Summary
Nous présentons ici un protocole étape par étape pour l’imagerie des axones myélinisés dans une tranche de cerveau fixe à l’aide d’une échelle nanométrique exempte d’étiquette d’imagerie technique basée sur la réflectométrie spectrale.
Abstract
Dans un système nerveux des mammifères, la myéline fournit une isolation électrique par Envellopants les fibres axonales dans une spirale de multicouche. Inspiré par son architecture sous-cellulaire très organisés, nous avons récemment développé une nouvelle modalité d’imagerie, nommée réflectométrie spectrale (diffuseurs), qui permet l’imagerie nanométriques de label-free sans précédent de l' axones myélinisés live in situ. Le principe sous-jacent est d’obtenir des informations de la nanostructure en analysant le spectre de réflectance de la structure multicouche subcellulaire. Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé étape par étape pour réaliser une imagerie de diffuseurs de base des tissus nerveux à l’aide d’un système microscopique confocal commercial, équipé d’un laser de lumière blanche et d’un filtre accordable. Nous couvrons les procédures de préparation des échantillons, acquisition de données spectrales et traitement d’image pour obtenir des informations de nanostructure.
Introduction
Dans le système nerveux des mammifères, la myéline fournit la conduction nerveuse rapide et intégrité axonale par Envellopants les fibres axonales avec gaines membraneuses multicouches. Sa structure multicouche est composé d’une alternance de minces nanométriques composées de membranes plasmiques (~ 5 nm), cytosol (environ 3 nm) et les espaces extracellulaires (~ 7 nm)1,2. La microscopie optique, y compris la microscopie de Super-résolution récente, ne conviennent pas pour l’observation de la dynamique de la myéline échelle nanométrique en raison de leur résolution insuffisante en raison de la diffraction optique3,4,5. Bien que la microscopie électronique peut fournir des détails de la nanostructure de myéline, ce n’est pas compatible avec les systèmes biologiques vivants en raison des préparations très envahissante impliquant la fixation chimique et ultrasectioning6,7 . Jusqu'à tout récemment, il n’y a eu aucune technique il y a lieu d’observer nanométriques dynamique des axones myélinisés in situ.
Schain et coll. a déjà signalé que les axones myélinisés présentent8de la réflexion de la lumière colorée. En adoptant l’analyse spectroscopique de la lumière réfléchie, nous avons mis au point une nouvelle modalité d’imagerie pour l’imagerie nanométrique des axones myélinisés, nommé réflectométrie spectrale (diffuseurs)9. Diffuseurs repose sur l’ingérence de minces qui se produisent dans la structure multicouche de la gaine de myéline (Figure 1). Par simulation optique sur les axones différents, nous avons révélé que le spectre de réflectance est une fonction périodique de nombre d’onde et sa périodicité (
) est inversement proportionnelle au diamètre de l’axone (d). Cette relation simple (
) propose une quantification du diamètre de l’axone d’après les données de diffuseurs. Grâce à cela, nous avons révélé l’axone répandue renflement sous léger traumatisme crânien dans notre rapport précédent.
Le système de diffuseurs repose sur la microscopie confocale et se compose d’une source laser spécialisés et filtre (Figure 2). La source d’entrée est un laser de lumière blanche, fournissant une sortie à large bande spectrale visible à l’infrarouge. Pour l’analyse spectrale, le système est muni de deux dispositifs acousto-optiques : un filtre accordable acousto-optique (AOTF) pour fournir une longueur d’onde sélectionnée de la source à large bande d’entrée et un séparateur de faisceau d’acousto-optique (AOBS) pour guider les sélectionnés reflétés longueur d’onde du détecteur. Le logiciel pour la microscopie confocal hyperspectrales (voir Table des matières) fournit une option de balayage spectral personnalisable d’acquérir dans l’ordre les images de réflectance à différentes longueurs d’onde d’entrée. Par ailleurs, l’aberration chromatique peut gravement interférer dans la mesure spectrale ; par conséquent, l’utilisation d’une lentille d’objectif apochromat est recommandée.
À noter, lumière blanche lasers produisent une sortie spectrale inégale et les composants optiques affectent également le profil spectral. Par conséquent, les spectres acquis doivent être calibrées pour l’analyse quantitative ultérieur. Un miroir argent protégé est généralement utilisé comme référence, qui offre une réflexion presque constante (> 97 %) au-dessus de la région complètement visible. Les spectres acquis sont ensuite divisés par les spectres de référence par le miroir.
La taille de palier spectrale pour l’analyse spectrale détermine la vitesse d’acquisition ; ainsi, il doit être optimisé. Comme un axone plus grande et dispose d’un délai spectral plus élevé, il faut plus fine de l’échantillonnage spectral. Par exemple, un axone d’un diamètre de 10 µm, une des axones physiologiques plus grands, dispose d’un délai spectral de ~ 8 nm. En appliquant les critères d’échantillonnage de Nyquist, nous avons utilisé l’intervalle d’échantillonnage spectral de 4 nm pour couvrir tous les axones physiologiques dans les tissus nerveux de la souris. Cette approche prend généralement plus de quelques secondes pour un scan complet spectral et donc n’est pas adaptée pour des applications in vivo , où le mouvement physiologique (p. ex. respiration et rythme cardiaque) s’ingère acquisition spectrale stable. Précédemment, nous avons résolu ce problème en instrumentant un microscope droit sur mesure, conçu pour acquérir le spectre complet pour chaque point à l’aide d’un spectromètre de tableau (acquisition Vitesse ≈ 30 ms par pixel).
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole détaillé sur l’imagerie de diffuseurs sur une tranche fixe de cerveau, qui peut être effectuée dans un microscope hyperspectral commerciale (voir Table des matières). Ainsi, le protocole peut être complété par les expérimentateurs sans expertise en instrumentation optique. Nous couvrons également les problèmes potentiels et dépannage pour l’acquisition et l’analyse des données de diffuseurs.
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Protocol
Toutes les interventions chirurgicales ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Sungkyunkwan.
1. préparation de l’échantillon
Remarque : Stériliser tous les instruments chirurgicaux avant toute manipulation animale. Effectuer toutes les performances chirurgicales dans une salle dédiée aux interventions chirurgicales. Gants et blouses stériles doivent être portées par tout le personnel dans la salle de chirurgie en permanence.
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Fixation du tissu
- Préparer les deux seringues de 10 mL que chacun rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS.
- Anesthésier une souris âgée de 7-12 semaine, (C57BL/6J ou des lignées de souris ou l’autre sexe) par l’administration d’un mélange de zoletil et de xylazine (1:1, 20 mg/kg chacun) ou d’un régime alternatif anesthésie appropriée (p. ex., mélange de kétamine 80 mg/kg et 10 mg/kg xylazine) avec une injection intrapéritonéale.
- Lorsque la souris atteint un plan chirurgical de l’anesthésie (utilisez la méthode de pincement ou de non-réponse orteil), exposer le cœur en coupant de la peau et la cage thoracique avec des ciseaux.
- Découper l’oreillette droite avec petits ciseaux pour drainer le sang et perfuse la solution PBS et PFA séquentiellement dans le ventricule gauche avec une aiguille (taux de perfusion = 4 mL/min, volume = 10 mL de chaque solution).
Remarque : La souris se raide si la procédure est menée à bien. L’utilisation de pommade ophtalmique ou de stérilisation n’est pas nécessaire car la procédure est en phase terminale. La procédure de fixation peut-être être ignorée. Toutefois, cette étape est recommandée afin de minimiser les déformations structurelles, y compris les dommages de tissu mécanique et un gonflement axonal ischémique. Pour plus de détails sur la fixation du tissu, reportez-vous à l’article par Gage, G. J. et al. 10
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Préparation de la tranche de cerveau
- Décapiter la souris avec des ciseaux chirurgicaux à travers le ventre thorax et l’abdomen.
- Enlever le cuir chevelu et le périoste en utilisant une paire de ciseaux convenablement petite jusqu'à exposer entièrement le crâne.
- Briser l’os frontal et couper le crâne le long de la suture sagittale de l’os occipital, à l’aide de petits ciseaux avec soin ne pas d’endommager le cerveau.
- Retirez doucement le crâne et la dure-mère successivement à l’aide de pinces fines.
- Extraire le cerveau à l’aide d’une cuillère en plastique souple, en prenant soin de ne pas pour endommager les tissus.
- Rincer et faire tremper le cerveau extrait dans une solution PFA de 4 % pendant 30 min à 4 ° C.
- Tranchez le cerveau fixe en 100 – 150 µm sections à l’aide d’un vibratome.
Remarque : Pour plus de détails sur la préparation du tissu, reportez-vous à l’article de Segev et al. 11. pour les procédures suivantes, le tissu doit être découpé en sections plus mince que l’épaisseur de la cale d’espacement.
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Montage de la tranche de cerveau
- Préparer la lame de 1 verre et 2 verres à couvercle carrés (22 × 22 × 0,17 mm) pour chaque tranche de tissu.
- Un des verres couvercle carrés coupé en moitié (deux morceaux rectangulaires) à l’aide d’un coupe-verre.
- Fixez les deux des lunettes couverture coupées en deux à l’aide d’une colle super sur la vitre de la diapositive.
Remarque : L’espace entre les deux moitiés verres devrait être légèrement supérieure à la taille de la tranche de tissu. - Récolter la tranche de cerveau à l’aide d’une brosse ou une pipette et poser le tissu sur le verre de glissement entre l’entretoise. Prendre soin de ne pas pour plier le tissu.
- Déposer 100 μl de PBS sur la surface du tissu.
- Placez le couvercle en autre carré verre sur le dessus du tissu. Éviter l’inclusion de bulles d’air lors de cette étape.
- Joint autour du verre de couverture avec un vernis à ongles (ou adhésifs alternativement appropriés) pour empêcher évaporation de PBS et de contamination par la poussière lors de la session d’imagerie ultérieure.
Remarque : L’expérimentateur peut faire une pause à ce stade.
2. étalonnage
- Allumer le microscope au moins 1 h avant l’imagerie pour permettre la stabilisation thermique du laser source (voir la Table des matières). Ensuite, activer le logiciel pour l’analyse spectrale (voir Table des matières) et cliquez sur le bouton acquérir sur le dessus de GUI (Figure 3 a).
- Allumez l’obturateur de logiciel pour le laser de lumière blanche (WLL) et un tube photomultiplicateur (PMT) (Figure 3 a).
- Sélectionnez le mode de xyΛ sur la liste déroulante en Mode d’Acquisition, puis, le mode d’entrée du laser est automatiquement changé de Constant pour cent à Puissance constante. Décochez la case à cocher du Mouvement à remontage automatique SP. Puis, affectez la fenêtre spectrale du laser d’entrée 470 – 670 nm et la taille de palier spectrale à 4 nm sur Λ-Excitation Lambda Scan paramètres (Figure 3 b).
- DÉFINIR la gamme spectrale de PMT à 450-690 en double-cliquant ou en déplaçant la barre de réglage pour la gamme spectrale (Figure 3C).
Remarque : Cette gamme spectrale devrait inclure la largeur de bande complète de la source d’entrée. - Sélectionnez un objectif immersion dans l’eau, convenablement avec une grande ouverture numérique (NA > 0,7) et faire n’importe quelle valeur pouvoir PMT et laser pour activer le bouton configuration AOBS et Live Scan . Passer le chemin optique en vérifiant la réflexion dans la Configuration AOBS (Figure 3d).
- Monter un miroir de renvoi (voir Table des matières) sur la platine du microscope. La surface du miroir doit être face contre l’objectif. S’il n’est pas facile de mettre le miroir sur la platine du microscope, coller un miroir sur la plaque plate (p. ex. verre de diapositive).
- Contrôler la platine du microscope pour aligner le plan focal à la surface du miroir.
- Ajuster le gain de la PMT et la puissance du laser compte tenu de la gamme dynamique du détecteur et puis changer le mode de saisie de laser de Constant pour cent à Puissance constante.
Remarque : Comme il est typique, un PMT gain de 500 (V) et une puissance laser relative de 0,1 % servent à 570 nm. - Confirmer en mode pseudo-couleur pour vérifier qu’il n’y a aucune saturation sur toute la gamme de longueur d’onde. Si la saturation est observée, baisser la puissance du laser (Figure 3 a).
- Exécutez l’acquisition Lambda Scan .
- Retirer le miroir de la scène et répétez l’acquisition même sans un échantillon afin d’obtenir la référence sombre (par exemple, décalage sombre).
- Enregistrer les données dans un format TIF de base .
3. Acquisition d’images de diffuseurs
- Placez le tissu monté sur la platine du microscope. Pour à peu près aligner les tissus et le plan focal de l’objectif, utilisez le mode grand-angulaire fluorescence par un oculaire.
- Avec l’option Live Scan sur contrôler la platine du microscope pour aligner le plan focal de la région d’intérêt dans le tissu. Pour éviter le bruit de fond de la lamelle couvre-objet, sélectionnez la région cible d’au moins 15 μm profondeur dans l’interface de verre-tissu.
- Acquérir la pile d’image spectrale pour la région de cible en utilisant la même procédure comme décrit aux points 2.1 à 2.10.
- Enregistrer les données pour le tissu et le décalage sombre en format TIF de base .
Remarque : L’expérimentateur peut faire une pause à ce stade.
4. traitement et analyse d’images
- Ouvrez les données spectrales (base TIF) pour le miroir de renvoi et le tissu cérébral dans ImageJ.
- Sélectionnez la ROIs (régions d’intérêt) pour les piles d’image ouverte — la zone centrale pour le miroir de renvoi et le segment d’une fibre de l’axone pour le tissu cérébral.
- Acquérir les spectres brutes pour la ROIs sélectionnée par l’Image en cours d’exécution, piles → → axe z à tracer le profil dans le menu ImageJ.
- Ouvrir les données décalage sombres, une prise pour le miroir de renvoi et les autres prises pour le tissu cérébral.
- Acquérir les spectres pour les offsets sombres par l’Image en cours d’exécution, piles → → axe z à tracer le profil dans le menu ImageJ.
- Enregistrez tous les spectres acquis en utilisant les options de copier / coller .
Remarque : Pour l’imagerie de diffuseurs, de centre d’imagerie du champ afin de minimiser les aberrations optiques hors-axe est recommandé. Les fibres de l’axone peuvent être structurellement hétérogènes sur toute leur longueur. Par conséquent, en sélectionnant le retour sur investissement sur un segment de petit axon, typiquement < 5 µm, pour minimiser l’artefact de volume partiel est recommandé.
5. données initiales Correction et analyse des signaux de diffuseurs
- Soustraire les décalage spectres des spectres du miroir de renvoi et les tissus cérébraux.
- Normaliser chaque spectre en divisant l’intensité maximale du spectre.
- Diviser le spectre normalisé de l’axone par le spectre normalisé du miroir référence et soustraire le décalage CC parmi les fréquences normalisées.
- Mesurer la fréquence de l’onde en ajustant le spectre acquis à une sinusoïdale courbe (voir la Table des matières) et puis convertir le nombre d’onde acquise à périodicité par prise réciproque.
- Convertir le diamètre de l’axone à l’aide de l’équation dans la Figure 4 cde la périodicité de nombre d’onde.
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Representative Results
Selon le protocole, une tranche fixe de cerveau a été préparée avec la coloration exogène, un fluorophore de ciblage de la myéline (voir Table des matières). Diffuseurs imagerie a été réalisée sur la tranche du cerveau en utilisant un microscope confocal hyperspectral commercial conjointement avec confocal fluorescence imaging (Figure 4 a). Pour diffuseurs, intensité optique d’entrée a été fixée à 5 µW/µm2 avec un temps de pause de pixel de ~ 1 µs. Cette dose légère n’est plus un ordre de grandeur inférieure à fluorescence conventionnels microscopie confocale12. Il faut environ 17 s pour balayage spectral sur 470-670 nm à un intervalle de 4 nm (51 images).
Le signal de diffuseurs a été localisé le long des axones myélinisés, comme prévu par la géométrie de la réflexion optique. Partir du spectre de réflectance d’un segment de l’axone, la périodicité de nombre d’onde a été obtenue, qui a été par la suite converti au diamètre de l’axone (Figure 4 b, c). Le diamètre mesuré par les diffuseurs s’est avéré pour être en bon accord avec la mesure par fluorescence (Figure 4D). L’erreur mineure résiduelle pouvait provenir soit de la résolution limitée par la diffraction de la méthode axée sur la fluorescence ou l’incomplète géométrique modèle pour diffuseurs.
L’imagerie de diffuseurs est basé sur la réflexion optique, donc un lamelle couvre-objet à base de silice peut introduire un bruit de fond important. Dans notre configuration optique, le bruit de fond a été considérable lorsque la profondeur d’imagerie de la lamelle est inférieure à 5 µm, mais a été évitée lorsque la profondeur d’imagerie est supérieure à 15 µm (Figure 5).
Figure 1 : Principe des diffuseurs. Les axones myélinisés a une structure de minces multicouche. La lumière incidente est réfléchie partiellement aux interfaces, tel que décrit par la Loi de Fresnel. Ceux-ci reflètent des ondes lumineuses interfèrent entre eux ; par conséquent, la lumière réfléchie qui code les informations de nanostructure. Réflectométrie spectrale (diffuseurs) obtienne les informations de nanostructure en décodant la lumière réfléchie de l’axones myélinisés. Ce chiffre a été tiré à Kwon, J. et al. 9 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mise en page du système diffuseurs. Le système de diffuseurs est issu d’un microscope confocal réflectance. Pour l’analyse spectrale, trois composants supplémentaires sont nécessaires sur le chemin de l’excitation : (1) un supercontinuum laser, filtre accordable (2) acousto-optique (AOTF) et (3) acousto-optique du faisceau splitter (AOBS). La source laser à large bande est spectralement filtrée par AOTF pour transmettre une longueur d’onde sélectionnée avec une bande passante étroite. AOBS fonctionne comme un séparateur de faisceau pour la longueur d’onde sélectionnée guider la lumière d’excitation à l’échantillon. La lumière est ensuite incidente sur l’échantillon à travers un scanner galvanométrique et un porte-objectif. La lumière réfléchie de l’échantillon est descanned, dans l’espace filtrée par un trou d’épingle confocal et recueillie par le tube photomultiplicateur (PMT). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Le logiciel de configuration. (a) l’interface utilisateur graphique (GUI). Dans la fenêtre principale, il y a principalement cinq sous-groupes : installation, installation en laser, optique d’installation, installation de détecteur et visionneuse d’imagerie. (b) le menu déroulant pour sélectionner le mode d’imagerie. Pour les diffuseurs, xyλ est activé. (c) le panneau de réglage de la fenêtre spectrale pour le détecteur. (d) le Comité pour la mise en place du séparateur de faisceau d’acousto-optique (AOBS). La « réflexion » est sélectionnée pour guider la lumière réfléchie vers le détecteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Diffuseurs sur un tissu cérébral. (un) A diffuseurs image d’un tissu de cerveau murin colorées avec une contre-coloration fluorescent de la myéline (fluoromyelin). (b) un représentant de réflectance spectre obtenu dans la zone en pointillés blanche à l’alinéa a. (c) une courbe de référence simulée pour estimer le diamètre de l’axone de périodicité spectrale. Astérisque bleu est le point de données obtenu à partir de (b). (d), le profil Transversal de l’intensité de la fluorescence de la région en boîte à l’alinéa a. Le diamètre externe de la myéline, estimé en utilisant le signal de fluorescence est ~ 760 nm, ce qui concorde bien avec la mesure de diffuseurs. L’erreur résiduelle est en théorie de l’erreur de la diffraction de la mesure par fluorescence. Échelle, 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Effet d’une lamelle couvre-objet. (a, b) Les images de réflectance d’un tissu de cerveau à la même position latérale sont acquises à différentes profondeurs de l’interface de tissu-lamelle : à 3 µm (a) et 15 µm (b). Échelle, 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Diffuseurs est une nouvelle modalité d’imagerie exempte d’étiquette basée sur l’interférométrie spectrale, qui pour la première fois, offre l’information de l’échelle nanométrique dans les axones myélinisés direct. Dans le protocole actuel de l’acquisition, la résolution spatiale pour le diamètre de l’axone est de l’ordre de 10 nm. En outre, diffuseurs utilise des ordres de grandeur plus faible dose légère par rapport aux autres microscopies de Super-résolution ; Il est donc exempt de photoblanchiment et de phototoxicité. Diffuseurs fournirait une nouvelle voie pour l’étude dynamique de l’échelle nanométrique des axones myélinisés.
Le protocole décrit ci-après est basé sur balayage spectral médiée par acousto-optique et un détecteur de point (c.-à-d., PMT). Cette démarche est avantageuse pour l’acquisition des images spectrales de la champ de vision complet. Toutefois, la résolution temporelle est limitée par le balayage spectral, qui est généralement > 15 s dans notre configuration actuelle. Comme alternative, un spectroscope à grande vitesse peut être incorporé permettant l’observation en temps réel d’un petit champ de vue9. Ce système peut être simplement construit depuis un système confocal classique en commutant la PMT en un spectroscope et en ajoutant un laser de lumière blanche. Pour les logiciels d’acquisition, la position du galvanomètre doit être synchronisé avec le fonctionnement de la spectroscope. Dans le cas d’une mesure ponctuelle, la résolution temporelle est déterminée par la cadence du spectroscope, pouvant être > 10kHz pour récentes spectroscopes ultrarapides. Cette résolution temporelle de milliseconde secondaire devrait être suffisant pour observer la plus grande partie de la dynamique physiologique des axones myélinisés in vivo. Diffuseurs est basé sur la réflexion de la lumière ; par conséquent, la lumière détectée a la même longueur d’onde que la lumière d’entrée. Au contraire, fluorescence consiste à décalage spectral (c.-à-d., déplacement de Stokes) ; ainsi, la lumière détectée est spectralement séparable de la lumière d’entrée. Cette fonctionnalité est utile pour l’acquisition simultanée de diffuseurs et de la fluorescence sur le même échantillon (comme illustré dans la Figure 4). Absorption de la lumière d’entrée par un fluorophore peut affecter la mesure de diffuseurs, mais l’absorption de coloration fluorescente typique est négligeable faible (< 1 %).
À noter, diffuseurs a une détection angulaire limitée gamme uniquement que les axones presque parallèles au plan d’imagerie peuvent être détectées. Cette limite angulaire des diffuseurs est d’environ ± 13,5 ° 9. Pour obtenir une orientation spécifique d’intérêt, l’échantillon peut être incliné. Dans le cas d’échantillons transparents comme l’embryon de poisson zèbre, l’acquisition volumétrique complet est possible en faisant tourner l’échantillon. Une autre limite pratique est qu’un lamelle couvre-objet monté sur un échantillon de produit forte dos-réflexion conduisant à la génération du signal de fond élevé, comme illustré à la Figure 5; Il est recommandé que cette région superficielle doit être évitée. Diffuseurs basée sur la lumière visible a la longueur d’atténuation 1/e de ~ 20 µm dans les tissus cérébraux. La profondeur de pénétration du tissu typique pour obtenir l’information spectrale fiable est limité à ~ 100 µm. Deeper imaging peut être possible si une plus source d’entrée est utilisée. En fin de compte, la validation des diffuseurs est montrée en le comparant avec la microscopie en fluorescence diffraction-limited. Apparemment, cela a été insuffisant pour évaluer la précision de l’échelle nanométrique (Figure 4). Des techniques récentes, telles que la lumière-microscopie corrélative et microscopie de l’expansion, offrirait un moyen de valider les diffuseurs à échelle nanométrique régime13,14.
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Disclosures
Les auteurs déclarent des intérêts financiers divergents : Kwon J. et M. Choi sont les inventeurs de la technologie en instance de brevet décrit dans cet Article.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’Institut de sciences fondamentales (IBS-R015-D1) et de base programme de recherche scientifique grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de l’éducation (2017R1A6A1A03015642).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cutter | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Nail polish | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Apochromat objective 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Water-immersion type |
| Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used. |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica Microsystems | SP8 | Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details. |
| Imaging software | Leica Microsystems | LAS-X | - |
| Matlab | MathWorks | - | - |
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Coated with protected silver. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | - |
| Paraformaldehyde | Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS |
| Cover slip | Thermo Fisher | 3306 | Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm) |
| Slide glass | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Thickness: ~1 mm |
| Super glue | Henkel | Loctite 406 | Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact. |
| Syringe pump | Brainetree Scientific | BS-8000 DUAL | - |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | - |
| White-light laser | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6. |
References
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