Summary
यहां, हम एक निश्चित मस्तिष्क टुकड़ा में इमेजिंग myelinated axons के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत एक लेबल मुक्त नेनो इमेजिंग वर्णक्रमीय reflectometry पर आधारित तकनीक का उपयोग कर ।
Abstract
एक स्तनधारी तंत्रिका तंत्र में, myelin एक multilayered सर्पिल में axon फाइबर enwrapping द्वारा एक बिजली के इंसुलेशन प्रदान करता है । इसकी अत्यधिक संगठित सेलुलर वास्तुकला से प्रेरित होकर, हमने हाल ही में एक नई इमेजिंग रूपरेखा विकसित की, जिसका नाम वर्णक्रमीय reflectometry (SpeRe) है, जो सीटू मेंलाइव myelinated axons के अभूतपूर्व लेबल-मुक्त नेनो इमेजिंग को सक्षम बनाता है । अंतर्निहित सिद्धांत multilayered उपसेलुलर संरचना के चिंतनशील स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करके nanostructural जानकारी प्राप्त करने के लिए है । इस अनुच्छेद में, हम एक विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल तंत्रिका ऊतकों का एक बुनियादी SpeRe इमेजिंग प्रदर्शन एक वाणिज्यिक फोकल सूक्ष्म प्रणाली का उपयोग करने के लिए, एक सफेद प्रकाश लेजर और एक स्वरित्र फिल्टर के साथ सुसज्जित का वर्णन । हम नमूना तैयारी की प्रक्रियाओं को कवर, वर्णक्रमीय डेटा के अधिग्रहण, और nanostructural जानकारी प्राप्त करने के लिए छवि प्रसंस्करण.
Introduction
स्तनधारी तंत्रिका तंत्र में, myelin axon multilayered के आवरण के साथ झिल्लीदार फाइबर enwrapping द्वारा तेजी से तंत्रिका चालन और axonal अखंडता प्रदान करता है । इसकी multilayered संरचना बारी नेनो पतली-प्लाज्मा झिल्ली (~ 5 एनएम), cytosol (~ 3 एनएम), और extracellular रिक्त स्थान (~ 7 एनएम)1,2से बना फिल्मों से बना है । हाल ही में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी सहित ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी, ऑप्टिकल विवर्तन के कारण उनके अपर्याप्त संकल्प के कारण नेनो myelin गतिशीलता अवलोकन के लिए उपयुक्त नहीं हैं3,4,5. हालांकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी myelin nanostructure के ठीक विवरण प्रदान कर सकते हैं, यह अत्यधिक इनवेसिव नमूना रासायनिक निर्धारण और6ultrasectioning शामिल तैयारियों के कारण रहने वाले जैविक प्रणालियों के साथ संगत नहीं है,7 . हाल ही में जब तक, वहां कोई तकनीक को सीटू मेंmyelinated axons के नेनो गतिशीलता निरीक्षण लागू किया गया है ।
Schain एट अल. पहले बताया गया है कि myelinated axons प्रदर्शन रंगीन प्रकाश चिंतनशील8. परिलक्षित प्रकाश पर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण अपनाने से, हमने myelinated axons के नेनो इमेजिंग के लिए एक नई इमेजिंग मोडल ईजाद की है, जिसका नाम वर्णक्रमीय reflectometry (SpeRe)9है । SpeRe myelin म्यान (चित्रा 1) की बहु स्तरित संरचना में होने वाली पतली फिल्म हस्तक्षेप पर आधारित है । विभिंन axons पर ऑप्टिक सिमुलेशन द्वारा, हमें पता चला है कि चिंतनशील स्पेक्ट्रम wavenumber के आवधिक कार्य है और इसकी आवधिकता (
) axon व्यास (डी) के लिए व्युत्क्रम आनुपातिक है । यह सरल संबंध (
) SpeRe डेटा से axon व्यास के सतही ठहराव प्रदान करता है । इस का उपयोग, हम प्रचलित axon हमारे पूर्व रिपोर्ट में हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के तहत उभार से पता चला ।
SpeRe प्रणाली फोकल माइक्रोस्कोपी पर आधारित है और एक विशेष लेजर स्रोत और फिल्टर (चित्रा 2) के होते हैं । इनपुट स्रोत एक सफेद प्रकाश लेजर है, अवरक्त क्षेत्रों के लिए दिखाई ब्रॉडबैंड वर्णक्रमीय उत्पादन प्रदान करते हैं । वर्णक्रमीय स्कैन के लिए, प्रणाली दो acousto ऑप्टिक उपकरणों के साथ सुसज्जित है: एक acousto ऑप्टिक स्वरित्र फ़िल्टर (AOTF) इनपुट ब्रॉडबैंड स्रोत और एक acousto ऑप्टिक बीम अलगानेवाला (AOBS) चयनित मार्गदर्शक के लिए से एक चयनित तरंग दैर्ध्य देने के लिए प्रतिबिंबित डिटेक्टर के लिए तरंग दैर्ध्य । hyperspectral फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) क्रमिक रूप से विभिन्न इनपुट तरंग दैर्ध्य पर चिंतनशील छवियों को प्राप्त करने के लिए एक अनुकूलन वर्णक्रमीय स्कैन विकल्प प्रदान करता है. इसके अलावा, रंगीन विचलन गंभीर वर्णक्रमीय माप में हस्तक्षेप कर सकते हैं; इसलिए, एक apochromat उद्देश्य लेंस के उपयोग की सिफारिश की है ।
नोट के, सफेद प्रकाश पराबैंगनीकिरण एक असमान वर्णक्रमीय उत्पादन का उत्पादन और ऑप्टिकल घटक भी वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल को प्रभावित करते हैं । इसलिए, प्राप्त स्पेक्ट्रा अनुवर्ती मात्रात्मक विश्लेषण के लिए तुले होने की जरूरत है । एक संरक्षित चांदी दर्पण आम तौर पर एक संदर्भ है, जो एक लगभग निरंतर चिंतनशील प्रदान करता है के रूप में प्रयोग किया जाता है (> ९७%) पूर्ण दिखाई क्षेत्र पर । अधिग्रहीत स्पेक्ट्रा तो संदर्भ स्पेक्ट्रा द्वारा दर्पण से विभाजित हैं ।
वर्णक्रमीय स्कैन के लिए वर्णक्रमीय चरण आकार अधिग्रहण की गति को निर्धारित करता है; इस प्रकार, यह अनुकूलित करने की जरूरत है । एक बड़ा axon के रूप में एक उच्च वर्णक्रमीय अवधि है, यह महीन वर्णक्रमीय नमूना की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, 10 µm, सबसे बड़ा शारीरिक axons में से एक के एक व्यास के साथ एक axon, ~ 8 एनएम के एक वर्णक्रमीय अवधि है । Nyquist नमूना मानदंड लागू करके, हम 4 एनएम के वर्णक्रम नमूना अंतराल कार्यरत सभी शारीरिक axons माउस तंत्रिका ऊतकों में कवर करने के लिए । इस दृष्टिकोण आम तौर पर एक पूर्ण वर्णक्रमीय स्कैन के लिए कई सेकंड से अधिक लेता है और इस तरह vivo अनुप्रयोगों में के लिए उपयुक्त नहीं है, जहां शारीरिक गति (जैसे श्वसन और दिल की धड़कन) स्थिर वर्णक्रमीय अधिग्रहण हस्तक्षेप. हम पहले एक अनुकूलित ईमानदार खुर्दबीन, एक सरणी स्पेक्ट्रोमीटर (अधिग्रहण गति ≈ पिक्सेल प्रति 30 ms) का उपयोग कर एक बिंदु के लिए पूर्ण स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए डिजाइन साधन द्वारा इस मुद्दे को हल ।
इस रिपोर्ट में, हम एक निश्चित मस्तिष्क स्लाइस पर SpeRe इमेजिंग पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है, जो एक वाणिज्यिक hyperspectral माइक्रोस्कोप में प्रदर्शन किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें). इस प्रकार, प्रोटोकॉल ऑप्टिकल इंस्ट्रूमेंटेशन में विशेषज्ञता के बिना प्रयोगकर्ता द्वारा पूरा किया जा सकता है । हम भी संभावित मुद्दों और अधिग्रहण और SpeRe डेटा के विश्लेषण के लिए समस्या निवारण को कवर किया ।
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Protocol
सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं Sungkyunkwan विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. नमूना तैयारी
नोट: पशु हैंडलिंग से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों को आटोक्लेव । शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए समर्पित एक कमरे में सभी शल्य चिकित्सा प्रदर्शन का संचालन । बाँझ सर्जिकल गाउन और दस्ताने हर समय सर्जिकल कमरे में सभी कर्मियों द्वारा पहना जाना चाहिए ।
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ऊतक निर्धारण
- २ १० मिलीलीटर प्रत्येक सीरिंज को फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) और पंजाब में 4% paraformaldehyde (पीएफए) से भरा तैयार करें ।
- Anesthetize एक 7-12 सप्ताह पुराने माउस, (C57BL/6J या तो लिंग के साथ किसी भी माउस लाइनों) zoletil और xylazine का एक मिश्रण प्रशासन द्वारा (1:1, 20 मिलीग्राम/प्रत्येक) या एक वैकल्पिक उपयुक्त संज्ञाहरण शासन (जैसे, ८० मिलीग्राम/किग्रा ketamine का मिश्रण और 10 मिलीग्राम/ xylazine) एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ ।
- एक बार माउस संज्ञाहरण के एक सर्जिकल विमान तक पहुंच गया है (पैर की अंगुली चुटकी-प्रतिक्रिया विधि का उपयोग करें), बंद त्वचा काटने और कैंची के साथ रिब पिंजरे से दिल बेनकाब ।
- सही atrium छोटी कैंची से खून बह रहा है और perfuse और पीएफए समाधान क्रमिक रूप से एक सुई के साथ छोड़ दिया निलय के माध्यम से (छिड़काव दर = 4 मिलीलीटर/मिनट, मात्रा = 10 मिलीलीटर प्रत्येक समाधान के लिए) ।
नोट: प्रक्रिया सफलतापूर्वक पूरा हो गया है, तो माउस कड़ा हो जाता है । आंख मरहम या नसबंदी के उपयोग के रूप में आवश्यक नहीं है प्रक्रिया टर्मिनल है । निर्धारण प्रक्रिया को छोड़ दिया जा सकता है । हालांकि, इस कदम यांत्रिक ऊतक क्षति और कोरोनरी axonal सूजन सहित संरचनात्मक विकृति को कम करने के लिए सिफारिश की है । ऊतक निर्धारण के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पण, जी जे एट अल द्वारा लेख का संदर्भ लें । 10
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मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी
- ventral छाती और पेट के माध्यम से सर्जिकल कैंची के साथ माउस Decapitate ।
- खोपड़ी और पूरी तरह से cranium को उजागर जब तक एक उपयुक्त छोटे कैंची का उपयोग कर periosteum निकालें ।
- ललाट हड्डी को तोड़ने और मस्तिष्क को नुकसान नहीं देखभाल के साथ छोटे कैंची का उपयोग कर पश्चकपाल हड्डी से sagittal सीवन के साथ cranium में कटौती ।
- धीरे से निकालें cranium और बाडी मेटर क्रमिक रूप से ठीक संदंश का उपयोग कर ।
- एक नरम प्लास्टिक चंमच का उपयोग कर मस्तिष्क निकालने, ध्यान ऊतक नुकसान नहीं ले ।
- कुल्ला और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक 4% पीएफए समाधान में निकाले मस्तिष्क सोख ।
- १०० में फिक्स्ड ब्रेन स्लाइस-१५० µm एक vibratome का उपयोग कर वर्गों ।
नोट: ऊतक तैयार करने पर अधिक जानकारी के लिए, Segev एट अल द्वारा लेख को देखें । 11. बाद की प्रक्रियाओं के लिए, ऊतक स्पेसर की मोटाई से पतले वर्गों में कटा हुआ होना चाहिए ।
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मस्तिष्क स्लाइस के बढ़ते
- प्रत्येक ऊतक टुकड़ा के लिए 1 ग्लास स्लाइड और 2 वर्ग कवर चश्मा (22 × 22 × ०.१७ mm) तैयार करें ।
- एक गिलास कटर का उपयोग करके आधा (दो आयताकार टुकड़े) में वर्ग कवर चश्मे में से एक में कटौती ।
- स्लाइड कांच पर एक सुपर गोंद का उपयोग कर आधा कवर चश्मे के दो देते हैं ।
नोट: दो आधा गिलास के बीच अंतरिक्ष ऊतक टुकड़ा के आकार से थोड़ा बड़ा होना चाहिए । - एक ब्रश या एक पिपेट का उपयोग कर मस्तिष्क टुकड़ा फसल और स्पेसर के बीच स्लाइड ग्लास पर ऊतक रखना । ध्यान रखना ऊतक गुना नहीं ।
- ऊतक की सतह पर पंजाबियों के १०० μL का वितरण ।
- ऊतक के शीर्ष पर अंय वर्ग कवर गिलास प्लेस । इस चरण के दौरान हवाई बुलबुले को शामिल करने से बचें ।
- एक नेल पॉलिश का उपयोग कर कवर गिलास के चारों ओर सील (या वैकल्पिक रूप से उपयुक्त चिपकने वाले) बाद के इमेजिंग सत्र के दौरान धूल से पंजाबियों और प्रदूषण के वाष्पीकरण को रोकने के लिए.
नोट: प्रयोगकर्ता इस अवस्था में ठहर सकता है.
2. अंशांकन
- इमेजिंग के लिए लेजर स्रोत के थर्मल स्थिरीकरण की अनुमति ( सामग्री की तालिकादेखें) से पहले कम से कम 1 ज माइक्रोस्कोप पर स्विच करें । फिर, वर्णक्रमीय स्कैनिंग के लिए सॉफ्टवेयर पर बारी ( सामग्री की तालिकादेखें) और जीयूआई के शीर्ष पर प्राप्त बटन (3 ए आंकड़ा) पर क्लिक करें।
- व्हाइट-लाइट लेज़र (डब्ल्यूएलएल) और photomultiplier ट्यूब (PMT) (चित्र 3ए) के लिए सॉफ़्टवेयर शटर चालू करें ।
- प्राप्ति मोडमें ड्रॉप-डाउन सूची पर xyΛ मोड का चयन करें, फिर, लेज़र इनपुट मोड स्वचालित रूप से निरंतर प्रतिशत से निरंतर पावरमें परिवर्तित हो जाता है । स्वत: SP आंदोलनके चेक-बॉक्स को अनचेक करें । और फिर, इनपुट लेजर के वर्णक्रमीय खिड़की 470-670 एनएम और वर्णक्रमीय कदम आकार Λपर 4 एनएम के लिए सेट-उत्तेजना लैंब्डा स्कैन सेटिंग्स (चित्र 3 बी) ।
- पर डबल क्लिक करके या वर्णक्रमीय रेंज (चित्रा 3सी) के लिए समायोजन पट्टी चलती द्वारा 450-690 PMT के वर्णक्रमीय सीमा सेट करें ।
नोट: इस वर्णक्रमीय सीमा इनपुट स्रोत की पूरी बैंडविड्थ शामिल करना चाहिए । - एक जल-विसर्जन उद्देश्य लेंस का चयन करें, एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ उपयुक्त (NA > ०.७) और PMT और लेजर शक्ति को किसी भी मूल्य देने के लिए AOBS विन्यास और लाइव स्कैन बटन को सक्रिय. AOBS विंयास (चित्रा 3 डी) में प्रतिबिंब की जांच द्वारा ऑप्टिकल पथ स्विच ।
- एक संदर्भ दर्पण माउंट ( सामग्री की तालिकादेखें) माइक्रोस्कोप मंच पर । दर्पण सतह उद्देश्य लेंस के खिलाफ सामना किया जाना चाहिए । यदि यह आसान नहीं है माइक्रोस्कोप मंच पर दर्पण डाल, फ्लैट प्लेट (जैसे स्लाइड ग्लास) पर एक दर्पण बांड ।
- नियंत्रण माइक्रोस्कोप मंच दर्पण सतह के लिए फोकल विमान संरेखित करने के लिए ।
- पीएमटी लाभ और लेजर डिटेक्टर की गतिशील रेंज पर विचार शक्ति को समायोजित करने और फिर लगातार बिजलीके लिए निरंतर प्रतिशत से लेजर इनपुट मोड बदल जाते हैं ।
नोट: के रूप में विशिष्ट है, एक PMT लाभ की ५०० (V) और ०.१% की एक रिश्तेदार लेजर शक्ति ५७० एनएम पर उपयोग किया जाता है । - एक छद्म रंग मोड में पुष्टि करने के लिए जांच करें कि तरंग दैर्ध्य सीमा भर में कोई संतृप्ति है । यदि संतृप्ति मनाया जाता है, लेजर शक्ति कम (3 ए आंकड़ा) ।
- लैंब्डा स्कैन प्राप्ति चलाएँ ।
- मंच से दर्पण निकालें और एक नमूना के बिना एक ही अधिग्रहण दोहराने के क्रम में अंधेरे संदर्भ प्राप्त करने के लिए (यानी, अंधेरे ऑफसेट) ।
- डेटा को किसी Multistacked TIF स्वरूप में सहेजें ।
3. SpeRe छवि अधिग्रहण
- घुड़सवार ऊतक को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें । मोटे तौर पर उद्देश्य लेंस के फोकल विमान के लिए ऊतक संरेखित करने के लिए, एक आंख टुकड़ा के माध्यम से व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति मोड का उपयोग करें ।
- लाइव स्कैन के साथ, ऊतक में ब्याज के क्षेत्र के लिए फोकल विमान संरेखित करने के लिए माइक्रोस्कोप चरण नियंत्रित करते हैं । कवर स्लिप से पृष्ठभूमि शोर से बचने के लिए, कांच ऊतक अंतरफलक से कम से कम 15 माइक्रोन गहराई के लक्ष्य क्षेत्र का चयन करें ।
- वर्णक्रमीय छवि के लक्ष्य के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर क्षेत्र के लिए ढेर 2.1-2.10 चरणों में वर्णित प्राप्त ।
- ऊतक और Multistacked TIF प्रारूप में अंधेरे ऑफसेट के लिए डेटा सहेजें ।
नोट: प्रयोगकर्ता इस अवस्था में ठहर सकता है.
4. छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण
- संदर्भ दर्पण और ImageJ में मस्तिष्क के ऊतकों के लिए वर्णक्रमीय डेटा (multistacked TIF) खोलें ।
- खोला छवि के ढेर के लिए ROIs (ब्याज के क्षेत्रों) का चयन करें-संदर्भ दर्पण के लिए केंद्रीय क्षेत्र और मस्तिष्क के ऊतकों के लिए एक axon फाइबर के खंड ।
- ImageJ मेनू पर छवि → स्टैक्स → प्लॉट Z-अक्ष प्रोफ़ाइल चलाकर चयनित ROIs के लिए अपरिष्कृत स्पेक्ट्रा प्राप्त करना.
- अंधेरे ऑफसेट डेटा खोलें, एक संदर्भ दर्पण के लिए ले लिया और दूसरे मस्तिष्क ऊतक के लिए ले लिया ।
- ImageJ मेनू पर छवि → स्टैक्स → प्लॉट Z-अक्ष प्रोफ़ाइल चलाकर, अंधेरे ऑफ़सेट के लिए स्पेक्ट्रा प्राप्त करना.
- सभी अधिग्रहीत स्पेक्ट्रा की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ विकल्प का उपयोग करके सहेजें ।
नोट: SpeRe इमेजिंग के लिए, केंद्रीय इमेजिंग क्षेत्र के उपयोग से कम करने के लिए अक्ष ऑप्टिकल विचलन की सिफारिश की है । axon फाइबर अपनी लंबाई के साथ संरचनात्मक रूप से विषम हो सकता है । इसलिए, छोटे axon सेगमेंट पर ROI का चयन करना, आमतौर पर < 5 µm, आंशिक-वॉल्यूम विरूपण साक्ष्य को कम करने के लिए अनुशंसित है.
5. आधारभूत सुधार और SpeRe संकेत विश्लेषण
- ऑफसेट स्पेक्ट्रा को संदर्भ दर्पण और मस्तिष्क के स्पेक्ट्रा से घटाना ।
- स्पेक्ट्रम की अधिकतम तीव्रता विभाजित करके प्रत्येक स्पेक्ट्रम को सामान्य.
- axon के सामान्यीकृत स्पेक्ट्रम संदर्भ दर्पण के सामान्यीकृत स्पेक्ट्रम से विभाजित करें और डीसी ऑफसेट सामान्यीकृत स्पेक्ट्रम से घटाना है ।
- एक sinusoidal वक्र करने के लिए अधिग्रहीत स्पेक्ट्रम फिटिंग द्वारा wavenumber आवृत्ति को मापने ( सामग्री की तालिकादेखें), और फिर पारस्परिक लेने के द्वारा आवधिकता के लिए अधिग्रहीत wavenumber कन्वर्ट.
- चित्रा 4cमें समीकरण का उपयोग कर axon व्यास के लिए wavenumber आवधिक कन्वर्ट.
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Representative Results
प्रोटोकॉल के अनुसार, एक निश्चित मस्तिष्क टुकड़ा exogenous धुंधला, एक myelin लक्ष्यीकरण fluorophore ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ तैयार किया गया था । SpeRe इमेजिंग मस्तिष्क टुकड़ा पर फोकल प्रतिदीप्ति इमेजिंग (चित्रा 4a) के साथ संयोजन के रूप में एक वाणिज्यिक hyperspectral फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था । SpeRe के लिए, इनपुट ऑप्टिकल तीव्रता ~ 1 µs के एक पिक्सेल निवास के समय के साथ 5 µW/µm2 के लिए सेट किया गया था । यह हल्की खुराक पारंपरिक प्रतिदीप्ति फोकल माइक्रोस्कोपी12से एक आदेश के परिमाण कम से अधिक है । यह 4 एनएम (५१ छवियों) के एक अंतराल पर 470-670 एनएम से अधिक वर्णक्रमीय स्कैनिंग के लिए ~ 17 एस लेता है ।
SpeRe संकेत ऑप्टिकल प्रतिबिंब की ज्यामिति द्वारा उम्मीद के रूप में myelinated axons के केंद्र के साथ स्थानीयकृत किया गया था. एक axon खंड के चिंतनशील स्पेक्ट्रम से, wavenumber आवधिक प्राप्त किया गया था, जो बाद में axon व्यास (चित्रा 4b, सी) में परिवर्तित किया गया था । SpeRe द्वारा मापा व्यास प्रतिदीप्ति-आधारित माप (चित्रा 4d) के साथ अच्छे समझौते में पाया गया था. अवशिष्ट गौण त्रुटि या तो प्रतिदीप्ति-आधारित पद्धति के विवर्तन-सीमित रिज़ॉल्यूशन या SpeRe के लिए अपूर्ण ज्यामितीय मॉडल से उत्पंन हो सकती थी ।
SpeRe इमेजिंग ऑप्टिकल प्रतिबिंब पर आधारित है, इस प्रकार एक सिलिका आधारित coverslip एक महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि शोर शुरू कर सकते हैं । हमारे ऑप्टिक सेटअप में, पृष्ठभूमि शोर काफी था जब coverslip से इमेजिंग गहराई से कम 5 µm है, लेकिन जब इमेजिंग गहराई 15 µm (चित्रा 5) से अधिक है बचा लिया गया था ।
चित्रा 1 : SpeRe का सिद्धांत । Myelinated axon एक multilayered तनु फिल्म संरचना है । घटना प्रकाश आंशिक रूप से इंटरफेस पर बंद परिलक्षित होता है, के रूप में है Fresnel कानून द्वारा वर्णित है । ये प्रतिबिंबित प्रकाश तरंगों एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप; इसलिए, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिबिंबित प्रकाश एन्कोडर nanostructural जानकारी है । वर्णक्रमीय Reflectometry (SpeRe) myelinated axon से प्रतिबिंबित प्रकाश decoding द्वारा nanostructural जानकारी प्राप्त करता है । इस आंकड़े को Kwon, जे एट अल से रिप्रिंट किया गया है । 9 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : SpeRe प्रणाली का लेआउट । SpeRe प्रणाली एक फोकल रिफ्लेक्टर माइक्रोस्कोप पर आधारित है । वर्णक्रमीय स्कैनिंग के लिए, तीन अतिरिक्त घटक उत्तेजना पथ के साथ की जरूरत है: (1) एक supercontinuum लेजर, (2) acousto ऑप्टिक स्वरित्र फ़िल्टर (AOTF), और (3) acousto-ऑप्टिक बीम अलगानेवाला (AOBS) । ब्रॉडबैंड लेजर स्रोत वर्णक्रम से AOTF द्वारा फ़िल्टर के लिए एक संकीर्ण बैंडविड्थ के साथ एक चयनित तरंग दैर्ध्य संचारित है । नमूने के लिए उत्तेजना प्रकाश गाइड करने के लिए चयनित तरंग दैर्ध्य के लिए एक बीम अलगानेवाला के रूप में AOBS कार्य करता है. प्रकाश तो एक galvanometric स्कैनर और एक उद्देश्य लेंस के माध्यम से नमूने पर घटना है । नमूना से प्रतिबिंबित प्रकाश स्कैन, स्थानिकी एक फोकल pinhole द्वारा फ़िल्टर किया गया है, और photomultiplier ट्यूब (PMT) द्वारा एकत्र की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : सॉफ्टवेयर सेटअप । (a) ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (GUI) । मुख्य विंडो में, वहां मुख्य रूप से पांच उप पैनलों हैं: इमेजिंग सेटअप, लेजर सेटअप, ऑप्टिक सेटअप, डिटेक्टर सेटअप, और छवि दर्शक । (b) इमेजिंग मोड का चयन करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू । SpeRe के लिए, xyλ चयनित है । (ग) डिटेक्टर के लिए वर्णक्रमीय खिड़की को समायोजित करने के लिए पैनल । (घ) acousto-ऑप्टिक बीम अलगानेवाला (AOBS) की स्थापना के लिए पैनल. ' रिफ्लेक्टर ' डिटेक्टर को प्रतिबिंबित प्रकाश गाइड करने के लिए चुना जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : एक मस्तिष्क ऊतक पर SpeRe । (क) myelin (fluoromyelin) के एक फ्लोरोसेंट counterstaining के साथ सना हुआ एक murine मस्तिष्क ऊतक की एक SpeRe छवि । (b) (a) में सफ़ेद डैश्ड बॉक्स से प्राप्त एक प्रतिनिधि चिंतनशील स्पेक्ट्रम. (ग) वर्णक्रमीय आवधिकता से axon व्यास का अनुमान लगाने के लिए एक अनुकरणीय संदर्भ वक्र । नीला तारांकन (b) से प्राप्त डेटा बिंदु है । (घ) (क) में बॉक्सिंग क्षेत्र से प्रतिदीप्ति तीव्रता का आड़ा प्रोफ़ाइल. myelin बाहरी प्रतिदीप्ति संकेत का उपयोग करके अनुमान व्यास ~ ७६० एनएम है, जो SpeRe माप के साथ अच्छी तरह से सहमत है । अवशिष्ट त्रुटि प्रतिदीप्ति-आधारित माप की विवर्तन त्रुटि से गर्भित है । Scalebar, 5 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5 : एक कवर पर्ची का प्रभाव । (a, b) एक ही पार्श्व स्थिति में एक मस्तिष्क ऊतक के चिंतनशील छवियों ऊतक-coverslip इंटरफेस से अलग गहराई पर प्राप्त कर रहे हैं: पर 3 µm (एक) और 15 µm (बी) । Scalebar, १० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
SpeRe एक नया लेबल-मुक्त इमेजिंग वर्णक्रमीय interferometry है, जो पहली बार के लिए, लाइव myelinated axons में नेनो जानकारी प्रदान करता है पर आधारित मोडल है । वर्तमान अधिग्रहण प्रोटोकॉल में, axon व्यास के लिए स्थानिक संकल्प 10 एनएम के आदेश का है । इसके अलावा, SpeRe अन्य सुपर संकल्प माइक्रोस्कोप्स की तुलना में आदेश-परिमाण कम प्रकाश खुराक का इस्तेमाल करता है; इस प्रकार, यह phototoxicity और photobleaching से मुक्त है । SpeRe myelinated axons के नेनो गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक नया एवेंयू प्रदान करेगा ।
इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल वर्णक्रम acousto-प्रकाशिकी और एक बिंदु डिटेक्टर (यानी, PMT) द्वारा मध्यस्थता स्कैनिंग पर आधारित है. यह दृष्टिकोण पूर्ण क्षेत्र के वर्णक्रमीय छवियों को देखने के लिए लाभप्रद है । हालांकि, समय संकल्प वर्णक्रमीय स्कैनिंग, जो आम तौर पर है द्वारा सीमित है > 15 हमारे वर्तमान विंयास में एस । एक विकल्प के रूप में, एक उच्च गति स्पेक्ट्रोस्कोप एक छोटे से क्षेत्र के दृश्य9के वास्तविक समय अवलोकन को सक्षम करने के लिए शामिल किया जा सकता है । इस प्रणाली को सिर्फ एक स्पेक्ट्रोस्कोप द्वारा और एक सफेद प्रकाश लेजर जोड़कर पीएमटी स्विचन द्वारा एक पारंपरिक फोकल प्रणाली से निर्माण किया जा सकता है । अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के लिए, गैल्वेनोमीटर स्थिति स्पेक्ट्रोस्कोप के चलने के साथ सिंक्रनाइज़ करने की जरूरत है । एक एकल बिंदु माप के मामले में, लौकिक संकल्प स्पेक्ट्रोस्कोप के फ्रेम दर है, जो हो सकता है द्वारा निर्धारित किया जाता है > 10 हाल ही में ultrafast spectroscopes के लिए kHz । इस उप मिलीसेकंड लौकिक संकल्प vivo मेंmyelinated axons की शारीरिक गतिशीलता के अधिकांश देख के लिए पर्याप्त होना चाहिए । SpeRe प्रकाश प्रतिबिंब पर आधारित है; इसलिए, पता लगाया प्रकाश इनपुट प्रकाश के रूप में एक ही तरंग दैर्ध्य है । इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति वर्णक्रम बदलाव (यानी, स्टोक्स shift) शामिलहै; इस प्रकार, पता चला प्रकाश वर्णक्रम से इनपुट प्रकाश से अविभाज्य है । यह सुविधा एक ही नमूना पर SpeRe और प्रतिदीप्ति के एक साथ अधिग्रहण के लिए उपयोगी है (के रूप में 4 चित्रामें प्रदर्शित) । एक fluorophore द्वारा इनपुट प्रकाश का अवशोषण SpeRe माप को प्रभावित कर सकते हैं, लेकिन ठेठ फ्लोरोसेंट धुंधला से अवशोषण negligibly कम है (< 1%) ।
ध्यान दें की, SpeRe एक सीमित कोणीय पता लगाने की सीमा है-केवल axons लगभग इमेजिंग विमान के समानांतर पता लगाया जा सकता है । SpeRe के इस कोणीय सीमा ± १३.५ ° 9के आसपास है । ब्याज की विशिष्ट अभिविंयास प्राप्त करने के लिए, नमूना झुका हो सकता है । ऐसे zebrafish भ्रूण के रूप में पारदर्शी नमूनों के मामले में, पूर्ण volumetric अधिग्रहण नमूना घूर्णन द्वारा संभव हो सकता है । एक अतिरिक्त व्यावहारिक सीमा है कि एक coverslip एक नमूना पर घुड़सवार मजबूत वापस-प्रतिबिंब उच्च पृष्ठभूमि संकेत के रूप में चित्रा 5में दिखाया गया की पीढ़ी के लिए अग्रणी पैदा करता है; यह अनुशंसा की जाती है कि इस सतही क्षेत्र को टाला जाना चाहिए. SpeRe दृश्य प्रकाश के आधार पर मस्तिष्क के ऊतकों में ~ 20 µm के 1/ विशिष्ट विश्वसनीय वर्णक्रमीय जानकारी प्राप्त करने के लिए ऊतक पैठ गहराई ~ १०० µm तक ही सीमित है । गहरी इमेजिंग संभव हो सकता है अगर एक लंबे समय तक इनपुट स्रोत का उपयोग किया जाता है । अंत में, SpeRe की मांयता विवर्तन-सीमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ तुलना करके दिखाया गया है । यह जाहिरा तौर पर नेनो प्रेसिजन मूल्यांकन (4 चित्रा) के लिए अपर्याप्त है । इस तरह के correlative प्रकाश-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और विस्तार माइक्रोस्कोपी के रूप में हाल ही में तकनीक, नेनो13,14पर SpeRe को मान्य करने के लिए एक रास्ता प्रदान करेगा.
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Disclosures
लेखकों प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा: जे Kwon और एम चोई पेटेंट के अंवेषक रहे है लंबित प्रौद्योगिकी इस लेख में वर्णित है ।
Acknowledgments
इस कार्य को इंस्टीट्यूट ऑफ बेसिक साइंस (आईबीएल-R015-D1) द्वारा समर्थन और बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित शिक्षा मंत्रालय (2017R1A6A1A03015642) के माध्यम से किया गया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cutter | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Nail polish | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Apochromat objective 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Water-immersion type |
| Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used. |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica Microsystems | SP8 | Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details. |
| Imaging software | Leica Microsystems | LAS-X | - |
| Matlab | MathWorks | - | - |
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Coated with protected silver. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | - |
| Paraformaldehyde | Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS |
| Cover slip | Thermo Fisher | 3306 | Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm) |
| Slide glass | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Thickness: ~1 mm |
| Super glue | Henkel | Loctite 406 | Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact. |
| Syringe pump | Brainetree Scientific | BS-8000 DUAL | - |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | - |
| White-light laser | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6. |
References
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