synliga.
  16. Noggrant övervaka fartyget under inledande trycksättning för uppenbara läckor. Källor av läcka kan härröra från klyvs sidogrenar eller otillräcklig tätning av kanylen på insidan av arteriole.
    1. Klocka för intraluminal innehållet lämnar fartyget. Mindre, mindre uppenbara läckor kan bli uppenbart över tid som en droppe i trycket på manometern. Om möjligt, Täpp öppningen med extra volfram tråd glider utan för att störa kanylen. Utesluta preparat med uppenbara läckage från ytterligare analys.
  17. Gälla fartyg före, eller följande, 15 min Trycksättning beroende på syftet med försöket (den förra ger effekter på utvecklingen av myogenic tonen som skall fastställas, medan det senare möjliggör analys av effekter drogen av intresse abluminally steady state myogenic ton). En typisk drogen leveranssystem avbildas i figur 3A.
    1. Placera leveransställe som är vinkelrät mot del av fartyget av intresse (som illustreras i figur 1 d) på ett avstånd ~ 500 µm från fartyget av intresse ta hand att se till att uttaget är optimalt vinklad till fullt superfuse området (se Figur 3B). Se till att förändringar i perfusion inte fysiskt stör fartyget.
  18. Efter slutförandet av ett experiment, tillämpa en lösning av 0Ca2 + Hanks' som innehåller 10 µM wortmannin (myosin ljusslinga tyrosinkinashämmare) för att maximally vidgas kärlet för att avgöra den passiva diametern.
    Obs: Styrkan i kanylering tätningen kan testas i slutet av experimentet genom att höja intraluminal trycket till > 100 mmHg. Majoriteten av fartyg kommer att sitta kvar även vid det höga trycket som anger en tät förslutning.
  19. Utföra offline analys med hjälp av flankdetektering för att spåra förändringar i arteriolär diameter (se Tabell av material för föreslagna programvara). Normalisera arteriole diametern till passiva diameter för jämförelse mellan fartyg.

3. Ca2 + Imaging

Obs: Isolerade retinal arterioler förbereds för konventionella (microfluorimetry) och confocal Ca2 + imaging som följer (med utrustning som beskrivs i Tabellen för material).

  1. Förbereda retinal homogenates i en 5 mL glas provrör som beskrivs i avsnitt 1. 1 mL av retinal Homogenatet tillsätt Fura - 2 AM (microfluormetric Ca2 + inspelning) eller Fluo - 4 AM (confocal Ca2 + imaging) för att ge en slutlig koncentration av 5 µM (ljuskänsligt); Dye indikatorer Ladda prioriterat i glatta muskelceller.
  2. Underhåll vid rumstemperatur i mörkret för 2 h snärta sidan av röret varje 15-20 min för att resuspendera retinala vävnaden. Därefter spädes Homogenatet 1:4 med LCH lösning för att ytterligare minska dye lastning.
    Obs: Fartyg förblir lönsamt för upp till 6 h (när de lagras vid 4 ° C och i mörker); men det rekommenderas att experiment inleds så snart som möjligt att minska effekterna av uppdelning av färgämnet i inre organeller eller extrusion av färgen med tiden.
  3. Över 1-2 mL av retinal Homogenatet till en glasbotten inspelning kammare (delvis fylld med LCH) monterad på scenen av en inverterade Mikroskop kopplat till en Ca2 + microfluorimetry eller konfokalmikroskopi system.
    1. Förankra arterioler vinkelrätt mot flödesriktningen i inspelning kammaren, med volfram tråd följesedlar (50 µm diameter, 2-4 mm i längd) fördelade ~ 100-200 µm mellanrum längs fartygets längd (se figur 3 c) med en liknande teknik som beskrivs i steg 2,3.
  4. BEGJUTA badet med normala Ca2 + Hanks lösning vid 37 ° C. Placera den drogen leveransställe som på bilden i figur 3 c och gälla fartyg droger som beskrivs i steg 2.17.
  5. För konventionella Ca2 + imaging, belysa fartyget med 340/380 nm ljus via en UV oljeimmersionsobjektivet (t.ex. 100 X, NA 1.3) och utsläppta fluorescensen på 510 nm via en photon counting fotomultiplikatorn röret (PMT).
  6. I slutet av varje experiment, mäta bakgrund fluorescens av kylning fartyget med en MnCl-innehållande lösning (se tabell 1). Använda bakgrundskorrigerade fluorescens nyckeltal (R-F340/F380) för analys eller konvertera till intracellulära Ca2 + ([Ca2 +]jag) använder Rmin och Rmax mätningar (se tabell 1; tillämpad före kylning 24) och Grynkiewicz ekvation25.
  7. För confocal Ca2 + imaging, excitera Fluo-4 lastade fartyg på 488 nm och fånga de resulterande fluorescens utsläppen vid 490-535 nm i antingen rad Skanna-läge (xt) eller xyt scan lägen (512 x 512 pixlar; föreslagna pinhole 300 nm). Normalisera mätningar att fluorescensen registreras vid tiden t = 0s (F/F0). Bedöma eventuella förändringar i [Ca2 +]jag under läkemedelsansökningar eller trycksättning offline i specifika områden av intresse (ROIs) med bild analys programvara.
  8. Utför Ca2 + bildbehandling med trycket myography vid behov.
    Obs: Beskrivningen ovan har optimerats för trycklösa fartyg. Det är emellertid möjligt att kombinera Ca2 + imaging med tryck myography enligt följande.
    1. Isolera arterioler enligt avsnitt 1. Fyll på med Ca2 + indikator färgämnen enligt steg 3,1-3,2. Överföra arterioler till inspelning kammaren och cannulate enligt avsnitt 2. Var noga med för att begränsa exponering för ljus under förfarandet för montering.
    2. Mät Ca2 + enligt steg 3.5 eller 3.7 ovan. Trycksätta fartyget och upprepa mätningen av Ca2 +. Samtidig mätning av fartyg diameter är beroende av funktionsläget av Ca2 + mätning och utrustning som används.
      Obs: För confocal Ca2 + mätning kan man behöva bild separat regioner före och efter trycksättning på grund av blekning av färgen under lång exponering för ljus.

4. Patch-Clamp elektrofysiologi

Obs: Hela-cell och enkanalig inspelning är möjlig från enskilda arteriolär glatta muskelceller fortfarande inbäddade i deras överordnade arterioler enligt följande (med utrustning som beskrivs i Tabellen för material).

  1. Isolera och förankra retinal arterioler i inspelning kammaren som beskrivs i steg 1, 2.3 och 3.3. För patch-clamp inspelning fördelade den volframtråd följesedlar är 200-800 µm mellanrum längs fartyget.
  2. Ta bort basala lamina kring arteriole och elektriskt uncouple intilliggande glatta muskelceller och underliggande endotelceller innan patch fastspänning. Att göra detta, superfuse fartyget med en sekventiell serie av enzym lösningar (tabell 1) vid 37 ° C under hela krävs.
    Obs: Enzym exponeringstiden är optimerad för råtta retinal arterioler (proteashämmare, ~ 8 min; kollagenas, ~ 12 min) och beror på flödet klassar av drogen leverans systemet (~ 1 mL/min på vår inställning) och enheten verksamhet batchen av enzymer som används.
  3. Utvärdering av nivåerna på matsmältningen på visuell separation av endotelceller och glatta muskellager under kollagenas steg som visas i figur 4. När separation av cellskikt observeras (som visas i figur 4B), tillämpa DNAS jag lösning (~ 4 min) sedan avsluta matsmältningen genom ersättning av bad lösningen med normala Ca2 + Hanks lösning.
  4. Ta bort alla återstående delar av basala lamina och/eller perifer neuropile genom noggrant svepande stängda tips på fina tången längs ytan av fartyget.
  5. Dra och polera glas kapillärer (Tabell för material), fyll med pipett lösning (tabell 1) och placera säkert i pipett innehavaren av den patch-clamp headstage. Placera pipetten i 45° vinkel i förhållande till inspelning kammaren och avancera det mot fartyget med hjälp av grova inställningen på en motordriven micromanipulator.
  6. Markera en smidig muskelcell utskjutande från kärlväggen och vars yta är fri från synligt skräp (se figur 4B). Placera spetsen på patch pipetten vertikalt över cellen sevärdheter och lägre gradvis använda micromanipulator böter/långsam rörelse för att göra kontakt med glatt muskulatur membranet.
    1. Bedöma kontakten mellan cellen och pipett visuellt från cell rörelse och en förändring i pipett motståndet mäts med membran (tätning) testprotokollet i programvaran förvärvet (5-10 mV negativa steg från 0 mV, frekvens 25 KHz; se figur 5A(i)) .
  7. När tätningen motståndet har ökat 5 gånger (t.ex. ökar från 2 till 10 MΩ; Figur 5A (ii)) Applicera undertrycket normalnivå på baksidan av hållaren för pipetten via en y-koppling, 3-vägs tryck, spruta och slang kopplad till innehavaren pipett (monterade på ett liknande sätt som används i trycksättning av arterioler, se figur 1B).
  8. Upprepa tillämpningar av undertryck tills en gigaseal (> 1 GΩ motstånd, som indikeras av membran testet i programvaran förvärvet) är bildat (figur 5A(iii)). Observera, denna process kan ta 1-5 min. Om en gigaseal inte formuläret, Välj en annan cell till patch clamp med färska patch pipett.
  9. Gäller en anläggning som är potentiella cellen via programvaran förvärvet enligt experimentet utförs (vanligtvis 0, -40 eller -80 mV).
  10. Studie (på-cell) enda kanal aktivitet i den nuvarande konfigurationen. Alternativt, generera inifrån och ut lappen genom snabbt Upprullningskraften patch pipetten från cellytan efter gigaseal bildande.
    1. Som de fria ändarna av membranet kan åter glödga under dessa förhållanden ta bort pipetten från badet via snabb Vertikal förflyttning av manipulatorn (grov inställning). Snabbt tillbaka genom menisken till avlägsna den reformera membranet som lämnar endast patch inuti pipettspetsen.
  11. Ställ in samplingsfrekvensen på förvärvet programvaran till 5 KHz och aktivera kontinuerlig inspelningsläge rekord kanal verksamhet. Tillämpa ändringar spänningar om så krävs via programvaran eller förstärkaren.
  12. Om så krävs, gäller droger fartyget/membran patch enligt beskrivningen i steg 2.17.
  13. Om membranet stretch krävs, undertryck gälla den bakre delen av pipetten Använd spruta bifogas en manometer via en 3-vägs tryck och y-koppling.
  14. Analysera enda kanal inspelningar för öppen sannolikhet och enhetlig konduktans enligt standardförfaranden26.
  15. För hela cellen nuvarande inspelning pull och polska pipetter enligt Tabell för material, fyll med pipett lösning som innehåller amfotericin B (lägga till 3 mg av amfotericin B 50 µL av DMSO, tillsätt 3-6 µL detta i 1 mL hela-cell pipett lösning, Sonikera för att blanda) och bilda en tätning enligt steg 4.6-4.9.
  16. På grund av införandet av amfotericin B finns det inget behov att brista membranet inom pipettspetsen att få hela cellen tillgång. Övervaka åtkomst, vilket kommer att uppnås gradvis, använda membran testprotokollet i programvaran förvärvet (-20 mV steg från -40 mV, prov frekvens 25 KHz; se figur 5B).
  17. Automatiserad montering av kapacitiv transienter i vissa program ger realtid mätningar av tillgång motstånd och cell kapacitans (alternativt den relativa minskningen av transienter kan bedömas av ögat). När tillgång motståndet faller till < 15 MΩ, utföra serie motstånd ersättningar (figur 5 c) med hela-cell parametern rattarna (kapacitans och serie motstånd) på förstärkaren.
    1. För att göra detta, använda automatiserad montering värden att initialt ställa rattarna (se figur 5 c(ii)) sedan öka serie motstånd ersättning ratten (prognos och korrigering om tillgängliga på förstärkaren) att justera hela cellen ersättningarna samtidigt minska kapacitiv övergående (se figur 5 c(iii)).
    2. Noga med att inte över kompensera (som visas i figur 5 c(iv)). Vanligtvis är det möjligt att kompensera serien motståndet med 75% i perforerad patch läge (kräver eftersläpning kompensation bör fastställas på högsta).
  18. Om ingen automatiserad montering finns, börja med inställningen parametrarna hela-cellen ringer till 15 pF och 15 mΩ (typiska värden för dessa celler) och justera sedan för att producera utgångarna som visas i figur 5 c(ii). Öka den serie motstånd ersättningen ringa till ~ 75% och justera parametrarna hela-cellen ringer enligt figur 5 c(iii).
  19. Innan experiment Observera cell kapacitans mätning från inledande automatiserad montering eller ratten efter manuell kompensation.
    Obs: Det här värdet används för att normalisera strömmar till Cellstorlek. Ersättning för serie motstånd kan behöva justeras under experiment som tillgång kan fortsätta att förbättras tack vare ytterligare införlivande av amfotericin B i plåstret.
  20. Gäller läkemedel för fartyg som beskrivs i steg 2.17. Tillämpa spänning protokoll (steg eller ramper) enligt experimentella krav.
    Obs: Typiska spänningen steg protokoll, 0,1 - 1 s i varaktighet, tillämpas från jordbruksföretaget potential i 10-20 mV ökar varje 5-10 s för att producera en familj av spänning-aktiverat strömmar. Alternativt använda rampen protokoll för att mäta strömmar på en rad spänningar i en 'sopa' genom rampning spänningen sakta (100-200 mV/s) från t.ex. -80 till + 80 mV (tillämpas varje 5-10 s) med offline provtagning av nuvarande 10 mV mellanrum under rampen.
  21. Det är möjligt att kombinera Ca2 + imaging med patch-clamp inspelning enligt följande. Isolera arterioler enligt avsnitt 1. Fyll på med Ca2 + indikator färgämnen enligt steg 3,1-3,2. Montera i inspelning kammaren enligt avsnitt 4. Var noga med för att begränsa exponering för ljus under dessa förfaranden.
    Obs: Hittills har inte varit möjligt att kombinera patch-clamp med trycket myography studier på grund av förlusten av basalmembranet och fartyget integritet under processen enzymatisk dissociation

Representative Results

Figur 6A visar en schematisk ritning av råtta retinal vaskulär trädet. Diameter spänner av första ordningen (30-45 µm), andra ordningen (20-30 µm) och före kapillär arterioler (8-20 µm) har bekräftats experimentellt i vårt laboratorium av confocal avbildning av råtta retinal hela-mount preparat immunohistochemically märkt för α-smooth muscle aktin (figur 6B). Vid dissociation av näthinnan, kan primär, sekundär och före kapillär arterioler identifieras utifrån deras kaliber och arrangemanget av vaskulära glatta muskelceller. De första och andra ordningen arterioler visas visuellt liknande under ljusa fält mikroskopi, men kan särskiljas på grundval av deras storlek (figur 6 c). De före kapillär arterioler är minsta arteriella kärlen i preparatet och är lätt att känna igen på grund av deras glesare arrangemang av vaskulära glatta muskelfibrer. De isolerade arterioler kan tydligt skiljas från kapillärer och venoler inom isolering. Kapillärer syns som en meshwork av små kaliber (4-10 µm i diameter) fartyg, medan venoler är tunna väggar och saknar smidig muskel cell täckning (figur 6 c). Primär, sekundär och före kapillär arterioler lämpar sig för tryck myography, Ca2 + imaging och patch-clamp studier.

Figur 7 visar en trycket myography experiment där en primär råtta retinal arteriole har varit kanylerade och intraluminal trycket höjs till 40 mmHg. Arteriole upprätthålls sedan vid detta tryck att möjliggöra utvecklingen av myogenic tonen före tillsats av 0Ca2 + Hanks innehållande 10 µM wortmannin att få fartyget passiva diameter. Figur 7A visar mikrofotografier av arteriole vid olika tidpunkter under experimentet. En heltid-banrekord som visar ändringarna i fartyget diameter över tid har varit inritade i figur 7B använder anpassade gjort kant-upptäckt programvara27. Omedelbart efter trycksättning fartyget vidgar, som sedan följs av en aktiv myogenic sammandragning som når en steady state-nivån efter 15 min. tillägg av 0Ca2 + Hanks'/ wortmannin lösning vidgar fartyget tillbaka till en nivå som liknar den som observerade omedelbart efter det ursprungliga trycket steget. Som beskrivits ovan, kan droger vara tillämpas på fartyg innan eller följande trycksättning att undersöka mekanismerna bakom utveckling och underhåll av myogenic tonen i dessa fartyg. Använder denna metod, har vi tidigare visat att stretch-aktiverat Transient Receptor Potential Vanilloid 2 (TRPV2) kanaler och L - och T-typ spänningskänsliga Ca2 + kanaler spelar en central roll i att underlätta myogenic tonen utveckling i första och andra beställa råtta retinal arterioler20,21,22. Vi har också rapporterat att stor-konduktans Ca2 + aktiverat kalium kanaler (BK kanaler)19,28 Kv1-innehållande spänningskänsliga K+ kanaler lagen och att motsätta sig myogenic aktivitet i dessa fartyg, eftersom tillägg av specifika hämmare för var och en av dessa kanaler utlöser vasokonstriktion (figur 7 c).

Figur 8 visar exempel på konventionella och confocal Ca2 + imaging i näthinnans arterioler före och efter exponering för den kärlsammandragande peptiden, endotelin-1 (Et-1). I konventionella fura-2-baserade inspelningar (figur 8A), Et-1 (10 nM) framkallar en bifasisk ökning [Ca2 +]jag i näthinnans arteriolär glatta muskulaturen lagret, bestående av en inledande övergående komponent följt av en lägre uppkom komponent. Vi har tidigare kännetecknas av övergående och ihållande komponenter som berodde på Ca2 + release från endoplasmatiska retiklet och Ca2 + tillströmningen från extracellulära, respektive29. Fluo-4-baserade confocal Ca2 + imaging ger en mer detaljerad bild av effekterna av Et-1 på cellnivå. I dessa experiment är det uppenbart att slät graderade ändringar i globala [Ca2 +]jag observerade i vårt microfluorimetry studier resultat från Et-1 stimulerar aktivering av repetitiva asynkron [Ca2 +]jag svängningar i angränsande retinal arteriolär glatta muskelceller längs kärlväggen (figur 8B, C; 30).

Figur 9 visar exempel på en kanal och hela-cell patch clamp inspelningar från retinala arteriolär glatta muskelceller. Hittills har vi utfört både på-cell och inifrån och ut enda kanal patch clamp inspelningar22,28. Figur 9A, B visar till exempel en på-cell patch clamp inspelning före och följande membran stretch (genereras genom att tillämpa undertryck patch pipetten). Denna särskilda plåster innehåller två kanaler som aktiveras av mekanisk stretch. Vi har tidigare visat att dessa strömmar kan hämmas med TRPV2 kanal pore-blockerande antikroppar22. Den enhetliga konduktans kanaler (249.71 pS) överensstämmer också med dessa strömmar som medieras av TRPV231.

Hela-cell spänning-aktiverat strömmar kan vara frammanade med spänningen steg protokoll. Figur 9 c visar en familj av spänning-aktiverat A-typ K+ strömmar in med ett sådant tillvägagångssätt. Dessa strömmar blir uppenbart när andra stora strömmar som finns i dessa celler (t.ex. BK och Ca+-aktiverat Cl– strömmar) blockeras med hjälp av specifika farmakologiska medel32,33. Strömmar genom icke- eller svagt spänningsberoende jonkanaler undersöks vanligen med spänning ramp protokoll. Vi har använt sådana protokoll för att identifiera och karaktärisera TRPV2 strömmarna aktiveras av hypoton stretch22 och kanal agonister (figur 9 d) i näthinnans arteriolär glatta muskelceller.

Figur 10 visar dubbla tryck myography och confocal Ca2 + imaging tillämpas i en primär råtta retinal arteriole. Trycksättning utlösare ökad frekvens av [Ca2 +]i svängningar i enskilda glatta muskelceller liknar dem som observerats med Et-1. Vi har tidigare visat att dessa svängningar utlöses av summeringen av Ca2 + gnistor (lokaliserad Ca2 + release händelser) och bidra till generation av myogenic ton20.

Figure 1
Figur 1 . Experiment för tryck myography i råtta retinal arterioler. A) experimentell utrustning inklusive inverterade Mikroskop, i-line värmare för bad perfusatet, 3-axlig mekaniska och mikro-manipulatorer, manometer, kanyl innehavaren och luft tabell. B) Schematisk bild visar det optimala arrangemanget av cannulating pipett och fartyget av intresse i inspelning kammaren. Det här diagrammet illustrerar också den grundläggande utformningen av trycksättning utrustningen. C) Schematisk bild visas processen för ankring och flytta fartyget använda extra volfram tråd glider hölls i fin pincett. (i) droppe 1st slip till Täpp fartyget. (ii, iii) Använd ytterligare följesedlar för att knuffa den occluding slip (riktningen som anges av pilen) och medföljande fartyg till den optimala riktning som visas i (iv). D) Schematisk bild visar optimal positionering av occluding volfram tråd slip, helper pipett och kanyl i förhållande till fartyget som arrangeras före kanylering. Uttaget av drogen leverans systemet är placerad på ett avstånd av ~ 500 µm från fartyget att minska rörelse artefakter under drog ansökan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Kanylering process för trycket myography. A) mikrofotografier visar en retinal arteriole förankras i inspelning kammaren före (i), under (ii)-(v) och följande kanylering (vi). Blå pil visar rörelseriktning av kanylen medan den gröna pilen visar rörelseriktning av helper pipetten. B) Photomicrograph visar optimal region för inspelning av myogenic aktivitet under trycksättning som markeras med rött. Observera att justering av ljus och fokus att öka kontrasten i kärlväggarna möjliggör bättre spårning av fartyg kanter för automatiserad analys. Skalstapeln anger 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Drug delivery. A) utrustning som används för drogen leverans visar lösning reservoarer ansluten till ett flerkanaligt leverans samlingsrör kontrolleras av 3-vägs kranar och kopplad till en 3-axlig mekaniska manipulator. B) Diagram visar optimal vertikal placering av drogen leverans grenrör i förhållande till inspelning kammaren. C) Photomicrograph av ett fartyg som förankras i inspelning kammaren visar perfekt positionering av drogen leverans utlopp. Skalstapeln representerar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Enzymatisk nedbrytning av retinal arterioler för patch-clamp inspelning. Ljus micrographs av en retinal arteriole innan (A) och efter (B) enzymatisk nedbrytning. Observera den fysiska separationen (anges med pilar) av glatta muskelceller (SMCs) från underliggande endotelceller (ECs). Glatta muskelceller passar patch fastspänning är markerade med en asterisk. Skalstapeln representerar 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Enda kanal och hela cellen patch clamp inspelning. A) Illustration av test strömmarna observerats under protokollet 'tätning prov' när: (i) patch pipetten in externa bad medium, (ii) pipettspetsen kommer i kontakt med vaskulär glatt muskulatur plasma cellmembranet och (iii) sug är tillämpas på baksidan av pipetten att aktivera gigaseal bildning. Efter pipett kapacitans ersättning använda patch clamp förstärkaren, enda kanal strömmar kan nu registreras i konfigurationen av på-cell eller en lapp av membran kan vara censurerade av snabbt återkalla pipetten för att skapa en 'inside-out' patch. B) aktuella förändringar i samband med utvecklingen av elektriska åtkomst till cell inre under tillämpningen av amfotericin B hela-cellen perforerade patch clamp teknik (i): (ii) som amfotericin B partitioner i membranet, tillgång motstånd falls och kapacitans transienter framkallade under hyperpolarizing spänningen steg (från -40 till -60 mV) blir större; (iii) när tillgång motstånd (Ren) har sjunkit till < 15 MΩ, som oftast tar 5-10 min efter gigaseal bildande, är experimenterande möjligt. C) innan det hela-cell inspelning, tillgång till motstånd och cell kapacitans måste kompenseras med relevanta rattarna på patch clamp förstärkaren. Värden för tillgång till motstånd och cell kapacitans som tillhandahålls av automatiserade funktioner inom patch-clamp programvara kan användas för att vägleda denna process: (i) visar kapacitansen övergående innan ersättning tas från det markerade området i snabbtestats; (ii) visar en minskning i kapacitansen övergående normalt observerades när tillgång motstånd och kapacitans kompenseras; (iii) serie motstånd ersättning bör sedan korrigeras upp till 75% och tillgång till motstånd och kapacitans ersättningar finjusteras så att den resulterande transient bör vara relativt lika i amplitud ovan och nedan platån nivån på nuvarande under steget. (iv) vård bör vidtas för att säkerställa att tillgång motståndet inte över kompenseras (indikeras av förekomsten av 'ringmärkning' av övergående), som kan uppstå ibland om åtkomst fortsätter att förbättras under experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 . Identifiering av isolerade råtta retinal arterioler. A) Illustration visar ordningen av råtta retinal mikrovaskulära trädet. B) Confocal bilder av råtta retinal arterioler och venoler inom platt fäste preparat färgas för αSMA (röda kärnor färgas blå; skala staplarna representerar 50 µm). C) ljus micrographs av isolerade 1 °, 2 ° och före kapillär arterioler, ett välutbyggt nät och venule (skala staplarna representerar 10 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 . Arteriolär trycket myography inspelningar. A) bilder av en kanylerade retinal arteriole visar (i) vilar diameter (cirka 35,6 µm), (ii) dilatation vid trycksättning, (iii) utveckling av myogenic vasokonstriktion och (iv) utvidgning på grund av tillägg av 10 µM wortmannin i 0Ca2 + Hanks lösning. Skala bar representerar 10 µm. B) tid kursen tomt fartyg diametern för hela experimentet visas i A (urvalet på 2,5 bildrutor/s). C) Diameter spåra från en annan arteriole under steady state myogenic ton (diameter 38,7 µm) visar effekterna av den Kv1 kanal hämmare correolide (10 µM) och BK kanal hämmare iberiotoxin (100 nM) (urvalet på 0,5 bildrutor/s). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 . Effekterna av Et-1 på [Ca2 +] jag signalering aktivitet i råtta retinal arterioler. A) konventionell fura-2-baserade inspelning visar effekterna av Et-1 (10nM) på globala [Ca2 +]jag. Basala [Ca2 +]jag var 82 nM i detta 1 ° arteriole. B) Fluo-4-baserade confocal xt bilder visar effekterna av Et-1 på [Ca2 +]jag på cellnivå. C) tomt på normaliserade fluorescensintensiteten (F/F0) mätt i celler som markerats i B. Denna siffra har ändrats från Tumelty et al. 30 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9 . Enda kanal och hela-cell patch-clamp inspelningar från råtta retinal arteriolär glatta muskelceller. A, B) på-cell enda kanal inspelningar från samma membranet patch före (A) och under (B) tillämpningen av undertryck (-45 mmHg) till lapp Pipettera. Två kanaler finns i plåstret (enhetlig nuvarande 12,81 pA; enhetlig konduktans 249.71 pS) som visar en betydande ökning av aktiveringen stretch villkor. Utvalda områden från övre panelerna visas (i) på en snabbare tid bas i de lägre paneler (ii). C) familj av A-typ K+ kanal strömmar (i) inspelade i hela cellen läge i närvaro av hämmare av BK och Ca2 +-aktiverade Cl– kanal hämmare, framkallade svar på 20 mV spänning steg om mellan -80 mV till + 80 mV (ii). D) hela cellen strömmar (i) framkallas av spänning ramper mellan -80 mV och + 80 mV innan (svart linje) och under (röda linjen) tillämpningen av de TRPV2 kanal agonist delta-9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC). Spänning ramp protokollet används visas i den nedre panelen (ii). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10 . Ca2 + confocal imaging före och efter trycksättning av en råtta retinal arteriole. Trycklösa representativa confocal xt skanningar a av retinal arteriolär glatta muskelceller under (A) och (B) trycksatt villkor som erhålls från olika regioner av samma fartyg. (ii) förändringar i normaliserade fluorescens (F/F0) inspelad i enskilda celler a - e, som anges i (i), plottas mot tiden. Asteriskerna visar enskilda subcellulär Ca2 + gnistor som ökad frekvens efter trycksättning och lägga samman för att utlösa cellulära Ca2 + svängningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Förening (mM) Låg Ca2 + Hanks 0Ca2 + Hanks Normala Hanks Isolering enzymet proteas Isolering enzym kollagenas Isolering enzym DNAS Släcka lösning Rmin lösning Rmax lösning Cell fäst extracellulära lösning Cell fäst pipett lösning Hela-cell extracellulära lösning Hela-cell pipett lösning
Vattnets renhet (motstånd) ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm
NaCl 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140
kCl 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 138
D-glukos 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
MgCl2 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1
HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
CaCl2 0,1 2 0,1 0,1 0,1 10 2 2 2 0,2
EGTA 4 0,5
MnCl 10
Ionomycin 0,01
KOH 140 130
D-glukonsyra 130 130
NaOH 10
Penitrem A 0,0001 0,0001 0,0001
4-aminopyridin 10
Nimodipine 0,01 0,01
Fluoxetin 0,1
9-anthracenecarboxylic acid 1
Amfotericin B 300-600 μg mL-1
Proteas typ XIV ~0.01% (0,4-0,6 mg/40 mL)
Kollagenas typ 1A 0,1% (6 mg/60 mL)
DNAS jag 20 KU (20 μL av 1 Me/mL lager i 20 mL)
pH 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7.2
titreras med NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH Tris Tris NaOH KOH

Tabell 1. Sammansättningen av lösningar används i experiment bland annat exempel på externa och pipett lösningar för enda kanal (TRPV2) och hela cellen (A-typ) strömmar.

Discussion

De protokoll som beskrivs ovan kräver praxis men bör uppnås med minimal felsökning. En genomsnittlig dag skulle vi få 6-8 användbara arterioler från isolering och uppnå 3-4 framgångsrika experiment. Om problem påträffas, men finns det några steg som kan vidtas för att förbättra framgång priser. Ibland har vi funnit, särskilt när du använder yngre råttor (< 8 veckor), att avkastningen av arterioler kan vara låg. För att kringgå problemet, skulle vi föreslå centrifugering retinala vävnaden (10-30 s vid 500 x g) mellan var och en av triturationen steg i steg 1.12-1,14. Detta hjälper till att förbättra avkastningen av fartyg ofta men kommer också att öka mängden cellfragment inom beredning.

När cannulating fartyg för tryck myography studier är det viktigt att kontrollera arterioler noggrant för någon sida-grenar som kan har varit tätt nära webbplatsen bifurkation. Detta utgör en vanlig orsak till läckage och tryckfall under experiment. Den viktigaste frågan som kan uppstå med [Ca2 +]jag protokollen är nivån på dye lastning. Dålig dye lastning leder till lågt signal-till-brus-förhållande, medan överbelastning resulterar i störningar av normal Ca2 + homeostas. För att minska sannolikheten för något av dessa problem, en liten alikvot av retinal Homogenatet kan avlägsnas, och isolerade fartyg kontrolleras regelbundet under lastning protokollet. När företaget patch-clamp experiment, andelen framgångsrika gigaseal bildandet är starkt beroende av hur väl har den basala lamina varit smält. När först testa detta protokoll eller använda nya massor av enzymer kan det nödvändigt att justera koncentration/varaktighet enzym matsmältningen. Noggrant övervaka separation av endothelial och smidig muskel lagren kommer att säkerställa tillräcklig matsmältningen ta bort nog basala laminal att få tillgång. Noggrann övervakning är också nödvändigt att undvika överdriven matsmältningen, vilket kan yttra sig som fartyget börjar att tygla. Om detta inträffar, är glatta muskelceller ofta alltför bräcklig för patch clamp inspelning. Vid tillämpning av enzymer, det är viktigt att inkludera DNAS I att säkerställa borttagning av strängar av DNA befriade från skadade celler under processen isolering. DNA-fragment är klibbiga och orsaka tången att följa arteriole under slutfasen av reningsprocessen (steg 4,4), ofta resulterar i fartyget förlust. Rengöring av fartyg är tekniskt svåra och utförs bäst vid hög förstoring (20 X) med mjuka svepande rörelser av stängt pincett av finaste möjligt spets diameter. Mellan sveper, rengöra tången med lab roll.

Som framhållits tidigare var en viktig motivation bakom utvecklingen av de protokoll som beskrivs i detta manuskript att bättre förstå varför blodflödet störs under retinala vaskulära sjukdomar. De flesta av vårt arbete hittills har fokuserat på diabetiker öga sjukdom28,33. Arterioler kan isoleras från näthinnor av experimentella djurmodeller för diabetes med hjälp av de metoder som beskrivs i avsnitt 1. När experimentera på isolerade retinal arterioler från diabetiska djur, är det viktigt att försöka nära replikera hyperglykemiska villkor upplevs av de fartyg i vivo. Därför skulle vi normalt höja D-glukos nivåerna i vår isolering och experimentella lösningar till 25 mM. Förtjockning av vaskulär källaren membran är ett välkänt fenomen i retinala kärl under diabetes34,35. När du använder djur med långvarig diabetes (> 1 månader sjukdom varaktighet), är ökad enzym koncentrationer eller matsmältningen gånger ofta nödvändiga för att tillämpningen av patch-clamp inspelning metoder.

En viktig begränsning av använda ex vivo isolerade retinal arterioler att studera retinal vaskulär fysiologi och patofysiologi är förlusten av den omgivande retinal neuropile. Även om borttagning av retinal gliaceller och neuronala celler ger enkel tillgång till de retinala vaskulära glatta muskelcellerna för fysiologi cellstudier, kan svar på fartygen vasoaktiva medlare förändras dramatiskt i frånvaro och närvaro av retinal vävnad. Åtgärder av adenosin-tri-fosfat (ATP), exempelvis ge en bra illustration av denna punkt. I isolerade råtta retinal arterioler, tillägg av ATP utlöser en robust förträngning fartyg36, medan i närvaro av en intakt neuropile, kärlen vidgas37. Därför där så är möjligt, försöka vi brukar validera viktiga resultat från våra isolerade arteriole förberedelser använda ex vivo retinal hela-fästen och i vivo mätningar av fartyget diameter och blod flöde16,37 . Notera uppstått nyligen nya metoder för att studera små arterioler och kapillärer i hela perfunderade svin näthinnor ex vivo38,39. Sådana preparat är sannolikt att avsevärt förbättra vår förståelse av hur den retinala neuropile reglerar retinal arteriolär och kapillär ton och hur förändringar i näthinnans hemodynamik modulera neuronal aktivitet i näthinnan.

Även om de förfaranden som beskrivs i denna uppsats fokuserar på användningen av isolerade råtta retinal arterioler för förståelse arteriolär muskulatur cellfysiologi, utvecklar vi för närvarande protokoll för att även möjliggöra studiet av endotelceller funktion i dessa fartyg. I förarbete, har vi varit framgångsrika i ändrande enzymatisk nedbrytning av retinal arteriolär segment att ge livskraftiga endotelceller rör som är Ca2 + imaging och patchclamp inspelning studier. Kanylering av de isolerade arterioler i båda ändar, att aktivera intraluminal leverans av narkotika, kunde i framtiden också aktivera endotel-beroende vasodilaterande Svaren ska undersökas i dessa fartyg.

Disclosures

Dr Joanna Kur är nu anställd av Medtronic (Tvilling-städer, Minnesota, USA), hennes nuvarande arbete inte står i konflikt med som presenteras här.

Acknowledgments

Utvecklingen av de protokoll som beskrivs i denna uppsats stöddes av bidrag från finansiärer om följande: BBSRC (BB/I026359/1), kampen för syn (1429 och 1822), The Juvenile Diabetes Research Foundation (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), Brittiska hjärtat Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D Division (STL/4748/13) och MRC (MC_PC_15026).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers Fisherbrand 15409083 Or any equilavent product
Curved Scissors Fisher Scientific 50-109-3542 Or any equilavent product
Disposable plastic pipette/ transfer Sarstedt 86.1174 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture
Dissecting microscope Brunel Microscopes LTD Or any equilavent product
Forceps World Precision Instruments Dumont #5 14095 Any equivalent fine forceps
Pasteur pipette Fisherbrand 11546963 Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip
Petri dish Sigma-Aldrich P7741 Or any equilavent 10cm product
Pipette teat Fisherbrand 12426180 Or any equilavent product
Purified water supply Merek Milli-Q Integral Water Purification System Or any equilavent system
Round bottomed test tube Fisherbrand 14-958-10 B 5 mL; any equilavent product
Seratted forceps Fisher Scientific 17-467-230 Or any equilavent product
Single edge blades Agar Scientific T585 Or any equilavent product
Sylgard Dow Corning 184 Or any pliable surface 
Testtube rack Fisherbrand Derlin 10257963 Or any equilavent product
Pressure myography
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  x2 (or any equilavent product)
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Analysis software  Image J https://downloads.imagej.net/fiji/ Free imaging software
Analysis plugin Myotraker  https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 Custom plugin for imageJ Freely available for download
Cannulation pipette glass World Percision instruments TW150F-4 Or any equilavent product
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
Fluo-4-AM Thermo Fisher Scientific F14201 Make 1 mM stock in DMSO
Forceps World Precision Instruments Dumont #7 14097 Any equivalent fine forceps
Fura-2-AM Thermo Fisher Scientific F1221 Make 1 mM stock in DMSO
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
Helper pipette glass World Percision instruments IB150F-3 Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclypse TE 300 Or any equilavent product
Manometer Riester LF1459 Or any equilavent product
Microelectrode puller Sutter instruments P97 Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope Glassworks Fine Point F-550 Or any equilavent product
Micromanipulator Sutter instruments MP-285 Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder Molecular Devices 1-HL-U Or any equilavent product
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W558818 75μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Or any equilavent product
USB camera  Logitech  HD Pro Webcam C920 Or any equilavent product
Video capture software Hypercam version 2.28.01 Or any equilavent product
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Patch clamping
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  Or any equilavent product
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve)
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200a Or any equilavent product
Analogue digital converter Axon Digidata 1440A Or any equilavent product
Collagenase Type 1A Sigma-Aldrich C9891  0.1mg/mL in LCH
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
DNAse I Millipore 260913 Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) 
Faraday cage Custom made Any equilavent commerical product
Fine forceps Dumont No. 7 Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
Headstage Molecular Devices CV203BU Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclypse TE 300 Or any equilavent product
Microelectrode puller Sutter instruments P97 Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope Glassworks Fine Point F-550 Or any equilavent product
Micromanipulator Sutter instruments MP-285 Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Patching software Molecular Devices Pclamp v10.2 Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder Molecular Devices 1-HL-U Or any equilavent product
Protease Type XIV Sigma-Aldrich P5147  0.01mg/mL in LCH
Single channel pipette glass World Percision instruments IB150F-3 Or any equilavent product
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W557418 50μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Any equilavent product to fit
USB camera  Logitech  HD Pro Webcam C920 Or any equilavent product
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
Whole cell pipette glass Warner Instruments GC150TF-7.5 Or any equilavent product
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product
x40 lens Nikon 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 Or any equilavent product
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Ca2+ imaging
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  Or any equilavent product
Acquisition software  Cairn Research Ltd. Acquisition Engine V1.1.5 Or any equilavent product; microfluorimetry
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Analysis software for confocal imaging Image J https://downloads.imagej.net/fiji/ Free imaging software
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Confocal microscope Leica Geosystems SP5  Or any equilavent product; confocal
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
Fine forceps Dumont No. 7 Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000 Or any equilavent product; microfluorimetry
Monochromator  Cairn Research Ltd. Optoscan Or any equilavent product; microfluorimetry
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Software for confocal microscope Leica Geosystems LAS-AF version 3.3. Or any equilavent product; confocal
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W557418 50μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Any equilavent product to fit
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
x100 lens Nikon x100 N.A. 1.3 oil Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens Leica Geosystems HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D Or any equilavent product; confocal
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product; microfluorimetry
x63 lens Leica Geosystems HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS ∞/0.17/E Or any equilavent product; confocal
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Pipettes Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation
Helper pipette World Percision instruments IB150F-3 Inner diameter: 0.86 mm
Ramp: 261
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 56
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 0.5-2 μm
Polishing: yes
Final Resistance: >10 MΩ
Cannulation pipette World Percision instruments TW150F-4 Inner diameter: 1.17 mm
Ramp: 290
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 58
Time: 150
No of cycles: 4
Tip diameter: 3-10 μm
Polishing: no
Final Resistance: <1 MΩ
On-cell patching World Percision instruments IB150F-3 Inner diameter: 0.86 mm
Ramp: 261
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 56
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 0.5-2 μm
Polishing: yes
Final Resistance: >5 MΩ
Whole-cell patching Warner Instruments GC150TF-7.5 Inner diameter: 1.17 mm
Ramp: 296
Pressure: 200
Heat: 287
Pull : 0
Velocity: 50
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 2-3 μm
Polishing: helpful but not necessary
Final Resistance: 1-2 MΩ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Diabetes. 44, 603-607 (1995).
  2. Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects. American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).
  3. Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis? Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).
  4. Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease). Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).
  5. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).
  6. Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
  7. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).
  8. Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
  9. Delaey, C., Van de Voorde, J. Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation. Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).
  10. Metea, M. R., Newman, E. A. Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling. Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).
  11. Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).
  12. Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).
  13. Shepro, D., Morel, N. M. Pericyte physiology. The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).
  14. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network. Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).
  15. Matsushita, K., Puro, D. G. Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes. Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).
  16. Needham, M., et al. The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).
  17. Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles. Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).
  18. Delaey, C., Van de Voord, J. Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).
  19. Kur, J., et al. Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).
  20. Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).
  21. Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).
  22. McGahon, M. K., et al. TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).
  23. Guidoboni, G., et al. Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).
  24. Scholfield, C. N., Curtis, T. M. Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina. Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).
  25. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
  26. Sakmann, B., Neher, E. Single Channel Recording, Second Edition. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).
  27. Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis. PLoS One. 9, e91791 (2014).
  28. McGahon, M. K., et al. Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle. Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).
  29. Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
  30. Tumelty, J., et al. Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).
  31. Huynh, K. W., et al. Structural insight into the assembly of TRPV channels. Structure. 22 (2), 260-268 (2014).
  32. McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).
  33. McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes. Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).
  34. Ljubimov, A. V., et al. Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).
  35. Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).
  36. Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
  37. Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).
  38. Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level. Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).
  39. P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).

Tags

Biologi fråga 137 Retinal arteriole isolering myogenic tonen myography patch-clamp arteriolär glatt muskulatur blod flöde självregleringen kalcium imaging
Isolering av Retinal arterioler för <em>Ex Vivo</em> cellstudier fysiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Curtis, T. M., McLaughlin, D.,… More

Curtis, T. M., McLaughlin, D., O'Hare, M., Kur, J., Barabas, P., Revolta, G., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., McGahon, M. K. Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies. J. Vis. Exp. (137), e57944, doi:10.3791/57944 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter