Summary
Her presenterer vi en trinnvis protokoll for imaging myelinated axons i en fast hjernen stykke ved hjelp av en etikett-fri nanoskala tenkelig teknikk basert på spectral reflectometry.
Abstract
I et pattedyr nervesystemet gir myelin en elektrisk isolasjon av enwrapping axon fibrene i en flerlags spiral. Inspirert av sin svært organisert subcellular arkitektur, vi nylig utviklet en ny tenkelig modalitet, kalt spectral reflectometry (SpeRe), som gir enestående etikett-fri nanoskala avbilding av live myelinated axons i situ. Underliggende prinsippet er å få nanostructural informasjon ved å analysere refleksjon spekteret av flerlags subcellular strukturen. I denne artikkelen beskriver vi en detaljert trinnvise protokoll for å utføre et grunnleggende SpeRe bildebehandling av nervøs vev ved å bruke en kommersiell AC confocal mikroskopiske, utstyrt med en hvit lys laser og en tunable filter. Vi dekker prosedyrene for eksempel forberedelse, oppkjøp av spektraldata og bildebehandling for å få nanostructural informasjon.
Introduction
I pattedyr nervesystemet gir myelin rask nerve ledning og axonal integritet ved enwrapping axon fibrene med flere lag membranous hylser. Flerlags strukturen består av vekslende nanoskala tynn-filmer består av plasma membraner (~ 5 nm), stoffer (~ 3 nm), og ekstracellulære mellomrom (~ 7 nm)1,2. Optisk mikroskopi, inkludert den siste super-oppløsning mikroskopi, er ikke egnet for å observere nanoskala myelin dynamikken på grunn av sin lav oppløsning på grunn av optisk Diffraksjon3,4,5. Selv om elektronmikroskop kan gi fine detaljer av myelin-nanostructure, er det ikke forenlig med levende biologiske systemer på grunn av svært invasiv eksempel preparater som involverer kjemiske fiksering og ultrasectioning6,7 . Inntil nylig har det vært ingen teknikk gjelder observere nanoskala dynamikken i myelinated axons i situ.
Schain et al. tidligere rapportert at myelinated axons viser fargerike lys refleksjon8. Ved å vedta spectroscopic analysen på det reflekterte lyset, har vi utviklet en ny tenkelig modalitet ved nanoskala avbildning av myelinated axons, kalt spectral reflectometry (SpeRe)9. SpeRe er basert på tynn-film forstyrrelser forekommer i flerlags strukturen av myelin-skjeden (figur 1). Av optikk simulering på ulike axons, vi har avdekket at refleksjon spekteret er en periodisk funksjon av wavenumber og dens periodisitet (
) er omvendt proporsjonal med axon diameter (d). Dette forholdet (
) tilbyr lettvinte kvantifisering av axon diameter fra SpeRe data. Utnytte dette, avslørte vi utbredt axon svulmende under mild traumatisk hjerneskade i vår forrige rapport.
SpeRe systemet er basert på AC confocal mikroskopi og består av en spesialisert laser kilde filtre (figur 2). Kilde er et hvitt lys laser, gir bredbånd spectral utgang synlig for infrarød regioner. Spectral skanningen, systemet er utstyrt med to acousto-optisk enheter: et acousto-optisk tunable filter (AOTF) for å levere en valgte bølgelengde fra bredbånd inngangskilde og en acousto-optisk strålen splitter (AOBS) for guiding valgt reflektert Bølgelengden til detektoren. Programvaren for hyperspektral AC confocal mikroskopi gir (se Tabell for materiale) en passelig spectral scan alternativ sekvensielt hente refleksjon bilder med forskjellige input bølgelengder. I tillegg kan kromatisk aberrasjon kritisk påvirke i spektral målingen; Det anbefales derfor bruk av en apochromat linsen.
Av notatet, hvitt lys lasere produserer en ujevn spectral utgang og optisk komponentene påvirke spectral profilen. Derfor må til ervervet spectra kalibreres for påfølgende kvantitativ analyse. Et beskyttet sølv speil er vanligvis brukt som en referanse, som gir en nesten konstant refleksjon (> 97%) over regionen fullt synlig. De ervervet spectra deles deretter av til referanse spectra fra speilet.
Spectral trinn størrelsen på spectral skanning bestemmer oppkjøpet hastighet; Dermed må optimaliseres. Som en større axon har en høyere spectral periode, krever det finere spectral prøvetaking. En axon med en diameter på 10 µm, en av de største fysiologiske axons, har for eksempel en spektral periode ~ 8 nm. Bruker Nyquist prøvetaking kriterier, vi ansatt spectral prøvetaking tidsintervallet 4 nm å dekke alle fysiologiske axons i musen nervøs vev. Denne tilnærmingen vanligvis tar over flere sekunder for en full spectral skanning og dermed er ikke egnet for i vivo programmer, hvor fysiologiske bevegelse (f.eks åndedrett og hjerteslag) griper stabil spectral oppkjøpet. Vi har tidligere løst problemet ved instrumenting tilpasset oppreist mikroskop, utformet for å skaffe hele spekteret for hvert punkt ved hjelp av en matrise spectrometer (oppkjøpet hastighet ≈ 30 ms per piksel).
I denne rapporten, beskriver vi en detaljert protokoll om SpeRe bildebehandling på en fast hjernen skive, som kan utføres i en kommersiell hyperspektral mikroskop (se Tabell for materiale). Protokollen kan derfor fullføres av forskere uten ekspertise innen optisk instrumentering. Vi dekker også den potensielle problemer og feilsøking for oppkjøp og analyse av SpeRe data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle kirurgiske prosedyrer ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Sungkyunkwan University.
1. sample forberedelse
Merk: Autoclave alle kirurgiske instrumenter før dyr håndtering. Gjennomføre alle kirurgiske ytelse i et rom dedikert til kirurgiske prosedyrer. Sterilt kirurgisk kjoler og hansker skal bæres av alt personell i kirurgiske rommet hele tiden.
-
Vev fiksering
- Forberede to 10 mL sprøyter hver fylt med fosfat-bufret saltvann (PBS) og 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS.
- Bedøve 7-12-uke-gamle musen, (C57BL/6J eller musen linjer med begge kjønn) ved å tilsette en blanding av zoletil og xylazine (1:1, 20 mg/kg hver) eller en alternativ egnet anestesi regime (f.eks, blanding av 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazine) med en intraperitoneal injeksjon.
- Når musen har nådd et kirurgisk fly bedøvelse (Bruk metoden tå knipe respons), utsett hjertet ved å kutte av huden og rib bur med saks.
- Klipp riktig atriet med liten saks å tappe blod og perfuse PBS og PFA løsningen sekvensielt gjennom venstre ventrikkel med en nål (perfusjon rate = 4 mL/min, volum = 10 mL for hver enkelt løsning).
Merknad: Musen blir stiv hvis prosedyren er fullført. Bruk av øye ointment eller sterilisering er ikke nødvendig som prosedyren er terminal. Fiksering prosedyren kan hoppes over. Dette trinnet anbefales imidlertid å minimere strukturelle deformasjoner inkludert mekanisk vevsskade og iskemiske axonal hevelse. For ytterligere informasjon om vev fiksering, se artikkelen av Gage, G. J. et al. 10
-
Utarbeidelse av hjernen stykket
- Halshugge musen med kirurgisk saks gjennom ventrale thorax og buk.
- Fjern hodebunnen og periosteum ved hjelp av en passende liten saks til fullt utsette kraniet.
- Bryte frontale ben og kuttet av kraniet langs det sagittal suture fra nakkeknølen bruker liten saks med forsiktighet for ikke for å skade hjernen.
- Fjern kraniet og dura mater sekvensielt ved hjelp av fine tang.
- Ekstra hjernen ved hjelp av en myk plast skje, ta vare ikke for å skade vevet.
- Skyll og sol utpakkede hjernen i en 4% PFA løsning for 30 min på 4 ° C.
- Skjær fast hjernen i 100-150 µm inndelinger ved hjelp av en vibratome.
Merk: Ytterligere informasjon om vev forberedelse, se artikkelen av Segev et al. 11. for senere prosedyrer, vevet bør skiver i seksjoner tynnere enn tykkelse for mellomlegget.
-
Montering av hjernen stykket
- Klargjør 1 glass lysbilde og 2 kvadrat cover briller (22 × 22 × 0,17 mm) for hver vev slice.
- Skjær en firkantet cover briller i halvparten (to rektangulære stykker) ved hjelp av en glass kutter.
- Fest to halvert cover glass med en superlim på lysbildet glasset.
Merk: Avstanden mellom to halvert glass bør være litt større enn størrelsen på vev slice. - Høste hjernen stykket med en børste eller en pipette, og lå vev på lysbildet glasset mellom mellomlegget. Ta vare ikke for å kaste vevet.
- Dispensere 100 μL PBS på vevet overflaten.
- Plass andre kvadrat dekket glasset på vevet. Unngå inkludering av luftbobler i denne fasen.
- Forsegle rundt dekket glasset med en neglelakk (eller alternativt egnet lim) for å hindre fordampning av PBS og forurensning av støv under påfølgende tenkelig økten.
Merk: Eksperimentator kan pause på dette stadiet.
2. kalibrering
- Slå på mikroskopet minst 1 time før avbilding tillate termisk stabilisering av laser kilde (se Tabell for materiale). Deretter aktivere programvaren for spectral skanning (se Tabell for materiale) og klikker på Hent -knappen på GUI (figur 3a).
- Aktivere programvare lukkeren for hvitt lys laser (WLL) og photomultiplier rør (avdrag) (figur 3a).
- Velg xyΛ modus på drop-down listen inne Vinningen måte, så laser inntastingsmodusen endres automatisk fra konstant prosent til Konstant strøm. Fjern merket i avmerkingsboksen for Automatisk SP bevegelse. Og deretter angi spectral vinduet av input laser 470-670 nm og spectral trinn størrelsen til 4 nm på Λ-eksitasjon Lambda skanne Innstillinger (figur 3b).
- Angi spectral utvalg av avdrag til 450-690 ved å dobbeltklikke eller flytte justeringslinjen spectral utvalg (Figur 3 c).
Merk: Spectral området bør inkludere komplett båndbredden til kilde. - Velg en vann nedsenking linsen, passende med en høy numeriske blenderåpning (NA > 0,7) og gi noen verdi til avdrag og laser makt til å aktivere AOBS konfigurasjon og Live skanne knappen. Bytte den optiske banen av tilbudene refleksjon i AOBS konfigurasjon (figur 3d).
- Montere en referanse speil (se Tabell for materiale) på mikroskopet scenen. Speilet overflaten bør bli møtt mot linsen. Hvis det ikke er lett å sette speilet på mikroskopet scenen, bånd et speil på en flat tallerken (f.eks skyve glass).
- Kontroll mikroskop scenen for å justere fokalplanet til speilet overflaten.
- Juster avdrag gevinst og laser makt vurderer det dynamiske spekteret av detektor og deretter endre inntastingsmodusen laser fra konstant prosent til Konstant strøm.
Merk: Som er typisk, en innbetaling få 500 (V) og en relativ laser makt på 0,1% brukes på 570 nm. - Kontroller i en pseudo fargemodus å sjekke at det ikke er noen metning i bølgelengdeområdet rekkevidde. Hvis metning er observert, lavere laser makt (figur 3a).
- Kjør Lambda skanne oppkjøpet.
- Fjerne speilet fra scenen og gjenta samme kjøp uten et eksempel for å få den mørke referansen (dvs., mørk forskyvning).
- Lagre dataene i et Multistacked TIF -format.
3. SpeRe bildeopptak
- Plass montert vev på mikroskopet scenen. Brukes wide-field fluorescens gjennom en øye-stykke justeres omtrent vevet til fokalplanet av målet linsen.
- Den Live Scan på, kontrollere mikroskop scenen for å justere fokalplanet i regionen rundt i vevet. For å unngå bakgrunnsstøy fra cover slip, Velg målet området minst 15 μm dybde i glass-vevet grensesnittet.
- Tilegne seg de spektrale bildestakk for målet området bruker samme prosedyre som beskrevet i trinnene 2.1-2.10.
- Lagre data for vev og mørke forskyvningen i Multistacked TIF -format.
Merk: Eksperimentator kan pause på dette stadiet.
4. image bearbeiding og analyse
- Åpne spektraldata (multistacked TIF) for referanse speilet og hjernevev i ImageJ.
- Velg ROIs (regioner av interesse) for de åpnet bildestakker-det sentrale området for referanse speilet og delen av en axon fiber for hjernevev.
- Skaffe til rå spectra for de valgte ROIs av kjører Image → stabler → Plot z profil på ImageJ-menyen.
- Åpne mørke offset data, en tatt for referanse speilet og den andre tatt for hjernevev.
- Tilegne seg til spectra for mørke forskyvningene ved kjører Image → stabler → Plot z profil på ImageJ-menyen.
- Lagre alle til ervervet spectra ved å kopiere og lime inn alternativene.
Merk: For SpeRe avbildning, bruk av feltet for sentrale tenkelig å minimere off-aksen optisk avvik anbefales. Det kan hende at axon fibrene strukturelt heterogene lengden. Derfor anbefales velger Avkastningen på en liten axon segment, vanligvis < 5 µm, minimere delvis volum gjenstand.
5. planlagte korreksjon og SpeRe Signal analyse
- Trekke til offset spectra fra spektra av referanse speilet og hjernen vev.
- Normalisere hver spektrum ved å dele den maksimale intensiteten av spekteret.
- Dele normalisert spekteret av axon av normalisert spekteret av referanse speilet og trekk fra DC forskyvningen fra normalisert spekteret.
- Måle wavenumber frekvensen av passende ervervet spekteret til en sinusformet kurven (se Tabell for materiale), og deretter konvertere den ervervet wavenumber til periodisitet av tar gjensidig.
- Konvertere wavenumber periodisitet til axon diameter ved hjelp av formelen i Figur 4 c.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I henhold til protokollen, et fast hjernen stykke var forberedt med eksogene flekker, en myelin målretting fluorophore (se Tabell for materiale). SpeRe imaging ble utført på hjernen sektoren bruker kommersielle hyperspektral AC confocal mikroskop sammen med AC confocal fluorescens imaging (figur 4a). For SpeRe, input optisk intensitet var satt til 5 µW/µm2 med pixel bor tiden ~ 1 µs. Denne lette dosen er over en bestilling av omfanget lavere enn konvensjonelle fluorescens AC confocal mikroskopi12. Det tar ~ 17 s spectral skanning over 470-670 nm på et intervall av 4 nm (51 bilder).
SpeRe signalet var lokalisert langs midten av myelinated axons som forventet av geometrien i optisk refleksjon. Fra refleksjon spekteret av en axon segment, ble wavenumber periodisitet oppnådd, som senere ble konvertert til axon diameter (figur 4b, c). Diameteren målt ved SpeRe ble funnet for å være i god avtale med fluorescens-basert måling (Figur 4 d). Gjenværende mindre feilen kan ha sin opprinnelse enten fra Diffraksjon-begrenset oppløsningen av metoden fluorescens-basert eller ufullstendig geometriske modell for SpeRe.
SpeRe avbilding er basert på optisk refleksjon, dermed en silisium-basert dekkglassvæske kan introdusere en betydelig bakgrunnsstøy. I våre fiberoptisk oppsett var bakgrunnsstøy betydelig når imaging dybden fra dekkglassvæske er mindre enn 5 µm men ble unngått tenkelig dybden er større enn 15 µm (figur 5).
Figur 1 : Prinsippet om SpeRe. Myelinated axon har en flerlags tynn-film struktur. Det innfallende lyset reflekteres delvis av i grensesnittene, som beskrevet av Fresnels lov. Disse reflektert lys bølger forstyrre hverandre. Derfor koder den resulterende reflektert lys nanostructural informasjon. Spectral Reflectometry (SpeRe) får nanostructural informasjonen ved å dekode det reflekterte lyset fra myelinated axon. Dette tallet har blitt reprinted fra Kwon, J. et al. 9 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Oppsett av SpeRe. SpeRe systemet er basert på AC confocal refleksjon mikroskop. For spectral skanning, tre tilleggskomponenter er nødvendig langs banen eksitasjon: (1) en supercontinuum laser, (2) acousto-optisk tunable filter (AOTF) og (3) acousto-optisk stråle splitter (AOBS). Bredbånd laser kilden er spectrally filtrert etter AOTF å sende en valgt bølgelengde med en smal båndbredde. AOBS fungerer som en bjelke splitter for valgte bølgelengden lede magnetisering lys til prøven. Lyset er da hendelsen på prøven gjennom en galvanometric skanner og en linsen. Det reflekterte lyset fra eksempel er descanned, romlig filtrert av et AC confocal pinhole og samlet inn av photomultiplier røret (betaling). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Programvare setup. (en) det grafiske brukergrensesnittet (GUI). I hovedvinduet, det er hovedsakelig fem sub paneler: imaging oppsett, laser oppsett, fiberoptisk oppsett, detektor oppsett og bildeviser. (b) miste-ned meny å velge tenkelig måte. SpeRe, er xyλ valgt. (c) i panelet for justering vinduet spectral for detektoren. (d) i panelet for å definere acousto for fiberoptisk strålen splitter (AOBS). "Refleksjon" er valgt å det reflekterte lyset detektoren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : SpeRe på en hjernevev. (en) en SpeRe bilde av en murine hjernevev farget med et fluorescerende counterstaining av myelin (fluoromyelin). (b) en representant refleksjon spektrum innhentet fra den hvite stiplede boksen i (a). (c) en simulert referanse kurve til å beregne axon diameter fra spectral periodisitet. Blå stjerne er data innhentet fra (b). (d) tverrgående profilen til fluorescens intensiteten fra regionen eske i (a). Myelin ytre diameter beregnet ved hjelp av fluorescens signalet er ~ 760 nm, noe som stemmer godt SpeRe målingen. Gjenværende feilen er tenkes Diffraksjon feil fluorescens-basert måling. Scalebar, 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Effekten av en cover slip. (en, b) Refleksjon bilder av en hjernevev i samme lateral posisjon er ervervet på ulike dyp fra vev-dekkglassvæske grensesnittet: 3 µm (a) og 15 µm (b). Scalebar, 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SpeRe er en ny etikett uten tenkelig modalitet basert på spectral interferometry, som for første gang, tilbyr nanoskala informasjonen i live myelinated axons. I gjeldende oppkjøpet protokollen, romlig oppløsning for axon diameter er av 10 nm. Videre benytter SpeRe bestillinger av omfanget lavere lys dose sammenlignet med andre super-oppløsning microscopies; Dermed er det fri fra Phototoksisitet og photobleaching. SpeRe vil gi en ny vei for å studere nanoskala dynamikken i myelinated axons.
Protokollen beskrevet her er basert på spectral skanning formidlet av acousto-optikk og en punkt detektor (dvs., avdrag). Denne tilnærmingen er fordelaktig for å skaffe spectral bilder av den fullstendige felt-of-view. Men er tiden oppløsningen begrenset av spektrale analysen, som er > 15 s i våre gjeldende konfigurasjon. Som et alternativ, kan en høyhastighets spektroskopisk bli tatt for å muliggjøre sanntids observasjon av en liten felt-of-view9. Dette systemet kan konstrueres fra et vanlig AC confocal bare ved å bytte til innbetaling av en spektroskopisk og legge til en hvit lys laser. For oppkjøpet programvare må galvanometer posisjon som skal synkroniseres med driften av spektroskopisk. Ved et enkelt mål bestemmes timelige oppløsningen av bildefrekvensen for spektroskopisk, som kan være > 10 kHz for siste lynraske spectroscopes. Denne sub millisekund midlertidig løsning bør være nok for å observere mesteparten av fysiologiske dynamikken i myelinated axons i vivo. SpeRe er basert på lyset refleksjon; Derfor har oppdaget lyset samme bølgelengde som inndata lyset. Tvert imot, innebærer fluorescens spectral Skift (dvs., Stokes Skift); Dermed er oppdaget lyset spectrally separable fra input lyset. Denne funksjonen er nyttig for samtidige oppkjøp av SpeRe og fluorescens på samme prøven (som vist i Figur 4). Absorpsjon av input lyset av en fluorophore kan påvirke SpeRe måling, men opptaket fra typiske fluorescerende flekker er negligibly lav (< 1%).
Av notatet har SpeRe en begrenset kantete oppdagelsen området bare axons nesten parallelt tenkelig flyet kan oppdages. Kantete grensen av SpeRe er rundt ± 13,5 ° 9. For å erverve bestemt retning av interesse, kan prøven vippes. I gjennomsiktig prøver som sebrafisk embryo, kan full volumetriske oppkjøpet være mulig ved å rotere prøven. En ekstra praktisk begrensning er at en dekkglassvæske montert på en prøve gir sterk rygg-refleksjon fører til generering av høye signal som vist i figur 5. Det anbefales at denne overfladisk regionen bør unngås. SpeRe basert på synlig lys har 1/e demping lengden på ~ 20 µm i hjernen vev. Typisk vev gjennomtrenging dyp kan for å anskaffe pålitelig spektral informasjon er begrenset til ~ 100 µm. dypere bildebehandling være mulig hvis en lenger inndatakilde brukes. Til slutt vises validering av SpeRe ved å sammenligne den med Diffraksjon-begrenset fluorescens mikroskopi. Dette er tydeligvis ikke nok for å vurdere nanoskala presisjon (Figur 4). Siste teknikker, som correlative lys-elektronmikroskop og utvidelse mikroskopi, ville tilby en måte å validere SpeRe nanoskala regimet13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklære konkurrerende økonomiske interesser: J. Kwon og M. Choi er utviklet patentsøkte teknologien beskrevet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Institutt for grunnleggende vitenskap (IBS-R015-D1) og av grunnleggende Science Research Program gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning (2017R1A6A1A03015642).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cutter | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Nail polish | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Apochromat objective 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Water-immersion type |
| Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used. |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica Microsystems | SP8 | Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details. |
| Imaging software | Leica Microsystems | LAS-X | - |
| Matlab | MathWorks | - | - |
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Coated with protected silver. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | - |
| Paraformaldehyde | Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS |
| Cover slip | Thermo Fisher | 3306 | Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm) |
| Slide glass | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Thickness: ~1 mm |
| Super glue | Henkel | Loctite 406 | Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact. |
| Syringe pump | Brainetree Scientific | BS-8000 DUAL | - |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | - |
| White-light laser | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6. |
References
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction. Brain Research. 210, 383-387 (1981).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).
- Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices. Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5, 155-157 (2008).
- Peters, A., Sethares, C. Is there remyelination during aging of the primate central nervous system? Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).
- De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. Anisotropic properties of the myelin sheath. Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Kwon, J., et al. Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo. Nature Communication. 8, 1832 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. JoVE. (112), e54024 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14, 593-599 (2017).
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).
