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Chemistry

एकीकृत संरचनात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन आर्किटेक्चर और प्रोटीन-Ligand परिसरों का विश्लेषण

Published: October 15, 2018 doi: 10.3791/57966
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, King's College London

Summary

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) संरचना और macromolecular विधानसभाओं की गतिशीलता की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में उभरा है । यहां, हम एकीकृत एमएस आधारित दृष्टिकोण प्रोटीन जटिल गठन और ligand बाध्यकारी पूछताछ करने के लिए ।

Abstract

प्रोटीन जैविक अणुओं का एक महत्वपूर्ण वर्ग है कि जीन अभिव्यक्ति, catalyzing चयापचय प्रतिक्रियाओं, डीएनए की मरंमत और प्रतिकृति सहित सेलुलर कार्यों में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहे हैं । इसलिए, इन प्रक्रियाओं की एक विस्तृत समझ कैसे कक्ष फ़ंक्शन पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है । एकीकृत संरचनात्मक एमएस तरीकों प्रोटीन जटिल विधानसभा, जटिल संपर्क, उपइकाई stoichiometry, प्रोटीन oligomerization और ligand बाध्यकारी पर संरचनात्मक और गतिशील जानकारी प्रदान करते हैं । एकीकृत संरचनात्मक एमएस में हाल के अग्रिमों बड़े डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन और झिल्ली प्रोटीन सहित चुनौतीपूर्ण जैविक प्रणालियों के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दी है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे इस तरह के देशी एमएस और आयन गतिशीलता के रूप में विविध एमएस डेटा को एकीकृत करने के लिए-जन स्पेक्ट्रोमेट्री आणविक गतिशीलता सिमुलेशन के साथ (IM-एमएस) एक helicase-nuclease डीएनए मरंमत प्रोटीन परिसर में अंतर्दृष्टि लाभ । परिणामी दृष्टिकोण अंय प्रोटीन महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में शामिल परिसरों के लिए बाध्यकारी ligand के विस्तृत अध्ययन के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है ।

Introduction

बरकरार प्रोटीन और उनके परिसरों का मूल जन spectrometric विश्लेषण electrospray और नैनो-electrospray ionization (nESI) है, जो आबंध प्रक्रिया1के दौरान प्रोटीन तह और गैर ionization बातचीत के संरक्षण का उपयोग कर बाहर किया जाता है, 2. देशी एमएस में, प्रोटीन और उनके परिसरों की संरचना गैस में एक निकट देशी राज्य में बनाए रखा जाता है-चरण3,4। देशी एमएस का पता लगाता है एकाधिक चार्ज प्रोटीन आयनों, जो अपने द्रव्यमान के अनुसार अनुपात चार्ज करने के लिए अलग कर रहे हैं (एम/जेड) प्रोटीन या प्रोटीन के द्रव्यमान की अनुमति ligand जटिल गणना की जा करने के लिए. यह जानकारी एक बरकरार है प्रोटीन stoichiometry, उपइकाई संरचना, ligand बंधन, और संपर्क नेटवर्क3,4,5,6के निर्धारण में सक्षम बनाता है । देशी एमएस अंय तकनीकों की तुलना में कई लाभ है ऐसे एक्स-रे क्रि और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी5। सबसे पहले, देशी एमएस एक तेजी से और अति संवेदनशील तकनीक है, कम µ एम रेंज6के लिए उच्च एनएम में अपेक्षाकृत कम अंतिम जटिल सांद्रता में नमूना के केवल कुछ microliters (2-3 µ एल) की आवश्यकता होती है । दूसरे, देशी एमएस यह एक साथ कई प्रोटीन और oligomeric राज्यों का विश्लेषण करने के लिए संभव बनाने विषम प्रोटीन नमूनों से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तीसरे, देशी एमएस रासायनिक crosslinking या प्रोटीन लेबलिंग द्वारा विश्लेषण से पहले संशोधित किया जा करने के लिए प्रोटीन के नमूनों की आवश्यकता नहीं है । इन फायदों ने स्ट्रक्चरल MS को प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संरचनात्मक जांच के लिए एक शक्तिशाली टूल बना दिया है ।

देशी एमएस आयन गतिशीलता (आईएम), एक तकनीक है कि समय एक प्रोटीन आयन एक बिजली के क्षेत्र के माध्यम से यात्रा करने के लिए लेता है उपायों के साथ जोड़ा जा सकता है, टकराव पार अनुभाग (सीसीएस) को सक्षम करने के लिए निर्धारित किया जाएगा । सीसीएस कम संकल्प संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है, जो सक्षम बनाता है टोपोलॉजी और संरचना के विविधता जानकारी के लिए प्रोटीन प्राप्त किया जाना है । इसके अलावा, यह प्रोटीन स्ट्रक्चरल गणना दृष्टिकोण द्वारा उत्पंन मॉडलों की परीक्षा की अनुमति देता है ।

प्रोटीन गैस चरण स्थिरता टक्कर प्रेरित खुलासा (CIU) IM द्वारा मापा-MS का उपयोग कर जांच की जा सकती है । CIU प्रक्रिया के दौरान, प्रोटीन आयनों में तेजी लाने और एक जन स्पेक्ट्रोमीटर7,8,9के भीतर एक निष्क्रिय बफर गैस के साथ तेजी से टकराव में वृद्धि के माध्यम से सक्रिय कर रहे हैं । इस टकराव सक्रियकरण प्रक्रिया प्रोटीन आंशिक रूप से प्रकट करना है, जो सीसीएस में वृद्धि में तब्दील हो जाता है । सीसीएस में यह परिवर्तन और प्रोटीन प्रकट करने के लिए आवश्यक ऊर्जा IM द्वारा मापा जा सकता है-MS. इस दृष्टिकोण का उपयोग, प्रोटीन स्थिरता पर बाध्यकारी ligand के प्रभाव10मापा जा सकता है । उपपरिसरों में समाधान व्यवधान विधियों का उपयोग करने के लिए कार्बनिक सॉल्वैंट्स के अलावा जैसे प्रोटीन परिसरों की topologies देशी की तरह की निगरानी के समाधान में उत्पंन किया जा सकता है । प्रोटीन परिसरों में व्यवधान मुख्य रूप से इंट्रा नॉन आबंध इंटरैक्शन के व्यवधान के कारण होता है । उप परिसरों topologies की तरह देशी बनाए रखने और एमएस का पता लगाने पर, अंतर-उप इकाई कनेक्टिविटी के बारे में जानकारी प्रकट करते हैं ।

संरचनात्मक जीवविज्ञान में एकीकृत दृष्टिकोण संरचना और प्रोटीन की गतिशीलता और उनके परिसरों3,4,5,6का अध्ययन करने के लिए विविध तरीकों गठबंधन । देशी एमएस और IM-एमएस के लिए चुनौतीपूर्ण जैविक प्रणालियों के आणविक विवरण उजागर किया गया है । वहां प्रोटीन विधानसभा मार्ग के अध्ययन सहित अनुप्रयोगों के कई उदाहरण दिया गया है11,12,13,14, अध्ययन प्रोटीन-प्रोटीन संपर्क नेटवर्क15 , 16 , 17, झिल्ली प्रोटीन6,18,19,20,21, और न्यूक्लिक एसिड के रूप में प्रोटीन-ligand बातचीत22,23 ,24.

हालांकि, देशी एमएस की भी अपनी सीमाएं हैं । देशी एमएस माप अक्सर ऐसे जलीय अमोनियम एसीटेट जिसमें कुछ प्रोटीन उनके जोड़ देशी राज्य3,25बनाए रखने नहीं होगा के रूप में अस्थिर बफ़र्स में प्रदर्शन कर रहे हैं । फिर भी, हाल के काम से पता चला है कि इस सीमा स्प्रे सुई टिप व्यास (०.५ mm युक्तियां) के अनुकूलन से दूर किया जा सकता है कि इस तरह के प्रोटीन और प्रोटीन जटिल आयनों के साथ गैर वाष्पशील बफ़र्स से सीधे गठन किया जा सकता है उच्च ईओण की शक्ति है कि बेहतर शारीरिक पर्यावरण26की नकल । साथ ही, मूल MS electrospray का उपयोग करता है और गैर-आबंध असेंबली समाधान से गैस चरण में स्थानांतरित करने के लिए; इसलिए, पता लगाया परिसरों के सापेक्ष बहुतायत समाधान5,27में पूर्ण रूप से प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है । इसके अलावा, समाधान में की तुलना में, गैस चरण hydrophobic बातचीत कमजोर हो और इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत मजबूत हो और इसलिए3,28इष्ट ।

इस अनुच्छेद में, हम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, डेटा विश्लेषण, और प्रोटीन की पहचान के लिए व्याख्या और ligand बंधन देशी एमएस, IM-ms, CIU, में समाधान व्यवधान का उपयोग कर, और मॉडलिंग । डीएनए मरंमत परिसर, HerA-नुरा, एक मॉडल प्रणाली के रूप में प्रयोग किया जाता है । डीएनए डबल फंसे टूटता (DSBs) डीएनए क्षति के सबसे साइटोटोक्सिक और बचके रूपों में से एक हैं, आनुवंशिक अस्थिरता और मनुष्यों में कैंसर के अंतिम विकास में जिसके परिणामस्वरूप । मुताबिक़ पुनर्संयोजन मरंमत तंत्र जो DSBs उंमूलन, एक प्रक्रिया है जो एटीपी आश्रित helicase-nuclease परिसर, HerA-नुरा22द्वारा किया जाता है ।

कार्यात्मक परख और मॉडलिंग के साथ देशी एमएस और IM-एमएस के संयोजन की जांच की अनुमति दी: मैं) विधानसभा में नुरा की भूमिका, अनुरूपता, और परिसर, द्वितीय की स्थिरता) dsDNA और परिसर और समग्र पर अपने प्रभाव के बीच बातचीत परिसर की स्थिरता, और iii) stoichiometry और विधानसभा22पर एटीपी बाइंडिंग का प्रभाव । कुल मिलाकर, यह काम HerA-नुरा परिसर के आणविक आधार के एक बेहतर समझ के नेतृत्व में प्रोटीन जटिल संरचना परिवर्तन और न्यूक्लियोटाइड बंधन के साथ स्थिरता को जोड़ने के द्वारा । इस प्रोटोकॉल किसी भी प्रोटीन जटिल (es) जो एक या कई ligand (ओं) के प्रकार के साथ बातचीत के लिए सामांय है ।

Protocol

1. प्रोटीन और प्रोटीन के देशी एमएस के लिए नमूना तैयारी-Ligand परिसरों

नोट: एक प्रोटीन जटिल और ligand देशी एमएस, उपयुक्त नमूना तैयारी का उपयोग कर बाध्यकारी के आणविक आधार की समझ हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस खंड का उद्देश्य एमएस विश्लेषण से पहले आवश्यक नमूना तैयारी कदम पर प्रकाश डाला है HerA-नुरा जटिल है जो डीएनए और न्यूक्लियोटाइड एक उदाहरण के रूप में बांध का उपयोग कर ।

  1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में केंद्रित शुद्ध प्रोटीन (आमतौर पर 15-30 µ मीटर) के 20 µ एल aliquots तैयार करें ।
  2. एटीपी या ADP बाइंडिंग विश्लेषण के लिए
    नोट: गैर hydrolyzable एटीपी एनालॉग adenosine 5 ′-O-(3-thiotriphosphate), tetralithium नमक (एटीपी-γ-एस) या adenosine 5 ′-diphosphate (ADP) की बढ़ती सांद्रता जोड़ें । गैर hydrolyzable एटीपी डेरिवेटिव एक स्थिर परिसर है जो एटीपी से बंधे प्रोटीन सक्षम होगा उत्पंन करने के लिए कब्जा कर लिया । परीक्षण किया जा सकता है कि अन्य गैर hydrolysable एटीपी एनालॉग शामिल AMP PNP और एटीपी-γ-S-मिलीग्राम2 +.
    1. HerA-नुरा अध्ययन के लिए, एटीपी-γ-एस के साथ शुद्ध प्रोटीन के 5 µ मीटर और 0-1 mM से लेकर सांद्रता पर ADP मिश्रण ।
    2. एक साथ एटीपी-γ-एस और ADP बाइंडिंग कैप्चर करने के लिए, दोनों न्यूक्लियोटाइड एक ही या अलग सांद्रता में जोड़ें ।
    3. 1 घंटे के लिए एक सूखी स्नान मशीन में 2 मिमी MgCl2 और 25 डिग्री सेल्सियस में मशीन जोड़ें
      नोट: nESI देशी MS का उपयोग कर न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग का विश्लेषण उच्च सांद्रता पर artefactual बाइंडिंग में परिणाम कर सकते हैं, इसलिए गैर-विशिष्ट बाइंडिंग29खाते में लिया जाना चाहिए । गैर-विशिष्ट बाइंडिंग की जांच करने के लिए, 2-5 mM के बीच न्यूक्लियोटाइड की एक उच्च एकाग्रता जोड़ें ।
  3. डीएनए बाइंडिंग विश्लेषण के लिए
    1. प्रोटीन-डीएनए जटिल गठन के लिए अनुमति देता है कि एक दाढ़ अनुपात में प्रोटीन और डीएनए मिश्रण । HerA और HerA-नुरा के लिए, एक 1:1 अनुपात में डीएनए के साथ शुद्ध प्रोटीन के 5 µ एम मिश्रण ।
    2. HerA-नुरा या HerA-एक शुष्क स्नान मशीन में 25 डिग्री सेल्सियस से कम 30 मिनट के लिए डीएनए मिश्रण जब तक यह संतुलन तक पहुंचना । अवधि और गर्मी के तापमान जांच के तहत प्रोटीन के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
    3. MS संगत बफ़र्स के लिए बफ़र एक्सचेंज प्रोटीन नमूने । आमतौर पर, पीएच 7-8 में 5 मिमी-1 मीटर के बीच जलीय अमोनियम एसीटेट समाधान किया जाता है । अंय MS संगत बफ़र्स ethylenediammonium diacetate (EDDA) और Triethylammonium एसीटेट (TEAA)30शामिल हैं । HerA-नुरा अध्ययन के लिए २०० मिमी अमोनियम एसीटेट pH 7 का उपयोग करें ।
      नोट: कोई स्पिन फोकसर या क्रोमैटोग्राफी स्तंभों का उपयोग कर के रूप में MS द्वारा विश्लेषण करने से पहले बफ़र एक्सचेंज के लिए कई विधियाँ हैं । देशी एमएस ज्यादातर इस तरह के बफ़र्स और शुद्धि के दौरान इस्तेमाल किया adducts के रूप में नमूने की गुणवत्ता द्वारा सीमित है । इसलिए, यह हल चोटियों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त लवण प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है ।
    4. HerA-नुरा ligand बाइंडिंग अध्ययनों के लिए, बफर एक्सचेंज नमूने 6-8 २०० मिमी अमोनियम में बार एक ध्यानी का उपयोग एसीटेट । हालांकि इस विधि और अधिक समय लगता है, यह सुनिश्चित करता है कि हल चोटियों हासिल कर रहे है और एटीपी/ADP बाध्य प्रजातियों में से सही जन निर्धारण

2. देशी एमएस अधिग्रहण और विश्लेषण प्रोटीन परिसरों और प्रोटीन-Ligand परिसरों की जांच के लिए

नोट: एमएस शर्तों सटीक जन माप को सक्षम करने के लिए अत्यधिक हल चोटियों को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । यह खंड विवरण एक Q-तोफ मास स्पेक्ट्रोमीटर पर 32k ऊपरी सीमा m/z quadrupole के साथ पैरामीटर्स अनुकूलित किया गया है ।

  1. नैनो-electrospray के लिए इन-हाउस केशिकाओं तैयार करें और Kirshenbaum एट अल द्वारा विस्तृत रूप में सटीक जन माप के लिए साधन द्रव्यमान अंशांकन प्रदर्शन 1.
  2. चयन संवेदनशीलता, सकारात्मक आयन प्राप्ति आणि शरीराला तोफ मोड.
  3. जाल, एपीआई और आईएमएस गैसों पर बारी । IM जुदाई के लिए, अंक शुरू करने के रूप में नाइट्रोजन (६० मिलीलीटर/min) और आर्गन (८.४ एमएल/ट्रैप क्षेत्र के लिए) का उपयोग करें और फिर समायोजित ।
  4. एक उपयुक्त m/z अधिग्रहण रेंज सेट करें । एक अज्ञात प्रोटीन के लिए, प्रारंभिक ऑप्टिमाइज़ेशन चरणों जैसे 500-32000 m/z के रूप में एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करना चाहिए ।
  5. लोड 2-3 µ एल प्रोटीन जटिल समाधान के लिए एक सोने लेपित केशिका में विश्लेषण किया जा सकता है और यह एक केशिका धारक में डालें ।
  6. धीरे केशिका कस और electrospray स्रोत चरण में केशिका जगह और डेटा प्राप्त करने शुरू करने के लिए स्थिति में मंच स्लाइड ।
  7. लागू करें कम नैनो-प्रवाह गैस दबाव (0.00-0.05 बार) जब तक एक बूंद केशिका की नोक पर बना है । नैनो प्रवाह दबाव तब तक गिरा दिया जा सकता है जब तक स्प्रे बनाए रखा है ।
  8. एक्स, वाई, जेड पदों में केशिका ले जाकर शंकु के संबंध में केशिका समायोजित करें और एक स्थिर आयन वर्तमान को प्राप्त करने के लिए आयन वर्तमान की निगरानी । 0.9-1.6 केवी की रेंज में एक केशिका वोल्टेज लागू करें ।
  9. नमूना शंकु सेट (50-120 V), स्रोत ऑफ़सेट (६०.०), स्रोत तापमान (25 ° c) और शंकु गैस प्रवाह (०.० L/ इन सुझाए गए प्रारंभिक शर्तों समायोजित किया जा सकता है ।
  10. एक अच्छी तरह से हल जन स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए और आयन संचरण को अधिकतम करने के लिए, एमएस मापदंडों को समायोजित और स्पेक्ट्रा में परिणामी परिवर्तन की निगरानी. ये जाल में गैस के प्रवाह को समायोजित करने में शामिल हैं (2-8 मिलीलीटर/, वह सेल (१८० एमएल/न्यूनतम) और आईएमएस सेल (९० एमएल/अधिकतम संचरण में सबसे अच्छा जुदाई को प्राप्त करने के लिए/
  11. वोल्टेज ऑफसेट अपर्याप्त हैं, तो जाल टकराव ऊर्जा समायोजित करें । एक इष्टतम प्रारंभिक बिंदु 10-50 वी के बीच है ।
    नोट: ट्रैप एनर्जी को बढ़ाने से नॉन-covalently बाउंड adducts को दूर कर सकते हैं । हालांकि, पृथक्करण प्रेरित टकराव और प्रोटीन का खुलासा-ligand परिसर से बचने के लिए ध्यान रखना । अगर साधन की स्थिति देशी तह राज्य में प्रोटीन को बनाए रखने की जांच करने के लिए आयन गतिशीलता मापन प्रदर्शन (चरण 3).
  12. जाल पूर्वाग्रह वोल्टेज के अनुकूलन के द्वारा desolvation में सुधार । एक इष्टतम प्रारंभिक बिंदु 20-45 वी है ।
  13. सबसे अच्छा गतिशीलता जुदाई को प्राप्त करने के लिए लहर वेग और तरंग ऊंचाई का अनुकूलन । एक विस्तृत विवरण और प्रोटोकॉल यहां पाया जा सकता है31। HerA-नुरा अध्ययन के लिए, ४० (मी) और 550-650 की लहर ऊंचाई (V) की लहर वेग का उपयोग करें ।
  14. साधन डिफ़ॉल्ट मान के रूप में अन्य सभी मापदंडों का उपयोग करें.
  15. प्रत्येक रन (चित्रा 1) के लिए एक नियंत्रण के रूप में विश्लेषण के लिए एक ligand-मुक्त नमूना तैयार करें । ligand बाध्यकारी प्रयोगों के लिए, कम से तीन स्वतंत्र माप प्रदर्शन.
  16. Masslynx सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें उत्पंन प्रजातियों की जनता को मापने के लिए और ऐसे एटीपी और ADP बाध्यकारी और oligomeric राज्यों (चित्रा 2 और 3) के रूप में ligand बाध्यकारी, की पहचान । अन्य सॉफ्टवेयर उपलब्ध UniDec३२, पल्सर३३ और Amphitrite३४शामिल हैं ।
  17. प्रजातियों के सापेक्ष बहुतायत यों तो, कच्चे ईएसआई-MS स्पेक्ट्रा में मनाया इसी आयन तीव्रता का उपयोग करें (उदाहरण के लिए बाध्य ligand, अलग oligomers, आदि) । वैकल्पिक रूप से, UniDec और Massign३५ (चित्रा 1 और 3 ) जैसे विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ठहराव प्रदर्शन करते हैं ।

3. प्राप्त करने और विश्लेषण IM-MS

नोट: IM एमएस गैस में आयनों अलग-चरण उनके आकार (बड़े पैमाने पर), आकार और प्रभारी के आधार पर । एम/जेड स्पेक्ट्रम में हल हर सुविधा एक बहाव समय वितरण के साथ जुड़ा हुआ है । IM-एमएस एक आयन जो टक्कर पार अनुभाग (सीसीएस) की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बहाव के समय उपाय । बहाव समय आईएम से मापा-एमएस डेटा एक बहाव ट्यूब का उपयोग कर अधिग्रहीत रैखिकता३६मूल्यों सीसीएस करने के लिए संबंधित किया जा सकता है मान । यात्रा लहर IM-एमएस (TWIMS) माप के लिए, सीसीएस मूल्यों की गणना एक अंशांकन ज्ञात सीसीएस३७मूल्यों के साथ प्रोटीन मानकों से प्राप्त वक्र की आवश्यकता है । कॉम्पैक्ट संरचनाओं गतिशीलता सेल३८में बफर गैस के साथ कम बातचीत के कारण विस्तारित या लंबी संरचनाओं की तुलना में तेजी से यात्रा । इसलिए, IM-MS का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर देशी जोड़ संरचना गैस चरण३९,४०में रखा गया है । इस खंड की रूपरेखा कैसे IM-एमएस को मापने के लिए और TWIMS का उपयोग कर प्रोटीन की सीसीएस की गणना ।

  1. स्थिर संचरण (चरण 2) के लिए साधन शर्तों के अनुकूलन के बाद, टकराव ऊर्जा और कम के रूप में संभव के रूप में नमूना शंकु कम whilst अच्छा स्पेक्ट्रा गुणवत्ता बनाए रखने में कमी ।
  2. IM-MS (चरण 2) प्राप्त करने के लिए अनुकूलित तरंग वेग और तरंग ऊँचाई का उपयोग करें.
  3. तीन अलग लहर वेग (जैसे, ५५०, ६०० और ६५० मी) में IM-MS के साथ आयन बहाव समय एक ही लहर ऊंचाई बनाए रखने whilst (उदा, ४० वी) उपाय ।
  4. प्रोटीन आयनों सीसीएस निर्धारित करने के लिए, एक ही साधन की जांच के तहत प्रोटीन के लिए इस्तेमाल की शर्तों के तहत प्रोटीन calibrants उपाय । इष्टतम बहाव समय अंशांकन ज्ञात सीसीएस के साथ प्रोटीन की माप की आवश्यकता है ।
    1. चार calibrants का चयन करें, एक मास के ऊपर और दो के साथ एक बड़े पैमाने पर नीचे के साथ दो जांच३७के तहत प्रोटीन की । सबसे महत्वपूर्ण बात यह सुनिश्चित करें कि तरंग ऊंचाई और तरंग वेग जांच के तहत प्रोटीन के लिए दर्ज की गई उन के रूप में ही कर रहे हैं ।
  5. गणना सीसीएस मैंयुअल रूप से४१ या ऐसे पल्सर३३ और Amphitrite३४ (चित्रा 5) के रूप में एक विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ।
  6. जांच करने के लिए कि प्रोटीन देशी-गैस चरण में की तरह है, सैद्धांतिक उच्च संकल्प संरचनाओं से प्राप्त सीसीएस के लिए प्रयोगात्मक सीसीएस की तुलना करें । HerA-नुरा के लिए, सैद्धांतिक सीसीएस प्रक्षेपण सन्निकटन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) MOBCAL४२में प्रयुक्त विधि का उपयोग कर की गणना । अंय तरीकों पथ विधि (TM)४२ और सटीक हार्ड क्षेत्रः कैटरिंग (ईएचएस)४३शामिल हैं ।

4. देशी एमएस और IM के लिए प्रोटीन परिसरों के समाधान में व्यवधान-एमएस एलईडी संरचना निर्धारण

नोट: प्रोटीन उप परिसरों कुछ मामलों में बरकरार परिसर के रूप में एक ही समाधान से पहचाना जा सकता है । हालांकि, आगे की संरचनात्मक जानकारी जैसे अंतर-उप-इकाई कनेक्टिविटी और जटिल असेंबली समाधान में प्रोटीन इंटरैक्शन को बाधित करने से प्राप्त की जा सकती है, जिससे सब-कॉम्प्लेक्स का रूप ले सकते हैं । इस तरह के कार्बनिक विलायक के अलावा के रूप में कई मायनों में प्राप्त किया जा सकता है, ईओण ताकत बढ़ाने या पीएच जोड़ तोड़ । HerA-नुरा जटिल उपइकाई कनेक्टिविटी और जटिल विधानसभा में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, उप-परिसरों को हल में सॉल्वैंट्स जो उपइकाई बातचीत perturb जोड़कर उत्पंन किया गया ।

  1. चरण 1में बताए गए अनुसार अमोनियम एसीटेट में प्रोटीन का नमूना और बफर एक्सचेंज तैयार करें ।
  2. 10% वेतन वृद्धि में विलायक के 10-40% जोड़ें । आम तौर पर इस्तेमाल किया सॉल्वैंट्स मेथनॉल (MeOH), dimethyl sulfoxide (DMSO) या acetonitrile (ACN) हैं ।
    नोट: यह एक microcentrifuge ट्यूब के भीतर किया जा सकता है ।
  3. 1 एच के लिए बर्फ पर मिश्रण गर्मी ।
  4. प्रत्येक शर्त के लिए एक IM-एमएस स्पेक्ट्रम प्राप्त (2 चरण और 3) (चित्रा 4) ।
  5. का प्रयोग करें शिखर संमेलन सॉफ्टवेयर४४ को आवंटित प्रोटीन उप परिसरों और प्रोटीन संपर्क नेटवर्क उत्पंन करते हैं । वैकल्पिक रूप से, मैंयुअल रूप से अपेक्षित प्रजातियों में से सैद्धांतिक जनता की एक सूची उत्पंन करते हैं ।
  6. यह सुनिश्चित करने के लिए उपपरिसरों जोड़ रहे हैं, उप के लिए प्रयोगात्मक सीसीएस मूल्यों की गणना-परिसरों और सैद्धांतिक सीसीएस के लिए तुलना के रूप में चरण 3 (तालिका 1, चित्रा 5 और चित्रा 6) में बताया गया है ।

5. जांच प्रोटीन जटिल स्थिरता का उपयोग कर टक्कर प्रेरित खुलासा (CIU)

नोट: CIU प्रोटीन और ligand बाध्यकारी पर उनके परिसरों की संरचनात्मक स्थिरता जांच इस्तेमाल किया जा सकता है । ऐसे पल्सर३३, Amphitrite३४ और CIU सूट9 के रूप में विशेषज्ञ सॉफ्टवेयर संकुल तो गैस के साथ जांच के तहत और ligand के बिना चरण प्रोटीन का खुलासा मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, इस खंड की निगरानी के लिए प्रक्रिया की रूपरेखा गैस चरण खुलासा पथ और डीएनए और एटीपी HerA-नुरा परिसर पर बाध्यकारी के स्थिर प्रभाव की जांच ।

  1. रिकॉर्ड IM-एमएस डेटा के जाल त्वरण वोल्टेज में वृद्धि whilst 10 वी से २०० v में 2-10 v वेतन वृद्धि उत्तरोत्तर गैस चरण में प्रोटीन प्रकट करना ।
    नोट: प्रक्रिया करने के लिए अधिक डेटा फ़ाइलों में छोटी वृद्धि की रिकॉर्डिंग परिणाम, लेकिन इस दृष्टिकोण और अधिक समाधान खुलासा साजिश है, जो तह/सामने प्रजातियों के बीच संक्रमण अंक का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है प्रदान करता है ।
  2. , पल्सर३३, Amphitrite३४ या CIU suite9 का उपयोग कर अधिग्रहीत डेटा का विश्लेषण और वोल्टेज में तेजी लाने के एक समारोह के रूप में सीसीएस की इकाइयों में दो आयामी खुलासा भूखंडों (चरण 3) उत्पंन करते हैं । प्रत्येक प्रभारी राज्य के लिए, यह प्रत्येक त्वरित वोल्टेज (चित्रा 7 ए द्वि) में तीव्रता सामान्यीकृत सीसीएस वितरण स्टैकिंग के द्वारा बनाई गई है ।
  3. सॉफ्टवेयर संकुल में से एक का उपयोग कर एक सैद्धांतिक खुलासा साजिश उत्पन्न करते हैं । डेटा एक खुलासा मॉडल को फिट किया जाएगा । यह यह टकराव ऊर्जा जो खुलासा संक्रमण होते है और साथ में और लाइगैंडों३३बाध्य बिना प्रोटीन की स्थिरता का निर्धारण करने के लिए संभव बनाता है । एक खुलासा संक्रमण है जब एक राज्य से एक प्रजाति संक्रमण (उनके प्रयोगात्मक सीसीएस मूल्यों के आधार पर) एक बड़ा सीसीएस के साथ दूसरे राज्य के लिए ।
  4. संक्रमण को quantitate करने के लिए, ऐसे पल्सर३३के रूप में एल्गोरिदम और सॉफ्टवेयर का उपयोग राज्यों के बीच संक्रमणकालीन मध्यबिंदु (एस) की गणना । यह आमतौर पर CV५०, जो टक्कर (ट्रैप) वोल्टेज मूल्य है, जो एक विशिष्ट राज्य के ५०% समाप्त हो गया है के रूप में सूचित है ।
  5. CV५० मूल्य का प्रयोग, एक आयन की कुल आंतरिक ऊर्जा की गणना के केंद्र का उपयोग कर-मास टक्कर ऊर्जा (KECOM)४५। KECOM कुल आंतरिक एक आयन का खुलासा संक्रमण के लिए उपलब्ध ऊर्जा द्वारा परिभाषित किया गया है और काइनेटिक ऊर्जा और टकराव भागीदारों (प्रोटीन आयन और तटस्थ गैस) की जनता से गणना के रूप में समीकरण में वर्णित (1)10
    KEcom (eV) = Equation 1 (समीकरण 1) ।
    जहां Z आयन चार्ज है, एमएन तटस्थ गैस और एमआयन के द्रव्यमान है प्रोटीन आयन के द्रव्यमान है ।
    नोट: यह है क्योंकि प्रोटीन के CIU चार्ज dependent46, 47 है । यह एक से अधिक प्रभार राज्य ( चित्रा 7Aii) के लिए KECOM विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है ।

6. मॉडलिंग विभेदक आणविक गतिशीलता एकीकृत एमएस में इस्तेमाल किया सिमुलेशन के लिए प्रक्रियाओं

नोट: प्रोटीन उपइकाईयों या क्रिस्टल संरचनाओं, विभेदक एमडी सिमुलेशन (के साथ और बिना ligand) के रूप में परिसरों के मॉडल का उपयोग प्रोटीन संरचना और गतिशीलता पर उदाहरण ligand उपस्थिति के लिए प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह खंड एक कार्यप्रवाह और सेट अप अंतर आणविक गतिशीलता सिमुलेशन के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं मॉडलिंग के लिए जरूरी उपकरण विवरण ।

  1. उपइकाईयों की पहचान करें जो जटिल (चित्रा 8A, चरण 2 और 3) मेंरचना करती हैं । स्रोत उपइकाईयों के मौजूदा मॉडल, जैसे, RCSB डाटाबैंक (https://www.rcsb.org) से क्रिस्टल संरचनाओं । प्रोटीन की UniProt प्रविष्टि पता crystallographic/एनएमआर संरचनाओं (http://www.uniprot.org) की एक सूची में शामिल होंगे । इन उपलब्ध नहीं हैं, तो सैद्धांतिक अनुक्रम समरूपता मॉडलिंग (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) के लिए उपयुक्त टेम्पलेट्स की पहचान करने के लिए विस्फोट करने के लिए इनपुट हो सकता है.
  2. सही टोपोलॉजी (चित्रा 8A-ii) में जटिल इकट्ठा । यह विभिंन तरीकों के माध्यम से किया जा सकता है । व्यक्तिगत उपइकाइयों उपलब्ध इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी EMDB पर पाया नक्शे में फिट किया जा सकता है के लिए बरकरार परिसर (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/) इकट्ठा । उंहें आणविक गतिशीलता लचीला फिटिंग (MDFF) का उपयोग कर नक्शे में फिटिंग PDBs के लिए एक ट्यूटोरियल यहां पाया जा सकता है: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/।
  3. जटिल (चित्रा 8ए-iii) के लापता क्षेत्रों की पहचान करें । PDB और सैद्धांतिक अनुक्रम के बीच कई अनुक्रम संरेखण (एमएसए) प्रदर्शन अवशेषों जो क्रिस्टल संरचनाओं, या crystallographic प्रयोगों से विरासत में मिला किसी भी उत्परिवर्तनों में फिट हो सकता है की पहचान करने के लिए । एमएसए जैसे टी कॉफी (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular) के रूप में वेब सर्वर का उपयोग किया जा सकता है ।
  4. समरूपता मॉडलिंग के माध्यम से लापता अवशेषों पुनर्जंम (चित्रा 8ए-iv) । प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के लापता अवशेषों को मॉडलिंग प्रोग्राम (https://salilab.org/modeller/) का उपयोग करके बनाया जा सकता है । मॉडलिंग अलग पुनर्जीवित विंयास में एन मॉडलों का एक पहनावा उत्पादन कर सकते हैं । अच्छे मॉडलों की पहचान उनके असतत अनुकूलित प्रोटीन ऊर्जा (डोप) स्कोर के आधार पर की जा सकती है । एक व्यापक ट्यूटोरियल सॉफ्टवेयर वेबसाइट (https://salilab.org/modeller/tutorial/) पर प्रदान की जाती है ।
  5. अंतर आणविक गतिशीलता (एमडी) सिमुलेशन (चित्रा 8बी) प्रोटीन के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए जो एक विशेष पर्यावरण परिवर्तन का जवाब, एक ligand की उपस्थिति, उदाहरण के लिए प्रदर्शन । ऐसे सिमुलेशन में, सिमुलेशन से व्यवहार मापदंडों एक (केवल प्रोटीन) जो एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है, सिमुलेशन बी (प्रोटीन + ligand) से घटाया है । अंतर जड़ मतलब वर्ग अस्थिरता (RMSF) सिमुलेशन के बीच की गणना a और B प्रोटीन जो वृद्धि या एक ligand निर्भर तरीके से लचीलापन में कमी के क्षेत्रों पर सूचित कर सकते हैं ।
    1. GROMACS (http://www.gromacs.org) का उपयोग कर एमडी सिमुलेशन और बहाव विश्लेषण करते हैं । एक ट्यूटोरियल में पाया जा सकता है: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html । मॉडल पूर्वाग्रह को elimate करने के लिए, ligand-बाउंड कॉम्प्लेक्स की संरचना पहले जेनरेट की जानी चाहिए । प्रोटीन तो ligand के बिना इस से नकल की है, एक प्रोटीन ligand-बाउंड जटिल के समान मॉडल उपज ।

Representative Results

देशी एमएस परिणाम oligomeric राज्य, संरचना और HerA के टोपोलॉजी-नुरा परिसर (चित्रा 1) से पता चला । के रूप में गैर आबंध बातचीत गैस चरण में संरक्षित कर रहे हैं, एटीपी के देशी MS-γ-S और ADP titrations प्रयोगों pairwise न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी HerA-नुरा (चित्रा 2) के लिए निर्धारित और है कि एटीपी-γ-s एकाग्रता बढ़ जाती है रिश्तेदार hexameric HerA की तीव्रता (चित्रा 3) । संरचनात्मक उप इकाई बातचीत के बारे में जानकारी में से प्राप्त किया गया समाधान व्यवधान देशी एमएस द्वारा पीछा किया और के साथ समझौते में थे और सैद्धांतिक जनता (4 चित्रा और तालिका 1) ।

प्रोटीन और उनके परिसरों के प्रायोगिक सीसीएस मूल्यों आईएम-एमएस प्रयोगों (चित्रा 5) से व्युत्पंन किया गया था । ये मान रहे है आवर्ती औसत गैस-चरण पार-आणविक आकार के अनुभागीय गणना, और प्रोटीन के आयामी राज्य का वर्णन । सीसीएस मूल्यों एक्स-रे क्रि से सैद्धांतिक माप की तुलना में कर रहे है और एक अच्छा समझौते का अनुमान है कि देशी आकार में बनाए रखा में गैस चरण (तालिका 1)। इस प्रोटीन४८विधानसभा के कम संकल्प मॉडल के निर्माण के लिए सीसीएस मूल्यों का उपयोग सत्यापित करता है ।

प्रायोगिक CCSs प्रत्येक प्रभारी राज्य आयन के लिए गणना की जा सकती है । एक देशी प्रोटीन क्षेऽ की तरह समान सीसीएस मूल्यों के साथ राज्य आयनों प्रभारी को जंम दे सकता है । हालांकि, उच्च प्रभार राज्य आयनों coulombic आवेगों जो प्रोटीन गैस के लिए नेतृत्व कर सकते हैं बढ़ा-चरण खुलासा और बड़ा सीसीएस मूल्यों सैद्धांतिक CCSs की तुलना में. सबसे कम चार्ज राज्य आयनों के सीसीएस मूल्य इसलिए आमतौर पर४९का इस्तेमाल कर रहे हैं । HerA-नुरा के लिए, में समाधान विघटन प्रयोगों पर HerA और HerA-नुरा के साथ और डीएनए के बिना एक विधानसभा मार्ग की पीढ़ी मोनोमर के साथ शुरू करने के लिए प्रेरित किया तो पूरे hexameric HerA बनाने (HerA6)-dimeric नुरा (नुरा2) जटिल डीएनए के साथ (चित्रा 6) ।

एपीओ के बीच CIU खुलासा भूखंडों में अंतर (ligand मुक्त) और ligand बाध्य ligand बाध्यकारी पर जटिल स्थिरता में परिवर्तन को परिभाषित । एक उच्च सीवी५० या KECOM मान गैस चरण में एक अधिक स्थिर आयन का तात्पर्य है. CIU और KECOM विश्लेषण से पता चला डीएनए बाउंड HerA-नुरा डीएनए-फ्री कॉम्प्लेक्स (figure 7Aii) से ज्यादा स्थिर है । संबंधित एटीपी-बाध्यकारी राज्यों में CIU-एमएस एनालिसिस से, फोर-एटीपी-γ-एस बाउंड स्टेट गैस-फेज में जटिल स्थिरता को कम कर दिया गया है और छह-एटीपी-γ-एस बाउंड स्टेट जहां सभी साइटों पर कब्जा कर रहे हैं, सबसे स्थिर (चित्रा 7बीि) था । देशी एमएस HerA के असतत न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी राज्यों प्रकट कर सकते हैं; हालांकि, यह भेद नहीं कर सकता जो HerA उपइकाई एटीपी बाइंडिंग और जहां इस बाइंडिंग जगह लेता है । यह जानकारी hexameric HerA पर स्पष्ट विलायक एमडी सिमुलेशन से व्युत्पंन किया जा सकता है और संक्षिप्त कार्यप्रवाह (चित्रा 8) के बाद HerA-नुरा ।

Figure 1
चित्र 1. oligomeric राज्य, संरचना और HerA-नुरा गैर आबंध परिसर के टोपोलॉजी पूछताछ । (क) जन स्पेक्ट्रा के HerA, HerA-नुरा और HerA-नुरा की उपस्थिति में डीएनए (१५.४ केडीए 25 बीपी डबल कतरा डीएनए). HerA उप-परिसर दोनों एक hexamer और एक heptamer के रूप में मौजूद है । नुरा डिमर बाँधता है और करने के लिए एक HerA hexamer थोपे oligomeric रूपांतरण । डीएनए (Z. Ahdash एट अल., २०१७22से अनुकूलित परिणाम) का गठन HerA-नुरा परिसर बांधता है । (ख) की पहचान की प्रजातियों के सापेक्ष तीव्रता UniDec३२का उपयोग कर की गणना कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. देशी ईएसआई-एमएस HerA-नुरा के लिए बाध्यकारी न्यूक्लियोटाइड के तंत्र का पता चलता है । मास स्पेक्ट्रा (क) HerA-नुरा और (ख) HerA-नुरा-डीएनए की सांद्रता बढ़ाने के साथ (i) एटीपी-γ-एस और (ii) ADP. मापा जनता सैद्धांतिक जनता की तुलना में कर रहे हैं और एटीपी-γ-S या ADP बंधे की राशि निर्धारित कर रहे हैं. मापा जनता और बाउंड न्यूक्लियोटाइड की संख्या स्पेक्ट्रा पर दिखाए जाते हैं । एटीपी-γ-एस और ADP titrations प्रयोगों के लिए pairwise न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी निर्धारित HerA-नुरा अकेले और जब एक चक्रीय प्रतिक्रिया तंत्र का संकेत डीएनए के साथ जटिल में (Z. Ahdash एट अलसे अनुकूलित परिणाम, २०१७22) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. HerA oligomeric राज्य पर एटीपी-γ-एस सांद्रता बढ़ाने के प्रभाव को मापने. (क) एटीपी-γ-एस की बढ़ती सांद्रता पर मास स्पेक्ट्रा ऑफ HerA (ख) UniDec deconvolution सॉफ्टवेयर३२का उपयोग कर की गणना देशी एमएस से अलग प्रजातियों के सापेक्ष तीव्रता दिखा ग्राफ. जैसे-जैसे एटीपी-γ-एस एकाग्रता बढ़ जाती है, hexameric HerA की सापेक्ष तीव्रता भी बढ़ जाती है. एटीपी-γ-S बाउंड अणुओं की संख्या स्पेक्ट्रा पर दिखाया गया है (Z. Ahdash एट अल., २०१७22से अनुकूलित परिणाम). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. मास स्पेक्ट्रा और उप-जटिल पृथक्करण उत्पादों (क) HerA और (ख) HerA-नुरा (i) अकेले और की उपस्थिति में (ii) डीएनए में समाधान व्यवधान के बाद । समाधान विघटन प्रयोगों में Acetonitrile, मेथनॉल (MeOH) या dimethyl sulfoxide (DMSO) के 10-40% का उपयोग किया गया और विभिन्न उपपरिसरों के गठन का परिणाम हुआ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. आयन गतिशीलता आगमन समय वितरण परिसरों और उत्पन्न उप परिसरों के लिए एक सीसीएस अक्ष पर दिखाया गया है । प्रत्येक उप-परिसर के लिए चिह्न 4 चित्रामें स्पेक्ट्रा पर व्याख्या उन लोगों के साथ सहसंबंधी बनाना । प्रयोगात्मक और गणना की जनता और उप के सीसीएस मूल्यों-परिसरों तालिका 1 में सूचीबद्ध है जिनमें से सभी प्रयोगात्मक और गणना मूल्यों के बीच एक समझौते को दिखाया (लहर आयन यात्रा के संकल्प में ठेठ अनिश्चितता पर विचार के बाद गतिशीलता मास स्पेक्ट्रोमेट्री ± 5-8%३७) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. HerA-नुरा परिसर में समाधान व्यवधान देशी एमएस और IM-ms. रंगीन हलकों से उत्पन्न की विधानसभा मार्ग संकेत शर्तों जहां प्रत्येक उप-परिसर में मनाया गया था: देशी (हरी, व्यवधान से पहले), मेथनॉल (पीला), DMSO (बैंगनी) या Acetonitrile (लाल) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7. (क) HerA पर डीएनए के स्थिर प्रभाव की जांच-नुरा और (ख) एटीपी HerA-नुरा-डीएनए के लिए बाध्य । (i) गैस चरण CIU-MS भूखंड और (ii) केंद्र-की-मास collision ऊर्जा (KEcom) गणना बताते है कि dsDNA की उपस्थिति HerA-नुरा परिसर को स्थिर करता है और यह कि छह एटीपी-γ-एस बाउंड राज्य सबसे अधिक स्थिर है । विभिंन प्रभार राज्यों के लिए स्थिरीकरण दिखाया गया है । भूखंड पल्सर ३३का उपयोग कर उत्पंन किया गया । से परिणाम (एक) जेड Ahdash एट अलसे अनुकूलित, २०१७22। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8. अंतर आणविक गतिशीलता सिमुलेशन के लिए मॉडलिंग प्रक्रियाओं के लिए कार्यप्रवाह । (क) मौजूदा उपइकाईयों से टोपोलॉजी का निर्माण करके और लापता अवशेषों के पुनर्निर्माण के द्वारा जांच के अंतर्गत जटिल उत्पादन । (ख) के साथ और ligand के बिना प्रोटीन परिसर पर आणविक गतिशीलता सिमुलेशन चलाने के लिए कार्यप्रवाह । आणविक गतिशीलता सिमुलेशन प्रोटीन के लिए दौड़ा रहे है केवल जो एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है और जो प्रोटीन से अधिक ligand के अनुकरण से घटाया है । यह अंतर जड़ का मतलब वर्ग अस्थिरता (RMSF) सिमुलेशन के बीच और ligand बाध्यकारी के प्रभाव का निर्धारण द्वारा गणना के बाद है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

परिसर/ सैद्धांतिक मास (केडीए) प्रायोगिक जनसंचार (केडीए) सैद्धांतिक सीसीएस (Å2) प्रायोगिक सीसीएस (Å2) [प्रभारी] हालत हेमवती
HerA6-नुरा2 ४१६.२२ ४१७.८५ १४५३१ १४५७७ [42 +]
१४५९९ [43 +]
१४६०८ [44 +]
१४६३७ [45 +]		 10-20% ACN, 10-40% DMSO, १०% MeOH
HerA6-नुरा2-dsDNA ४३१.७२ ४३२.२७ - १४६६१ [39 +]
१४७२८ [40 +]
१४७८१ [41 +]
१४८३७ [42 +]		 १०% ACN, १०% MeOH
नुरा१ ३९.१२ ३८.१८ ३२५४ २६१८ [10 +]
२७४६ [11 +]
२८७८ [12 +]		 10-40% ACN, १०% MeOH, 20-40% DMSO
नुरा२ ७८.२४ ७८.३६ ४८९० ४९०३ [16 +]
४६१४ [17 +]
४५३७ [18 +]
४६६६ [19 +]		 10-40% MeOH, 20-40% DMSO
HerA१ ५६.३३ ५६.३२ ४१३१ ३६४७ [14 +]
३७९२ [15 +]
३९५० [16 +]		 10-40% ACN, ४०% DMSO
HerA२ ११२.६६ ११२.९५ ६४७५ ५६४८ [20 +]
५७४७ [21 +]
५८४२ [22 +]
५९९६ [23 +]		 ४०% मेठ, 10-40% ACN
HerA३ १६८.९९ १६९.३९ ८६०७ ७५०१ [25 +]
७६१६ [26 +]
७७१७ [27 +]
७८६७ [28 +]		 10-40% MeOH, 10-40% खरच, ४०% DMSO
HerA3 + डीएनए १८३.९९ १८४.९७६ - ७६५५ [26 +]
७९९० [27 +]
८१०७ [28 +]		 10-30% ACN
HerA4 २२५.३२ २२६.२ १०४७७ ९२०५ [30 +]
९२८७ [31]
९४९३ [32 +]
९९६१ [33 +]		 10-40% MeOH, 10-40% ACN
HerA4 + DNA २४०.८२ २४१.३३ - ९६३७ [31 +]
९७५६ [32 +]
९८३० [33 +]		 10-30% ACN
HerA5 २८१.६५ २८२.७५ ११८५३ १०८४७ [36 +]
१०९५८ [37 +]
१११६१ [38 +]		 30-40% ACN
HerA6 ३३७.९८ ३३९.३ १२५१७ १२३३५ [38 +]
१२३८६ [39 +]
१२४९८ [40 +]
१२५९० [41 +]
१२६७६ [42 +]
१३०१९ [43 +]		 10-40% MeOH, 10-40% ACN
HerA6 + डीएनए ३५३.४८ ३५४.६२६ - १२८९० [40 +]
१३०८१ [41 +]
१३१८४ [42 +]
१३२७३ [43 +]
१३४६३ [44 +]
१३५७६ [45 +]		 30% ACN
HerA7 ३९४.३ ३९५.८५ १३९०१ १४१५४ [42 +]
१४२१९ [43 +]
१४२६१ [44 +]
१४२८५ [45 +]
१४३३५ [46 +]		 10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO
HerA7 + DNA ४०९.८ ४१०.६२ - १४४१४ [41 +]
१४५१० [42 +]
१४५५८ [43 +]
१४५९८ [44 +]
१४६३० [45 +]
१४६४१ [46 +]		 10% ACN

तालिका 1. प्रयोगात्मक और गणना की जनता और HerA के सीसीएस मूल्यों-नुरा और उसके उप परिसरों में फार्म का समाधान व्यवधान अध्ययन उत्पंन ।

Discussion

एमएस प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के stoichiometry, इंटरैक्शन और उपइकाई आर्किटेक्चर को निस्र्पक में तेजी से महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है । आईएम-एमएस डेटा multicomponent परिसरों के भीतर उपइकाईयों के टोपोलॉजिकल व्यवस्था को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय मौजूदा संरचनात्मक जीवविज्ञान तरीकों की तुलना में, एमएस कई फायदे हैं । देशी एमएस एक तेजी से और अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है और विषम प्रोटीन नमूनों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जब में समाधान व्यवधान प्रयोगों के साथ युग्मित, प्रोटीन सभाओं के पृथक्करण रास्ते पर नजर रखी जा सकती है । क्रिस्टल संरचनाओं या समरूपता मॉडल के साथ साथ, संरचनात्मक एमएस द्वारा की पेशकश की जानकारी प्रोटीन ligand बातचीत की जांच के लिए एक उपकरण प्रदान करता है और निकट देशी मॉडल और विधानसभा रास्ते11प्रदान करते हैं ।

यहां, हम stoichiometry और प्रोटीन की संरचना-ligand बातचीत का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन, एक या एक से अधिक लाइगैंडों के साथ, एकीकृत एमएस का उपयोग यह एमएस नमूना तैयारी, डेटा अधिग्रहण, डेटा विश्लेषण, और गणना उपकरण का उपयोग कर एमएस डेटा के एकीकरण भी शामिल है । ऐसा करने के लिए, हम डीएनए-लकीर HerA-नुरा hetero-oligomeric प्रोटीन जटिल, तीन लाइगैंडों (डीएनए, एटीपी, और ADP) के लिए बाध्य, हमारे मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया । प्रोटोकॉल डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति सहायता के लिए वर्तमान में उपलब्ध सॉफ्टवेयर के उपयोग से पता चलता है ।

उच्च गुणवत्ता स्पेक्ट्रा प्राप्त करने ligand बाध्यकारी विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए, प्रोटीन शुद्धि, ligand अनुमापन, और बफर एक्सचेंज सहित सावधान नमूना तैयारी कदम महत्वपूर्ण हैं । ligand बाइंडिंग का अध्ययन करते समय nESI मूल MS की एक सीमा गैर-विशिष्ट बाइंडिंग है । गैर-विशिष्ट बाइंडिंग electrospray प्रक्रिया भर desolvation छोटी बूंद के दौरान होती है । इस ligand सांद्रता बढ़ जाती है और इसलिए प्रोटीन/ligand अनुपात29बदल । एपीओ और न्यूक्लियोटाइड-बाउंड प्रोटीन जो ionization दक्षता५०,५१में परिवर्तन नहीं करता है के बीच एक अपेक्षाकृत छोटे बड़े अंतर में न्यूक्लियोटाइड परिणाम के बंधन ।

हम अपने काम के लिए Synapt G2-Si एमएस सिस्टम का इस्तेमाल किया, लेकिन प्रोटोकॉल अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नैनो-electrospray मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर अन्य प्रोटीन-ligand परिसरों की विभिन्न जांच के लिए लागू कर रहे हैं. एकीकृत संरचनात्मक एमएस अधिक जटिलता की जैविक समस्याओं को संबोधित करने में तेजी से एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है । कार्यप्रवाह और तकनीक यहां वर्णित संरचनात्मक परिणाम और प्रोटीन जटिल और प्रोटीन के निर्माण तंत्र-ligand गठन जो अंयथा मुश्किल पारंपरिक संरचनात्मक तकनीक का उपयोग कर रहे है समझने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है .

Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

हम कार्ल-पीटर Hopfner और रॉबर्ट थॉमस Byrne शुक्रिया अदा करना चाहूंगा के लिए कृपया HerA और HerA-नुरा प्रोटीन नमूनों और प्रयोगात्मक डिजाइन के साथ उनकी मदद के लिए प्रदान करते हैं । हम भी पांडुलिपि के अपने समीक्षा के लिए ट्विटर पढ़ने के लिए धंयवाद । हम कृतज्ञता हमारे धन निकायों स्वीकार करते हैं: वेलकम ट्रस्ट [109854/z/15/z] और रॉयल सोसाइटी [RG150216 to एपी] ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt Merck Millipore 119120-25MG
Adenosine 5′-diphosphate  Sigma-Aldrich 20398-34-9
Ammonium acetate solution Sigma-Aldrich A2706
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad 7326204
Vivaspin concentrator Sartorius Z614041-25EA
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Water TraceSelect Sigma-Aldrich 95305
Borosilicate Capillaries Harvard Apparatus 300060

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रसायन विज्ञान अंक १४० मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) देशी एमएस आयन गतिशीलता प्रोटीन परिसरों गैर आबंध बातचीत न्यूक्लियोटाइड बंधन डीएनए बंधन आणविक गतिशीलता मॉडलिंग ।
एकीकृत संरचनात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन आर्किटेक्चर और प्रोटीन-Ligand परिसरों का विश्लेषण
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Ahdash, Z., Lau, A. M., Martens, C., … More

Ahdash, Z., Lau, A. M., Martens, C., Politis, A. Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e57966, doi:10.3791/57966 (2018).

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