Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Parring-baserede overekspression bibliotek Screening i gær

Published: July 6, 2018 doi: 10.3791/57978
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Wright State University

Summary

Denne artikel præsenterer en parring-baseret metode for at lette overekspression screening i spirende gær ved hjælp af en klædt plasmid bibliotek.

Abstract

Spirende gær har været meget anvendt som model i at studere proteiner forbundet med sygdomme hos mennesker. Genome-wide genetisk screening er et kraftfuldt værktøj, der er almindeligt anvendt i gær undersøgelser. Udtryk for en række neurodegenerativ sygdom-associerede proteiner i gær forårsager cytotoksicitet og samlede dannelse, recapitulating resultater ses hos patienter med disse lidelser. Her, beskriver vi en metode til screening af en gær model af amyotrofisk Lateral sklerose-forbundet protein FUS for modificering af dets toksicitet. Istedet for benytter transformation, afhængig af denne nye screening platform parring af gær til at indføre en klædt bibliotek af plasmider i gær model. Metoden parring har to klare fordele: for det første er yderst effektiv; andet kan pre transformerede klædt biblioteket af plasmider gemmes for langsigtet som en glycerol bestand, og hurtigt anvendes på andre skærme uden den arbejdskrævende trin af transformation i gær model hver gang. Vi demonstrere, hvordan denne metode kan med succes bruges til at screene for gener, der ændrer FUS toksicitet.

Introduction

Spirende gær Saccharomyces cerevisiae har været meget anvendt i videnskabelig grundforskning1 for at forstå cellulære processer direkte relateret til menneskelige sygdomme. Desuden, det har været brugt som en model organisme, for at studere menneskelig sygdom-associerede proteiner, som dem knyttet til de mest almindelige neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, Huntingtons chorea og Amyotrofisk Lateral sklerose (ALS)2. En fordel ved gær modellen er den lethed, hvormed en genome-wide screen kan udføres for at identificere cellulære veje relateret toksicitet af sygdom-relaterede proteiner, hvilket giver indsigt i mekanismen af deres toksicitet. En sådan skærm kaldes en overekspression Biblioteksskærmen, hvori hver af de 5.500 gær gener i en klædt bibliotek er omdannet til en gær model til at identificere, hvilke gener kan ændre toksicitet når overexpressed. Denne screeningsmetode har været anvendt med succes i gær modeller af flere neurodegenerativ sygdom-associerede proteiner, herunder huntingtin for Huntington's chorea3, α-synuclein for Parkinsons sygdom4,5 , Aβ for Alzheimers sygdom6, og FUS og TDP-43 for ALS7,8,9. Mens det er normalt gøres i en høj overførselshastighed måde10, er den mest tidskrævende trin af skærmen individuelt omdanne 5.500 gær gener fra en klædt bibliotek. Dette trin skal udføres hver gang screening er gentaget, og når en nyetableret gær model skal undersøges. Det er vigtigt at finde en mere effektiv måde at udføre denne opgave.

Gærceller kan stabilt findes i både haploide og diploide form. Der er to modsatte parring typer haploide celler, parring type en og α. haploide celler af hver parring type producerer og udskiller deres egne specifikke parring pheromone, som kun de modsatte parring type celler reagerer. Dette giver mulighed for parring mellem en og α celler til at producere stabil diploide celler, a/α. Denne proces er spontan og højeffektive11. Vi kan drage fordel af denne unikke livscyklus af S. cerevisiae at indføre plasmid bibliotek. Mere specifikt vil hvert gen i biblioteket klædt plasmid blive omdannet til haploide celler af en parring type, dvs., α celle. Disse celler, der indeholder bibliotek gener gemmes derefter på glycerol lager i en klædt 96-brønds format. For hver gær model, der skal screenes, gærceller indeholdende bibliotek gener kan blive optøet straks fra glycerol lager, og screening kan gøres gennem parring med gær model af interesse i den modsatte parring typen, dvs., parring en. Denne idé om at bruge parring for at samle to gener i gær er ikke ny. Det har været anvendt med succes i høj overførselshastighed gæren to-hybrid screening, hvori en agn konstruere (dvs., Gal4-DNA-bindende domæne fusions) i en parring type er bragt sammen via parring med en bytte konstruktion fra en klædt bibliotek 12. men denne strategi har aldrig været anvendt i overekspression bibliotek screeninger, som altid har brugt traditionel transformation metoder.

Vores laboratorium tidligere konstaterede en gær model af ALS-forbundet protein FUS7. Gennem overekspression bibliotek screening ved hjælp af metoden transformation opdagede vi fem gær gener (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, og VHR1), der redde toksicitet af FUS når overexpressed. Disse resultater blev uafhængigt bekræftet med en lignende undersøgelse af en anden gruppe8. hUPF1, en menneskelig homolog af ECM32, blev senere vist at undertrykke toksicitet i primære neuronale celler13 og i en dyremodel af ALS14 så godt. Ved hjælp af disse fem gener som bevis af princippet, vise vi, at alle fem gener ligeledes redde FUS toksicitet, når de føres ind i FUS gær model af parring. Da gærceller, der indeholder bibliotek gener kan gemmes permanent på glycerol lager og genoplivet efter behov, fjerner denne parring-baseret metode den tidskrævende trin af transformation hver gang biblioteket skal være Afskærmet mod. Da parring er yderst effektiv med ingen plasmid transformation involveret, reducerer denne strategi også betydeligt omkostningerne forbundet med rensning og transformation af et stort plasmid bibliotek. Vi vil med succes anvende denne metode til et bibliotek for screening mod gær model af FUS.

Proceduren for parring-baseret screening er kort beskrevet i figur 1. I første omgang, er klædt plasmid bibliotek omdannet til en haploid gærstamme af parring type α ved hjælp af en høj overførselshastighed gær transformation protokol, hvor hver brønd af en 96-brønd plade indeholder gær omdannet med et bestemt bibliotek plasmid. Denne samling af transformerede gær er gemt som en glycerol bestand, der kan blive optøet og genoplivet til brug senere. Gær model af interesse i denne sag FUS toksicitet, skal oprettes i en haploid gærstamme med den modsatte parring type (parring type en). I en høj overførselshastighed måde ved hjælp af steril 96-pin replikatorer, er FUS stamme og gærstammer indeholdende plasmid bibliotek overført til 96-brønd plader der indeholder rige medier og tilladt at mate. Efter parring, en lille mængde fra hver godt af parring kultur er overført til 96-brønd plader der indeholder syntetiske frafald medier i hvilken kun diploide gær, der indeholder både FUS og bibliotek gener kan vokse. En robot spotting maskine bruges derefter til at overføre gær kultur fra hver brønd på agar plader hvor udtryk for FUS og bibliotek gener er induceret.  Derudover er gær kultur plettet for at styre agar plader hvor FUS og bibliotek gener ikke er angivet. Efter vækst på agar plader, vil blive identificeret gener, der redde eller forværre FUS toksicitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Protokollen beskrevet her er designet til screening bibliotek plasmider indeholdt i 10 96-brønd plader men kan skaleres op eller ned i overensstemmelse hermed. Protokollen skal gentages for at fuldføre hele biblioteket screening. Normalt, kan screening mod 10 plader af bibliotek gener hver gang håndteres komfortabelt af 1 person.

1. forberedelse til 96-brønd gær Transformation

Bemærk: Dette trin er gjort som tidligere beskrevet7,10.

  1. Alikvot 5 µL (ca 50 – 100 ng) af plasmid DNA fra en klædt plasmid bibliotek i hvert hul i en runde-96-brønd bundplade.
    Bemærk: Et eksempel på sådan et bibliotek ville være en gær gen overekspression bibliotek10.
  2. Podes 150 mL af gær pepton dextrose (YPD) medier i en 500 mL målekolbe med en koloni (2-3 mm i diameter) af haploide gærstamme W303α. Inkuber dem natten over ved 30 ° C under omrystning (200 rpm).
  3. Den følgende morgen, måle OD600 overnight kultur og fortyndes gær kultur til OD600 = 0,1 i (op til) 2 L af YPD. Inkuber det ved 30 ° C under omrystning (200 rpm) i ~ 5 h, indtil kulturen når OD600 = 0,4-0,6.

2. gær Transformation

  1. Høst gær kultur ved at udfylde 8 sterile 250 mL centrifugeres flasker og centrifugering dem ved stuetemperatur på 3.000 x g i 10 min. Hæld supernatanten uden at forstyrre pelleten.
    Bemærk: Udfør alle centrifugering trin ved stuetemperatur.
  2. Vask gær med sterilt destilleret H2O. For dette, tilsættes 100 mL af sterile H2O til hver centrifuge flaske og vortex at resuspenderes celle. Kombinere de vaskede celler til 2 flasker og centrifugeres dem på 3.000 x g i 5 min. Hæld supernatanten.
  3. Vaske cellerne i hver flaske i 100 mL af 0,1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc; 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) og centrifugeres dem ved 3.000 x g i 5 min. Hæld off supernatanten.
  4. Mens centrifugering, koges 5 mL af laks sæd DNA (10 mg/mL) ved 100 ° C ved hjælp af en blok varmelegeme i 3 min og derefter afkøles det på is.
  5. Resuspenderes celle i 25 mL af 0,1 M LiOAc/1XTE i hver flaske, kombinere de resuspenderede celler og overføre dem til en 150 mL kolbe. Der tilsættes 5 mL af den pre kølet laks sæd DNA og der inkuberes ved 30 ° C under omrystning (225 rpm) i 30 min.
  6. Hæld celle blandingen i et sterilt engangs reagens reservoir, og ved hjælp af en multikanalpipette, overføre 35 µL af celle blandingen til hver brønd af runde-96-brønd bundplade indeholdende bibliotek plasmid DNA. Vortex 96-brønd plader ved hjælp af en plade vortexer for 1 min ved 1000 rpm. Inkuber plader i 30 min. ved 30 ° C uden rystelser.
    Bemærk: Ikke stable pladerne, så varmen kan overføre mere effektivt. Vi har konstateret at vortexing 96 brønde plader ved 1000 rpm forårsager ikke væske løber ud af brøndene, men en sikker vortex hastighed bør testes, før du udfører trinnet.
  7. I en kolbe, forberede 200 mL af den transformation buffer indeholdende en endelig koncentration på 40% PEG3350, 10% DMSO og 0,1 M LiOAc. Forberede transformation bufferen umiddelbart før brug og bland det grundigt ved omrystning.
  8. Fjern 96-brønd plader fra 30 ° C inkubator og bland dem for 30 s ved 1.000 omdrejninger i minuttet ved hjælp af plade vortexer. Tilføj 125 µL af transformation bufferen til hver brønd og derefter vortex plader til 1 min ved 1000 rpm.
  9. Inkuber plader ved 30 ° C i 30 min og derefter varme chok gær ved at placere pladerne i en 42 ° C inkubator for 15 min.
    Bemærk: Ikke stable pladerne.
  10. Der centrifugeres plader i 5 min på 3.000 x g. Fjerne transformation bufferen fra brøndene ved invertere pladerne over en affald bin og kraftigt dumping buffer fra pladerne. Hurtigt duppes de inverterede plader på en ren køkkenrulle til at fjerne væske på toppen af pladerne.
  11. Skyl cellerne ved at tilføje plader 200 µL af minimalt frafald medium svarende til den valgbar markør på biblioteket plasmid.
    Bemærk: Vi brugte en syntetisk Ura-medium.
  12. Centrifugeres plader i 5 min på 3.000 x g og Fjern supernatanten over en affald bin som i trin 2.10.
  13. Tilføje 160 µL af minimal Ura-medium indeholdende 2% glukose. Vortex plader til 1 min ved 1000 rpm og inkuberes dem ved 30 ° C for 48 h uden rystelser. Efter 48 h, Bemærk at pellet transformerede gær er synlige nederst i hver brønd.
  14. Ved hjælp af en flydende dispenser, tilføje 100 µL af Ura-medier indeholdende glucose i hver brønd af et nyt sæt af 96-brønd plader.
  15. Vortex plader der indeholder den transformerede gær (fra trin 2.13) ved 1000 rpm for 30 s. ved hjælp af et sterilt plastik 96-pin replicator, læg benene i brøndene indeholdende den transformerede gær og derefter podes dem ind i de tilsvarende wells af de nye plader fyldt med medier. Inkuber de nye plader ved 30 ° C i 24 timer.
    Bemærk: Hvis arbejder med 10 plader, medium kan også udleveres manuelt ved hjælp af multi-kanal pipetter.
  16. Efter 24 timer, skal en pellet gær være synlig i bunden af hver brønd indeholder med held omdannes gær. For at gemme disse gærstammer som glycerol bestande, tilsæt 50 µL af 50% glycerol til hver brønd, vortex plader til 30 s ved 1000 rpm, forsegle pladerne med forseglingstape og fryse dem ved-80 ° C.
    Bemærk: Ovenstående trin skal kun udføres én gang. Fremtidige screeninger for forskellige gær modeller mod samme bibliotek engangs reagens reservoiret kan starte fra glycerol bestande og fortsætte umiddelbart fra nedenstående trin.

3. parring mellem celler, der indeholder gener, bibliotek og forespørgsel gær

  1. For at genoplive bibliotek stammer fra glycerol lager, skal du tage 96-brønd plader ud af-80 ° C fryser, Fjern forsegling tape, og lad gæren tø op ved stuetemperatur i ca 30 min.
  2. Når gæren har optøet, bruge et sterilt plastik 96-pin replicator til podes glycerol bestande til 160 µL af frisk Ura-medier indeholdende 2% glukose i 96-brønd plader og inkuberes dem ved 30 ° C til 24 h. umiddelbart efter bibliotek stammer anvendes , forsegle pladerne med forseglingstape, og returnere dem til-80 ° C fryser.
  3. Samme dag bibliotek stammer (W303α) er optøet, podes forespørgsel gærstamme (her, FUS i W303a) til 50 mL af YPD og dyrke det natten over ved 30 ° C under omrystning ved 250 omdrejninger i minuttet.
  4. Den næste morgen, hæld forespørgsel gærstamme til et sterilt engangs reagens reservoir og alikvot 160 µL af forespørgsel stamme til hver brønd med en 96-brønd plade ved hjælp af en multikanalpipette.
  5. Ved hjælp af de flydende dispenser, dispensere 160 µL af YPD medier i hver brønd for 10 96-brønd plader. Brug disse plader senere til parring forespørgsel gærstamme med biblioteket gær.
  6. Kort vortex 96-brønd pladen som indeholder forespørgslen stamme og derefter bruge en steril 96-pin replicator til at overføre forespørgslen stamme YPD plader.
  7. Kort vortex biblioteket stamme plader, og for hver bibliotek stamme plade, brug en ny steril 96-pin replicator overførsel bibliotek stammer til YPD pladerne, der har været podet med forespørgsel stamme.
    Bemærk: Celler i glycerol mister deres levedygtighed efter flere tø-freeze cyklusser. Returnere bibliotek stammer til langtidsopbevaring (-80 ° C fryser) hurtigst muligt vil holde biblioteket i god kvalitet, og klar til fremtidig brug. Korrekt vedligeholdt, kan glycerol materiel være frosset og optøet mindst 10 gange. Vi anbefaler også, at holde en arbejdskopi og sikkerhedskopier af glycerol lager. Når arbejde materiel ikke virker, straks foretage en ny arbejder kopi fra sikkerhedskopien.
  8. Inkuber YPD plader ved 30 ° C til 24 h. Bemærk at en pellet af gær vil være synlig i bunden af hver brønd efter 24 timer.
  9. Fyld 96-brønd plader med en minimal frafald medium indeholdende 2% raffinose, svarende til de valgbare markører på plasmidet i forespørgslen stamme og på biblioteket plasmid (fxher Ura - hans-).
  10. Bruge en steril 96-pin replicator til at overføre gær fra YPD parring kulturer til selektiv medierne. Inkuber 96-brønd plader ved 30 ° C for 48 h; kun gær celler, der har parret og dannede diploid celler og derfor indeholder både forespørgsel plasmidet og bibliotek plasmid vil være i stand til at vokse i dette medie. Efter 2 dage, observere, en pellet er synlige på bunden af brøndene.

4. spotting Assay

  1. Efter 48 h af vækst i raffinose-holdige selektiv medierne, spot gær på agar plader.
    1. Forberede 2 sæt af Ura-hans-dropout plader der indeholder 2% agar bruger klar polystyren plader, én indeholdende 2% galactose og andre indeholdende 2% glukose.
    2. Vortex 96-brønd plader til 1 min ved 1000 rpm, derefter spot gær Ura-hans-dropout plader der indeholder 2% galactose og 2% agar (FUS og bibliotek gener er induceret) og Ura-hans-dropout plader der indeholder 2% glukose og 2% agar (FUS og bibliotek gener undertrykt) ved hjælp af en robot spotting maskine, hvormed kulturen i hver godt er spottet på agar plader i fire eksemplarer (dvs, kulturen i 1 godt er spottet til 4 steder på agar plade).
    3. Efter spotting, lade agar plader tørre, og derefter placere dem op og ned i en 30 ° C inkubator. Fotografere agar plader hver 24 timer, til at optage en hurtigere/mere gær vækst som toksiciteten for forespørgslen stamme er reddet eller optage en langsommere/mindre vækst toksiciteten for forespørgslen stammen forværres. Inkuber pladerne i 4 dage.
      Bemærk: Kultur i hver godt kan blive opdaget på agar plader 1-til-1, som vist i en tidligere transformation-baseret metode10. Men, 1-til-4 spotting her (som kan indstilles bekvemt op ved hjælp af robot spotting maskinen) øger robustheden af analysen ved at reducere antallet af falske positiver. Positive hits betragtes kun når alle 4 kolonier fra samme godt vise et lignende fænotype.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ALS-forbundet protein FUS, en RNA/DNA bindende protein, var tidligere studeret i haploide gær7,8. Genetisk screening ved hjælp af metoden transformation-baserede opdaget flere gær gener, der undertrykker FUS toksicitet. Den menneskelige homolog en af gær gener blev senere vist sig for at være effektiv til at undertrykke toksicitet i en primær neuronal celle og rotte model af ALS13. Her, vi bruger den samme gær model for at vise at overekspression bibliotek screening kan udføres af parring så effektivt som ved omdannelse.

FUS er giftigt for både haploide og diploide gærceller
Den tidligere gær model af FUS og efterfølgende overekspression bibliotek screening blev udført i den haploide cellebaggrund. For den parring-baseret metode til at arbejde, skal FUS toksicitet påvises i diploide gær. For at gøre dette, vi parret FUS gær model i w303a (parring type en) med w303α forvandlet med en tom vektor (parring type α). Som angivet i figur 2, selv om ikke så stærk som i haploide gær, er FUS toksicitet tydelig i diploide gær.

Undertrykkelse gener tidligere identificerede arbejde i diploide gær
Som et bevis for princip for parring-baseret metode, vi har testet fem gener tidligere identificerede fra den transformation-baseret metode. Parring blev brugt til at indføre hver af de fem gener i den haploide gær model af FUS (i W303a), og deres evne til at redde FUS toksicitet i den efterfølgende diploide gær blev testet (W303a/α). Som vist i figur 3, redde alle fem gener FUS toksicitet i diploide gær, der angiver, at metoden parring var effektiv.

En pilot screening af 940 gener (klædt på 10 96-brønd plader)
Efter de protokoller, der er beskrevet ovenfor, anvendte vi den parring-baseret metode til en overekspression bibliotek screening af 940 gener. Figur 4 viser et billede af en repræsentativ plade. Som angivet på højre side af figur (FUS og bibliotek gener udtrykt), var FUS giftige for diploide gær. Bibliotek genet angivet af den grønne firkant reddet FUS toksicitet, mens angivet med den røde firkant øget toksicitet.

Figure 1
Figur 1 : Diagram for screening gær modeller af protein toksicitet ved hjælp af parring. Et plasmid bibliotek (under for GAL1 som er yderst induceret i overværelse af galaktose kontrol) er omdannet til en haploid gærstamme (MATα) ved hjælp af en høj overførselshastighed transformation protokol. Denne samling af gær, transformeret med biblioteket plasmider, gemmes som en glycerol bestand ved-80 ° C, og er genoplivet, når det er nødvendigt at parre sig med den haploide gær model af protein toksicitet (i vores tilfælde, en kopi af FUS integreret i HIS3 locus, GAL1 promotor MATa). Diploide gær indeholdende bibliotek plasmid og giftigt protein (FUS) vælges og spottet til glukose (FUS og bibliotek gen 'off') og galactose (FUS og bibliotek gen 'on') agar plader. Væksten af gær blev fulgt for at identificere gener, der redde eller forværre FUS toksicitet. Den grønne firkant angiver et eksempel på en suppressor gen, der redder FUS toksicitet, og den røde firkant angiver et eksempel på et forstærker-gen, der forværrer FUS toksicitet når overexpressed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : FUS er giftigt for både haploide og diploide gærceller. Haploide gær (w303 MATa) transformeret med pRS303Gal1-FUS var enten forvandlet med en tom plasmid eller parret med gær af den modsatte parring type (w303 MATα) transformeret med det samme tomme plasmid til at generere en diploide gærstamme. Disse gærstammer sammen med en kontrol stamme blev derefter 5 x seriefremstillede fortyndet (fra venstre til højre) og plettede Ura-hans-Glucose medium (venstre, FUS udtryk undertrykt) og Ura-hans-Galactose medium (højre, FUS udtryk induceret). Billedet blev taget efter 2 dage af vækst på 30 ° C. Næsten identiske vækst af den haploide og diploide kontrol stamme blev observeret, så kun den haploide kontrol stamme blev vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 : Fem gær gener (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, og VHR1) redde FUS toksicitet gennem parring-baseret metode. Plasmider, der indeholder tidligere identificerede gær gener, der undertrykker FUS toksicitet blev omdannet til en haploid gærstamme (w303 MATα). Disse gær blev så parret med haploide gær i den modsatte parring type (w303 MATa) transformeret med en FUS udtryk plasmid. Diploide gær indeholdende FUS og enten en tom vektor eller en af de fem undertrykkelse gener var valgte og plettede i replikater på agar plader der indeholder glucose (gener 'off') og galactose (gener 'on'). (1) viser en kontrol gærstamme omdannet med to tomme vektorer. (2) viser den diploide FUS gærstamme med en tom vektor hvor udtryk for FUS er meget giftige. (3 – 7) Vis diploide gær udtrykker FUS samt en undertrykkelse gen, der kan redde FUS toksicitet. Hvert nummer (1-7) viser to rækker af tolv identiske replikater. Det billede, der repræsenterer tre uafhængige forsøg, blev taget efter 3 dage af vækst på 30 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Library screening for gener, der redde eller forværre FUS toksicitet. Haploide gær indeholdende FUS blev parret med haploide gær indeholdende bibliotek gener. Efter parring, blev diploide celler, der indeholder både FUS og et bibliotek gen valgt og derefter spottet til glukose (FUS og bibliotek gener 'off') og galactose agar plader (FUS og bibliotek gener 'on') i fire eksemplarer. På galactose plade, som kom til udtryk FUS og bibliotek gen, var de fleste af gær ude af stand til at vokse godt. Dette indikerer at FUS er giftige, og de fleste bibliotek gener var ude af stand til at redde toksicitet. Den grønne firkant viser et eksempel på et bibliotek-genet, der undertrykker FUS toksicitet og giver mulighed for gær til form kolonier. Den røde firkant angiver et eksempel på et bibliotek-genet, der forværrer FUS toksicitet. Pladerne vist her er repræsentant for 10 plader af bibliotek gener, der var afskærmet mod. Billedet blev taget efter 3 dage af vækst på 30 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her, beskriver vi en protokol for at udføre en plasmid overekspression skærm i gær ved hjælp af parring for at indføre plasmid bibliotek i gær model. Brug denne fremgangsmåde, kan flere gær modeller for neurodegenerative sygdomme protein toksicitet screenes ved hjælp af den samme samling af gær transformeret med plasmidet bibliotek. Den besværlige proces transformation skal kun udføres én gang, efter hvilke højeffektive gær parring bruges til at indføre plasmid bibliotek i forespørgslen stamme. Denne protokol er afhængig af brugen af robot udstyr at give afkald på medier og spot gær kulturer på agar plader. Mens protokollen kan udføres uden brug af robot udstyr, vil det være mere tidskrævende. Denne metode blev brugt til at screene for gener, der kan ændre FUS toksicitet.

Vi observerede, at FUS er lidt mindre giftige i diploide gær baggrund. Dette er mest sandsynligt på grund af genet kopi nummer og forskelle i vækst i diploide gær. Medmindre fænotype, der er undersøgt er parring type eller Ploidi-afhængige, vækst Fænotypen af toksicitet er konsekvent i haploide og diploide gær. Derfor forventes den parring-baseret metode at arbejde bredt i mange gær modeller af forskellige vækst fænotyper. Ikke desto mindre bør Fænotypen af gær model kontrolleres for at sikre, at det er stadig til stede i den diploide baggrund før denne screeningsmetoden udføres. Denne metode kan bruges til at studere mange forskellige fænotyper i gær og er ikke begrænset til undersøgelse af neurodegenerative protein toksicitet. Derudover kan eventuelle plasmid bibliotek indeholdende gær udtryk vektorer bruges.

Efter udførelse af skærmen, er der en række kontrol-assays, der vil hjælpe med at sikre de identificerede hits er specifikke for den gær model at blive screenet. Smagsforstærkere af toksicitet bør testes i gær uden Co udtrykker sygdom protein af interesse. Smagsforstærkere forårsager toksicitet uafhængig af sygdom protein af interesse bør fjernes fra yderligere undersøgelse. Det er vigtigt at overveje, hvorvidt undertrykkere af toksicitet påvirker udtryk for sygdom protein ved at påvirke Gal1 promotor. Enhver overspændingsbeskyttere påvirker udtryk fra Gal1 initiativtageren bør fjernes fra yderligere undersøgelse.

Gærstammer indeholdende bibliotek plasmid gemmes permanent på glycerol lager og hurtigt kan genoplives, når nødvendigt, så metoden parring-baseret let kan anvendes til andre gær modeller, hvor de samme bibliotek gener skal være Afskærmet mod. Effektiviteten af metoden parring-baserede bliver indlysende, når den samme type af screening bruges til at fjerne falske positiver, eller når flere forskellige gær modeller skal undersøges. Vi har med succes brugt denne metode til at screene en gær model af TDP-43, et andet protein knyttet til ALS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for de tankevækkende drøftelser med medlemmer af Ju laboratorium og Zhong laboratorium, og den finansielle støtte fra Wright State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
salmon Sperm DNA (SS-DNA) Sigma-Aldrich   D1626
YPD broth Research Products International (RPI) Y20090
Granulated Agar Fisher Sci BP97445
D-(+)-Glucose Research Products International (RPI) G32040
D-(+)-Galactose Research Products International (RPI) G33000
D-(+)-Raffinose Pentahydrate Research Products International (RPI) R20500
Ammonium Sulfate Fisher Sci A702-500
Synthetic Ura- drop out medium Clontech 630416
Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil Clontech 630422
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate Research Products International (RPI) Y20060
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Sci S67496
Lithium acetate, anhydrous Fisher Sci AC268640010
Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) Spectrum Chemical  PO125-12KG
96 Pin Replicator  Scinomix SCI-5010-OS
Nunc OmniTray Thermo Sci 140156
Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid Fisher Sci 07-200-760 non-treated, sterile
Eppendorf Research plus Multichannel Pipette Eppendorf TI13690052 30-300ul volume
Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters Fisher Sci 88-860-023
Eppendorf MixMate Eppendorf 21-379-00
Eppendorf 5810R Centrifuge Fisher Sci 05-413-112
Avanti J-26 XPI Centrifuge Beckman 393127
MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser BioTek
Rotor HDA   Singer Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
  2. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
  3. Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
  4. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
  5. Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
  6. Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
  7. Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
  8. Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
  9. Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
  10. Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
  11. Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
  12. Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
  13. Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
  14. Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).

Tags

Genetik sag 137 gær parring høj overførselshastighed overdrevne udtryk screening neurodegeneration protein misfoldning
Parring-baserede overekspression bibliotek Screening i gær
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hayden, E., Chen, S., Chumley, A.,… More

Hayden, E., Chen, S., Chumley, A., Zhong, Q., Ju, S. Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast. J. Vis. Exp. (137), e57978, doi:10.3791/57978 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter