Summary
Dit artikel presenteert een paring gebaseerde methode om overexpressie screening in ontluikende gist met behulp van een gekleed plasmide-bibliotheek.
Abstract
Ontluikende gist is wijd verbeid gebruikt als een model in het bestuderen van eiwitten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens. Genoom-brede genetische screening is een krachtig hulpmiddel gebruikte gist studies. De expressie van een aantal neurodegeneratieve ziekte-geassocieerde eiwitten in gist zorgt ervoor dat de cytotoxiciteit en statistische vorming, Recapitulerend bevindingen gezien bij patiënten met deze aandoeningen. Hier beschrijven we een methode voor het screenen van een model van de gist van de Amyotrofische laterale sclerose-geassocieerde proteïne FUS voor parameters van de toxiciteit. In plaats van transformatie, berust dit nieuwe platform voor screening op de paring van de gist te introduceren een gekleed bibliotheek van plasmiden in het model van de gist. De paring methode kent twee duidelijke voordelen: ten eerste, het is uiterst efficiënt; Ten tweede, de vooraf getransformeerde gekleed bibliotheek van plasmiden kan worden opgeslagen voor de lange termijn als een voorraad van glycerol en snel toegepast op andere schermen zonder de arbeidsintensieve stap van transformatie naar het model van de gist telkens. We laten zien hoe deze methode kan met succes worden gebruikt aan het scherm voor de genen die de toxiciteit van FUS wijzigen.
Introduction
De ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae heeft wijd gebruikt in fundamenteel wetenschappelijk onderzoek1 om te begrijpen van de cellulaire processen rechtstreeks verband houdt met ziekten bij de mens. Bovendien, het is gebruikt als een modelorganisme bestuderen van menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten, zoals die in verband met de meest voorkomende neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington en Amyotrofische Laterale sclerose (ALS)2. Een voordeel van de gist-model is het gemak waarmee een genoom-brede scherm kan worden uitgevoerd om te identificeren van cellulaire routes in verband met de toxiciteit van ziekte-gerelateerde eiwitten, waardoor inzicht in het mechanisme van hun toxiciteit. Één dergelijke scherm heet een overexpressie bibliotheek scherm, waarin elk van de 5.500 gist genen in een gekleed bibliotheek is omgevormd tot een model van de gist om te identificeren welke genen toxiciteit wanneer overexpressie kunnen wijzigen. Deze screeningmethode is succesvol toegepast in de modellen van de gist van meerdere neurodegeneratieve ziekte-geassocieerde eiwitten, met inbegrip van huntingtin voor de ziekte van Huntington3, α-synuclein voor de ziekte van Parkinson4,5 , Aβ voor Alzheimer's disease6, FUS en TDP-43 voor ALS7,8,9. Terwijl het gebeurt meestal in een high-throughput wijze10, is de meest arbeidsintensieve stap van het scherm afzonderlijk 5.500 gist genen uit een gekleed bibliotheek transformeren. Deze stap moet worden uitgevoerd telkens wanneer die de screening wordt herhaald, en wanneer een nieuw opgerichte gist-model moet worden bestudeerd. Het is belangrijk om te vinden van een meer efficiënte manier om deze taak te volbrengen.
Gistcellen kunnen stabiel in zowel haploïde en diploïde vormen bestaan. Er zijn twee tegenover paring soorten haploïde cellen, paring type een en α. haploïde cellen van elke paring Typ produceren en afscheiden van hun eigen specifieke paring feromoon, waarop alleen de tegenovergestelde paring type cellen reageren. Hierdoor wordt de paring tussen een en α cellen tot stabiele diploïde cellen, een/α. Dit proces is spontaan en hoogefficiënte11. We kunnen profiteren van deze unieke levenscyclus van S. cerevisiae in te voeren van de plasmide-bibliotheek. Meer in het bijzonder, zal elk gen in de gekleed plasmide-bibliotheek worden omgezet in haploïde cellen van één paring type, dat wil zeggen, α-cel. Deze cellen met de genen van de bibliotheek zal dan in glycerol voorraad in een gekleed 96-Wells-indeling worden opgeslagen. Voor elk gist-model dat moet worden onderzocht, kunnen gistcellen die de bibliotheek genen bevatten worden ontdooid uit de voorraad van glycerol en de screening kan worden gedaan door de paring met het model van de gist van belang in het tegenovergestelde paring type, dat wil zeggen, paring type een. Dit idee van het gebruik van de paring aan het samenbrengen van twee genen in gist is niet nieuw. Het is met succes toegepast in de gist van de high-throughput screening van de twee-hybride, in die een aas bouwen (dat wil zeggen, Gal4-DNA-bindende domein fusies) in één paring type is samengebracht door paring met een prooi construct uit een gekleed bibliotheek 12. deze strategie heeft echter nooit zijn toegepast in overexpressie bibliotheek vertoningen, die altijd gebruik van traditionele transformatie methoden gemaakt hebben.
Ons laboratorium gevestigd eerder een model van de gist van de ALS-geassocieerde proteïne FUS7. Door overexpressie bibliotheek screening met de transformatie methode ontdekten we vijf gist genen(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1en VHR1) die het redden van de toxiciteit van FUS wanneer overexpressie. Deze bevindingen werden onafhankelijk van elkaar met een gelijkaardige studie bevestigd door een andere groep8. hUPF1, een menselijke homolog van ECM32, werd later aan het onderdrukken van de toxiciteit in primaire neuronale cellen13 en in een diermodel van ALS14 ook aangetoond. Met behulp van deze vijf genen als bewijs van beginsel, we laten zien dat alle vijf genen ook FUS toxiciteit redden, wanneer zij worden binnengebracht in het model van de gist FUS door paring. Omdat gistcellen met de genen van de bibliotheek kunnen worden permanent in glycerol voorraad opgeslagen en nieuw leven ingeblazen wanneer nodig, zal deze paring gebaseerde methode de tijdrovende stap van transformatie telkens die de bibliotheek worden gescreend moet tegen verwijderen. Omdat de paring is zeer efficiënt met geen plasmide transformatie betrokken, vermindert deze strategie ook aanzienlijk de kosten in verband met reiniging en transformatie van een grote plasmide-bibliotheek. We zullen met succes deze methode toepassen op een bibliotheek screening tegen gist model van FUS.
De procedure voor paring gebaseerde screening wordt kort beschreven in Figuur 1. In eerste instantie is de gekleed plasmide-bibliotheek omgevormd tot een haploïde giststam van het type α met een hoge gegevensdoorvoer gist transformatie protocol waarin elk putje van een 96-wells-plaat gist getransformeerd met een specifieke bibliotheek plasmide bevat paring. Deze collectie van getransformeerde gist wordt opgeslagen als een glycerol voorraad die kan worden ontdooid en nieuw leven ingeblazen voor gebruik later. Het model van de gist van belang, in dit geval FUS toxiciteit, moet worden gegenereerd in een haploïde giststam met de tegenovergestelde paring type (type paring een). In een high-throughput wijze met behulp van steriele 96-pins replicators, zijn de FUS stam giststammen met de bibliotheek van de plasmide overgedragen aan 96-wells-platen met rijke media en kunnen van de stuurman. Na de paring, een klein volume van elk putje van de paring cultuur wordt overgedragen aan 96-wells-platen met synthetische dropout media in welke alleen diploïde gist met zowel de FUS en bibliotheek genen kunnen groeien. Een robotic spotten machine wordt vervolgens gebruikt voor het overzetten van gist cultuur van elk putje op agar platen waar de uitdrukking van FUS en de genen van de bibliotheek wordt geïnduceerd. Bovendien is gist cultuur gespot om agar platen waar FUS en de bibliotheek genen niet worden uitgedrukt. Na groei op agar platen, genen die redden of verergeren FUS toxiciteit worden geïdentificeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: De hier beschreven protocol is ontworpen voor het screenen van bibliotheek plasmiden vervat in tien 96-wells-platen maar kunnen worden geschaald omhoog of omlaag dienovereenkomstig. Het protocol moet worden herhaald om te voltooien van de hele bibliotheek screening. Gewoonlijk, kan screening tegen 10 platen van bibliotheek genen telkens comfortabel worden behandeld door 1 persoon.
1. voorbereiding van de 96-Wells gist transformatie
Opmerking: Deze stap wordt gedaan als eerder beschreven7,10.
- Aliquot 5 µL (ongeveer 50 – 100 ng) van plasmide DNA uit een mediawisselaar gekleed plasmide in ieder putje van een ronde bodem 96-wells-plaat.
Opmerking: Een voorbeeld van een dergelijke bibliotheek zou een gist gene overexpressie bibliotheek10. - Gist-pepton dextrose (YPD) media in een maatkolf van 500 mL met een kolonie (2 – 3 mm doorsnede) van het haploïde giststam W303α 150 mL beënten. Incubeer ze 's nachts bij 30 ° C met schudden (200 rpm).
- De volgende ochtend, meten de OD600 van de overnachting cultuur en verdunnen van de cultuur van de gist tot OD600 = 0.1 in (maximaal) 2 L van YPD. Incubeer bij 30 ° C met schudden (200 rpm) voor ~ 5 h tot de cultuur OD600 bereikt = 0,4-0,6.
2. gist transformatie
- Oogst de cultuur van de gist door 8 steriele 250 mL centrifuge flessen vullen en centrifugeren hen bij kamertemperatuur bij 3000 x g gedurende 10 min. Giet af de bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren.
Opmerking: Voer alle centrifugeren stappen uit bij kamertemperatuur. - Wassen van de gist met steriele-gedistilleerd H2O. Hiervoor Voeg 100 mL steriele H2O aan elke centrifuge fles en vortex te resuspendeer de pellet cel. De gewassen cellen combineren tot 2 flessen en centrifuge hen bij 3000 x g gedurende 5 min. af het supernatant giet.
- Wassen van de cellen in elke fles in 100 mL 0,1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc; 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) en centrifugeer ze bij 3000 x g gedurende 5 min. Pour uit het supernatant.
- Tijdens het centrifugeren, kook 5 mL zalm sperma DNA (10 mg/mL) bij 100 ° C, met behulp van een blok kachel voor 3 min en vervolgens afkoelen in de ijskast.
- Resuspendeer de pellet cel in 25 mL 0,1 M LiOAc/1XTE in elke fles, combineren de geresuspendeerde cellen en hen overbrengen in een maatkolf van 150 mL. Voeg 5 mL van de vooraf afgekoelde zalm zaadcellen DNA en na het bebroeden bij 30 ° C met schudden (225 rpm) voor 30 min.
- Giet het mengsel van de cel in een steriele wegwerp reagens reservoir en 35 µL van het mengsel van de cel met behulp van een meerkanaalspipet, overdragen aan elk putje van de ronde onderkant 96-wells-plaat met de bibliotheek plasmide DNA. Vortex de 96-wells-platen met behulp van een plaat-vortexer voor 1 min bij 1000 omwentelingen per minuut. Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij 30 ° C zonder schudden.
Opmerking: Niet stapelen de platen, zodat de warmte efficiënter kunt overbrengen. We hebben ontdekt dat vortexing de 96-wells-platen op 1000 rpm veroorzaakt geen vloeistof te morsen uit de putten, maar een veilige vortex snelheid moet worden getest voordat u de stap uitvoert. - Bereiden in een maatkolf van 200 mL van de buffer van de transformatie met een eindconcentratie van 40% PEG3350, 10% DMSO en 0,1 M LiOAc. Voorbereiden van de transformatie buffer onmiddellijk vóór gebruik en meng het door schudden.
- Verwijderen 96-wells-platen van de 30 ° C incubator en meng ze voor 30 s 1000 rpm met behulp van de vortexer van de plaat. 125 µL van de buffer van de transformatie op toevoegen aan elk goed en vervolgens de vortex de platen voor 1 min 1000 rpm.
- Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 30 minuten en dan het verwarmen van schok de gist door het plaatsen van de platen in een incubator 42 ° C gedurende 15 minuten.
Opmerking: Niet stapelen de platen. - De platen gedurende 5 minuten op 3000 x gcentrifugeren. De buffer van de transformatie uit de putten verwijderen door het omkeren van de platen over een prullenbak en krachtig dumping de buffer van de platen. Snel wissen de omgekeerde platen op een schone papieren handdoek te verwijderen van een vloeistof op de bovenkant van de platen.
- Spoel de cellen door toe te voegen aan de platen 200 µL van het minimale uitval middellange overeenkomen met selecteerbare markering op de bibliotheek plasmide.
Opmerking: We gebruikt een synthetische Ura-medium. - De platen gedurende 5 minuten op 3000 x g centrifugeren en verwijder de bovendrijvende substantie over een prullenbak zoals in stap 2.10.
- Voeg 160 µL van minimale Ura-medium met 2% glucose. Vortex de platen voor 1 min op 1000 rpm en hen bij 30 ° C gedurende 48 h zonder schudden uit te broeden. Na 48u, rekening mee dat een pellet van getransformeerde gist zichtbaar aan de onderkant van elk putje.
- Met behulp van een vloeistof dispenser, voeg 100 µL van Ura-media bevatten glucose in ieder putje van een nieuwe reeks van 96-wells-platen.
- Vortex de platen met de getransformeerde gist (uit stap 2.13) bij 1000 t/min voor 30 s. met behulp van een steriele kunststof 96-pins replicator, plaatst u de pinnen in de putjes met de getransformeerde gist en enten ze vervolgens in de overeenkomstige putten van de nieuwe platen gevuld met media. Incubeer de nieuwe platen bij 30 ° C gedurende 24 uur.
Opmerking: Als u werkt met 10 platen, het medium kan ook achterwege worden gelaten handmatig met behulp van meerkanaals pipetten. - Na 24 h, moet een pellet van gist zichtbaar zijn in de bodem van elk putje met succes getransformeerd gist. Als u wilt deze giststammen opslaan als glycerol voorraden, voeg 50 µL 50% glycerol aan elk putje, vortex de platen voor 30 s bij 1.000 tpm, verzegelen van de platen met tape afdichten en bevriezen ze bij-80 ° C.
Opmerking: De bovenstaande stappen moeten slechts eenmaal worden uitgevoerd. Toekomstige voorstellingen van verschillende gist modellen tegen het dezelfde bibliotheek wegwerp reagens reservoir te beginnen uit de voorraden van glycerol en gaan onmiddellijk uit de onderstaande stappen.
3. paring tussen cellen met bibliotheek genen en Query gist
- Nemen om te blazen de bibliotheek stammen uit de voorraad van glycerol, de 96-wells-platen uit de vriezer-80 ° C, verwijderen de afdichtende tape, en laat de gist bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 30 minuten ontdooien.
- Zodra de gist heeft ontdooid, gebruikmaken van een steriele kunststof 96-pins replicator te enten van de voorraden van glycerol 160 µL van verse Ura-media met 2% glucose in 96-wells-platen en hen uit te broeden bij 30 ° C gedurende 24 h. onmiddellijk nadat de bibliotheek stammen worden gebruikt , verzegelen van de platen met tape afdichten, en deze terugsturen naar de vriezer-80 ° C.
- Op dezelfde dag de bibliotheek stammen (W303α) zijn ontdooid, enten de query giststam (hier, FUS in W303a) aan 50 mL YPD en 's nachts groeien bij 30 ° C met het schudden van 250 toeren per minuut.
- De volgende ochtend giet de query giststam een steriele wegwerp reagens reservoir en aliquoot 160 µL van de stam van de query aan elk putje van een 96-wells-plaat met een meerkanaalspipet.
- Met behulp van de vloeistof dispenser, afzien 160 µL van YPD media in elk putje van tien 96-wells-platen. Deze platen later gebruiken voor paring van de query giststam met de gist van de bibliotheek.
- Kort vortex de 96-wells-plaat met de stam van de query en vervolgens gebruik een steriele 96-pins replicator overdracht van de query op de platen van de YPD stam.
- Kort vortex de bibliotheek stam platen en, voor elke bibliotheek stam plaat, gebruikmaken van een nieuwe steriele 96-pins replicator overbrengen van de stammen van de bibliotheek naar de YPD platen die hebben zijn geënt met de query-stam.
Opmerking: Cellen in glycerol verliezen hun levensvatbaarheid na meerdere dooi-freeze cycli. Terugkeer van de stammen van de bibliotheek naar de langetermijnopslag (diepvriezer-80 ° C) zo spoedig mogelijk zal houden van de bibliotheek in goede kwaliteit, en klaar voor toekomstig gebruik. Goed onderhouden, kan de voorraad glycerol worden bevroren en ontdooid ten minste 10 keer. Wij raden het ook houden van een werkend exemplaar en back-ups van de voorraad van glycerol. Wanneer de voorraad werken niet werkt, onmiddellijk werken maken een nieuwe kopie van de back-up. - Incubeer de platen van de YPD bij 30 ° C gedurende 24 h. opmerking dat een pellet van gist zichtbaar in de bodem van elk putje na 24 h zijn zal.
- Opvulling 96-wells-platen met een minimale uitval medium met 2% raffinose, overeenkomt met de selecteerbare merkers op het plasmide in de query-stam en de bibliotheek plasmide (bijvoorbeeldhier Ura - zijn-).
- Gebruikmaken van een steriele 96-pins replicator gist van de YPD paring culturen aan de selectieve media overzetten. Incubeer de 96-wells-platen bij 30 ° C gedurende 48 h; alleen gist cellen die hebben gekruist en gevormde diploïde cellen en dus zowel het query-plasmide bevatten en de bibliotheek plasmide zullen kunnen groeien in deze media. Na 2 dagen, constateren dat een pellet zichtbaar aan de onderkant van de putten.
4. spotten Assay
-
Na 48u van groei in de raffinose-bevattende selectieve media, ter plaatse de gist op agar platen.
- Bereiden van 2 sets van Ura-zijne-dropout platen met 2% agar met behulp van duidelijke polystyreen platen, één met 2% galactose en de andere met 2% glucose.
- Vortex de 96-wells-platen voor 1 min bij 1000 omwentelingen per minuut, dan ter plaatse de gist aan de Ura-zijne-dropout platen met 2% galactose en 2% agar (FUS en bibliotheek genen worden veroorzaakt) en aan de Ura-zijne-dropout platen met 2% glucose en 2% agar (FUS en bibliotheek genen onderdrukt) met behulp van een robot spotten machine, waardoor de cultuur in elk goed is bevlekt op de platen van de agar in viervoud (dat wil zeggen, de cultuur in 1 goed is gespot op 4 plekken op de agarplaat).
- Na het spotten van, laat de agar platen droog en plaats ze vervolgens ondersteboven in een 30 ° C incubator. Foto de agar platen elke 24 uur opnemen van een snellere/meer gist groei waarin de toxiciteit voor de query stam wordt gered of om een trager/minder groei waarin de toxiciteit voor de query stam wordt verergerd. Incubeer de platen gedurende 4 dagen.
Opmerking: De cultuur in elk goed kan worden gespot op agar platen 1-op-1, zoals in een vorige transformatie gebaseerde methode10. Echter, de 1-tot-4 hier spotten (die kan worden gemakshalve ingesteld met de robotic spotten machine) aanzienlijk verhoogt de robuustheid van de bepaling door het verminderen van het aantal valse positieven. Positieve hits zijn alleen overwogen wanneer alle 4 kolonies van hetzelfde goed Toon een soortgelijke fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ALS-geassocieerde proteïne FUS, een RNA/DNA-bindend-proteïne, was eerder studeerde in haploïde gist7,8. Genetische screening met de transformatie gebaseerde methode ontdekt verschillende gist genen die FUS toxiciteit onderdrukken. De menselijke homolog van één van de genen van gist werd later aangetoond te worden effectief in het onderdrukken van de toxiciteit in een primaire neuronale cel en rat model ALS13. Hier, gebruiken we het dezelfde gist-model om te laten zien dat overexpressie bibliotheek screening door de paring zo effectief kan worden uitgevoerd door de transformatie.
FUS is giftig voor beide haploïde en diploïde gistcellen
Het vorige model van de gist van FUS en latere overexpressie bibliotheek screening werd uitgevoerd in de haploïde celachtergrond. De paring gebaseerde methode werkt, dient FUS toxiciteit te worden aangetoond in diploïde gist. Om dit te doen, gekruist we de FUS gist model in w303a (type paring een) met w303α getransformeerd met een lege vector (paring type α). Zoals aangegeven in Figuur 2, hoewel niet zo sterk als in de haploïde gist, FUS toxiciteit uit diploïde gist blijkt.
Onderdrukking genen geïdentificeerd eerder werk in diploïde gist
Als een bewijs van beginsel voor de paring gebaseerde methode, we de vijf genen eerder aangeduid van de transformatie gebaseerde methode getest. Paring werd gebruikt om elk van de vijf genen in het haploïde gist model van FUS (in W303a), en hun vermogen om te redden van de toxiciteit van FUS in de daaropvolgende diploïde gist werd getest (W303a/α). Zoals blijkt uit Figuur 3, redden alle vijf genen de toxiciteit van FUS in diploïde gist, die aangeeft dat de paring methode werkzaam was.
Een pilot screening van 940 genen (gekleed op tien 96-wells-platen)
Na de hierboven beschreven protocollen, we op een overexpressie bibliotheek screening van 940 genen de paring gebaseerde methode toegepast. Figuur 4 geeft een beeld van een representatieve plaat. Zoals aangegeven op de rechterkant van de figuur (FUS en bibliotheek genen uitgedrukt), werd FUS vergiftig voor in het diploïde gist. Het gen van de bibliotheek aangegeven door het groene vierkant gered FUS toxiciteit terwijl dat aangegeven door het Rode plein verbeterd toxiciteit.
Figuur 1 : Diagram voor het screenen van gist modellen van eiwit toxiciteit met behulp van paring. Een plasmide-bibliotheek (onder controle van de GAL1-promotor die zeer wordt geïnduceerd in aanwezigheid van galactose) wordt omgezet in een haploïde giststam (MATα) met een hoge gegevensdoorvoer transformatie-protocol. Deze collectie van gist, getransformeerd met de bibliotheek plasmiden, wordt opgeslagen als een glycerol voorraad bij-80 ° C, en wanneer dat nodig is om te paren met het haploïde gist model van eiwit toxiciteit (in ons geval, een kopie van FUS geïntegreerd in het HIS3 locus, promotor van de GAL1 nieuw leven wordt ingeblazen MATa). Diploïde gist met de bibliotheek plasmide en de giftige proteïne (FUS) worden geselecteerd en gespot in glucose (FUS en bibliotheek gene 'uit') en galactose (FUS en bibliotheek gene 'on') agar platen. De groei van de gist volgde ter identificatie van genen die redden of verergeren van de toxiciteit van FUS. Het groene vierkant geeft een voorbeeld van een suppressor gen dat FUS toxiciteit redt en het rode vierkantje geeft een voorbeeld van een versterker-gen dat de FUS toxiciteit verergert wanneer overexpressie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : FUS is giftig voor beide haploïde en diploïde gistcellen. Haploïde gist (w303 MATa) getransformeerd met pRS303Gal1-FUS werden getransformeerd met een lege plasmide of gekruist met gist van het tegenovergestelde type van paring (w303 MATα) getransformeerd met de dezelfde lege plasmide voor het genereren van een diploïde giststam. Deze giststammen samen met een controlestam werden vervolgens 5 x serieel verdunde (van links naar rechts) en gevlekte Ura-zijne-Glucose medium (links, FUS expressie onderdrukt) en Ura-zijne-Galactose medium (rechts, FUS expressie geïnduceerde). De foto werd genomen na 2 dagen van de groei bij 30 ° C. Bijna identieke groei van het haploïde en diploïde controlestam werd waargenomen, zodat alleen dat de haploïde controlestam werd getoond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Vijf gist genen(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1en VHR1) redden FUS toxiciteit door de paring gebaseerde methode. Plasmiden met eerder geïdentificeerde gist genen die FUS toxiciteit onderdrukken werden omgevormd tot een haploïde giststam (w303 MATα). Deze gist waren dan gekruist met haploïde gist van het tegenovergestelde type van paring (w303 MATa) getransformeerd met een FUS expressie plasmide. Diploïde gist met FUS en een lege vector- of één van de vijf genen van de onderdrukking was geselecteerde en gevlekte in wordt gerepliceerd op agar platen met glucose (genen 'uit') en galactose (genen 'aan'). (1) toont een besturingselement giststam getransformeerd met twee lege vectoren. (2) toont de diploïde FUS giststam met een lege vector waar de uitdrukking van FUS zeer giftig is. (3-7) Toon diploïde gist uiten FUS evenals een onderdrukking-gen dat FUS toxiciteit kan redden. Elk cijfer (1-7) toont twee rijen van twaalf identiek wordt gerepliceerd. Het beeld, vertegenwoordigen drie onafhankelijke experimenten, werd genomen na 3 dagen van de groei bij 30 ° C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Bibliotheek screening voor genen die redden of verergeren FUS toxiciteit. Haploïde gist met FUS werd gekruist met haploïde gist die de bibliotheek genen bevatten. Na de paring, waren diploïde cellen met zowel FUS en een bibliotheek-gen geselecteerd en vervolgens gespot in glucose (FUS en bibliotheek genen 'uit') en galactose agar platen (FUS en bibliotheek genen 'aan') in viervoud. Op de plaat galactose, in die FUS en het bibliotheek-gen werden uitgedrukt, konden de meeste van de gist niet goed groeien. Dit betekent dat FUS giftig is en meeste genen van de bibliotheek niet konden redden van toxiciteit. Het groene vierkant toont een voorbeeld van een bibliotheek-gen dat onderdrukt van FUS toxiciteit en laat de gist naar formulier koloniën. Het rode vierkantje geeft een voorbeeld van een bibliotheek-gen dat FUS toxiciteit verergert. De hier getoonde platen zijn representatief voor 10 platen van bibliotheek genen die waren gescreend tegen. De foto werd genomen na 3 dagen van de groei bij 30 ° C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van een plasmide overexpressie scherm in gist met paring te introduceren de plasmide-bibliotheek in het model van de gist. Met behulp van deze aanpak, kunnen meerdere gist modellen van neurodegeneratieve ziekte eiwit toxiciteit worden gescreend met behulp van dezelfde collectie van gist getransformeerd met een plasmide-bibliotheek. Het moeizame proces van transformatie hoeft alleen te worden uitgevoerd zodra, na welke hoogefficiënte gist paring wordt gebruikt om de plasmide-bibliotheek in de stam van de query. Dit protocol is afhankelijk van het gebruik van robotachtige uitrusting af te zien van media en spot gist culturen op agar platen. Terwijl het protocol kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van robotachtige uitrusting, zal het meer tijd in beslag. Deze methode werd met succes gebruikt om het scherm voor de genen die de toxiciteit van FUS kunt wijzigen.
We hebben vastgesteld dat FUS iets minder giftig in de achtergrond diploïde gist is. Dit is waarschijnlijk te wijten aan gene exemplaaraantal en verschillen in het groeitempo op jaarbasis van diploïde gist. Tenzij het fenotype dat wordt bestudeerd is paring type of ploïdie-afhankelijk, het fenotype van de groei van de toxiciteit in haploïde en diploïde gist strookt. Hierdoor wordt de paring gebaseerde methode verwacht wijd om in te werken veel gist modellen van verschillende fenotypes van de groei. Het fenotype van de gist-model moet echter worden geverifieerd om ervoor te zorgen dat er nog steeds aanwezig in de diploïde achtergrond voordat deze screeningmethode wordt uitgevoerd. Deze methode kan worden gebruikt voor het bestuderen van vele verschillende fenotypes in gist en is niet beperkt tot de studie van neurodegeneratieve eiwit toxiciteit. Daarnaast kunnen een plasmide bibliotheek met gist expressievectoren worden gebruikt.
Na het uitvoeren van het scherm, zijn er een aantal verificatie-testen die ertoe bijdragen dat de geïdentificeerde hits zijn specifiek voor het model van de gist vertoond. De versterkers van toxiciteit moeten worden beproefd in gist zonder mede uiting van de ziekte proteïne van belang. Versterkers veroorzaakt toxiciteit onafhankelijk is van de ziekte proteïne van belang moeten worden geëlimineerd uit verdere studie. Het is belangrijk om te overwegen of de suppressors voor toxiciteit expressie van het eiwit van de ziekte beïnvloeden door het beïnvloeden van de promotor van de Gal1. Elke suppressors op het gebied van expressie van de promotor van de Gal1 moeten worden geëlimineerd uit verdere studie.
Giststammen met de bibliotheek-plasmide worden permanent opgeslagen in glycerol voorraad en kunnen snel herleven wanneer nodig zodat de paring gebaseerde methode kan eenvoudig worden toegepast op andere gist modellen waarin de dezelfde bibliotheek-genen worden gescreend moeten tegen. De efficiëntie van de paring gebaseerde methode wordt duidelijk wanneer het hetzelfde type van screening wordt gebruikt om valse positieven of wanneer meerdere verschillende gist modellen moeten worden bestudeerd. We hebben met succes gebruikt deze methode om het scherm van een model van de gist van TDP-43, een ander eiwit gekoppeld aan ALS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de nadenkende gesprekken met leden van het Ju-laboratorium en Zhong laboratorium, en de financiële steun van de Wright State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
