Summary
מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.
Abstract
ניצני שמרים כבר בשימוש נרחב כמודל בלימוד חלבונים הקשורים עם מחלות אנושיות. בדיקה גנטית הגנום כולו הוא כלי רב עוצמה נפוץ במחקרים שמרים. הביטוי של מספר חלבונים הקשורים למחלות ניווניות של שמרים גורם cytotoxicity ויצירת צבירה, recapitulating ממצאים לראות בחולים עם הפרעות אלה. כאן, אנו מתארים שיטה לסינון מודל שמרים של הקשורים נוירודגנרטיביות החלבון FUS מודיפיקטורי שלה רעילות. במקום להשתמש טרנספורמציה, הפלטפורמה ההקרנה הזאת מסתמכת על הזדווגות של שמרים להציג ספריה ערוכים של פלסמידים לתוך המודל שמרים. שיטת החיזור יש שני יתרונות ברורים: ראשית, זה יעיל ביותר; שנית, הספרייה ערוכים מראש טרנספורמציה של פלסמידים ניתן לאחסן לטווח ארוך כמו מניה גליצרול, ויישם במהירות למסכי אחרים ללא השלב מהגידולים של טרנספורמציה לתוך המודל שמרים בכל פעם. נדגים כיצד שיטה זו בהצלחה ניתן להשתמש עבור גנים המשנים הרעילות של FUS מסך.
Introduction
שמרים ניצני האפייה כבר בשימוש נרחב כדי להבין תהליכים תאיים הקשורים ישירות מחלות אנושיות מחקר מדעי בסיסי1 . יתר על כן, הוא שימש כאורגניזם מודל עבור לומד האדם הקשורים למחלה חלבונים, כגון אלה קשורה מחלות ניווניות הנפוצים ביותר, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, מחלת ניוון שרירים טרשת נפוצה לרוחב (ALS)2. יתרון של המודל שמרים היא הקלות שבה ניתן לבצע מסך הגנום כולו כדי לזהות הסלולר מסלולים הקשורים הרעילות של חלבונים הקשורים למחלות, ובכך נותן תובנה מנגנון הרעילות שלהם. מסך אחד כזה נקרא מסך ספריה של ביטוי, שבו כל אחד הגנים שמרים 5,500 בספריה ערוכים הופכת מודל שמרים לזהות אילו גנים יכולים לשנות רעילות כאשר overexpressed. שיטה זו הקרנה יושם בהצלחה במודלים שמרים מרובות ניווניות הקשורות למחלות חלבונים, כולל huntingtin של מחלת הנטינגטון3, α-synuclein עבור מחלת פרקינסון4,5 , Aβ עבור מחלת אלצהיימר6, ואת FUS TDP-43 ALS-7,-8,-9. בזמן זה נעשה בדרך כלל באופן תפוקה גבוהה10, השלב הכי מהגידולים של המסך בנפרד משתנה 5,500 גנים שמרים מספריה ערוכים. שלב זה חייב להתבצע בכל פעם שחוזר על עצמו ההקרנה, בכל פעם דוגמנית שהוקם שמרים צריך להילמד. חשוב למצוא דרך יעילה יותר כדי לבצע משימה זו.
תאי שמרים יכולה להתקיים stably בצורות הפלואידי והן דיפלואידי. ישנם שני מול ההזדווגות סוגים של תאים הפלואידי, הזדווגות סוג α. תאים הפלואידי של כל הזדווגות הקלד התוצרת, מפרישות פרומון ההזדווגות משלהם ספציפי, אשר מגיבים רק מול ההזדווגות סוג התאים. דבר זה מאפשר הזדווגות בין α תאים כדי לייצר תאים דיפלואידי יציב, / α. תהליך זה הוא ספונטני ויעיל מאוד11. אנחנו יכולים לנצל את מחזור החיים הייחודי של cerevisiae ס כדי להציג את ספריית פלסמיד. ליתר דיוק, כל הגן בספריה פלסמיד ערוכים תעבור טרנספורמציה לתוך תאים הפלואידי של סוג ההזדווגות אחד, דהיינו, α התא. אלה תאים המכילים את הגנים ספריית ואז יאוחסנו במלאי גליצרול בתבנית 96-ובכן ערוכים. עבור כל דגם שמרים צריך להיות מוקרן, תאי שמרים המכיל את הגנים ספריה יכולה להיות הקרת מן המלאי גליצרול ולאחר ההקרנה יכול להיעשות באמצעות הזדווגות עם המודל שמרים עניין בסוג השני ההזדווגות, כלומר, סוג ההזדווגות. הרעיון של שימוש ההזדווגות כדי להפגיש את שני גנים לתוך שמרים אינו חדש. זה יושם בהצלחה בשמרים תפוקה גבוהה ההקרנה שני-היברידית, שבו פיתיון לבנות (קרי, Gal4-הדי-איגוד תחום fusions) בסוג אחד ההזדווגות הוא הביא יחד באמצעות הזדווגות עם מבנה טרף מספריה ערוכים 12. אולם, אסטרטגיה זו מעולם לא הוחל ב ביטוי בספריה הקרנות, אשר תמיד השתמשו בשיטות מסורתיות טרנספורמציה.
המעבדה שלנו הקימה בעבר מודל שמרים של חלבונים הקשורים ALS FUS7. דרך ביטוי בספריה ההקרנה בשיטת טרנספורמציה גילינו חמש שמרים הגנים (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, ו VHR1) להציל את רעילות FUS כאשר overexpressed. ממצאים אלה שאושרו באופן עצמאי עם מחקר דומה על-ידי קבוצה אחרת8. hUPF1, homolog האנושית של ECM32, הוצגה מאוחר יותר לדכא את רעילות ראשי תאים עצביים13 , במודל חיה של ALS14 גם כן. באמצעות גנים חמש אלה כהוכחה עקרון, נדגים כי כל הגנים 5 בדומה להציל FUS רעילות כאשר הם יוכנסו המודל שמרים FUS על ידי הזדווגות. כיוון שמרים תאים המכילים את הגנים הספרייה יכולים להיות מאוחסנים לצמיתות במלאי גליצרול לתחייה בכל פעם שיש צורך, שיטה זו מבוססת על הזדווגות יסיר את הצעד גוזלת זמן של שינוי בכל פעם שהספרייה צריך להיות מוקרן נגד. מאז ההזדווגות היא יעילה במיוחד עם שינוי פלסמיד לא מעורב, אסטרטגיה זו פוחתת משמעותי גם את העלות המשויכת לטיהור ושינוי של ספרייה פלסמיד גדול. אנחנו יחולו בהצלחה בשיטה זו לספריית הקרנה נגד שמרים מודל של FUS.
התהליך להקרנה ההזדווגות מבוסס בקצרה מתואר באיור1. בתחילה, הספרייה פלסמיד ערוכים הופכת זן שמרים הפלואידי של הזדווגות מסוג α באמצעות פרוטוקול השינוי בתפוקה גבוהה שמרים שבו כל טוב של צלחת 96-ובכן מכיל שמרים טרנספורמציה עם פלסמיד ספריה ספציפית. זה אוסף של שמרים טרנספורמציה נשמרת מניה גליצרול כי ניתן הקרת לתחייה לשימוש מאוחר יותר. הדגם שמרים של עניין, רעילות FUS במקרה הזה, להפיקם בזן הפלואידי שמרים עם סוג ההזדווגות הנגדי (ההזדווגות סוג). באופן תפוקה גבוהה באמצעות המשכפלים 96 פינים סטרילי, הלחץ FUS ואת זני שמרים המכיל ספריית פלסמיד הועבר צלחות 96-ובכן המכיל מדיה עשירים, רשאי חבר. לאחר ההזדווגות, נפח קטן מכל טוב של התרבות ההזדווגות מועבר המכיל התקשורת הנשירה סינתטי אשר שמרים בלבד דיפלואידי המכיל שני FUS את הצלחות 96-ובכן, ספריית גנים יכולים לגדול. מכונת spotting רובוטית משמש לאחר מכן להעביר שמרים תרבות מכל קידוח על פלטות אגר שבו הביטוי FUS ואת הגנים ספריית מושרה. בנוסף, תרבות שמרים הוא הבחין לשלוט פלטות אגר איפה FUS ואת הגנים הספרייה אינם מבוטאים. בעקבות גידול על פלטות אגר, הגנים או להחריף FUS רעילות יזוהו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול המתוארים כאן מיועדת לסינון פלסמידים ספריית הכלול 10 צלחות 96-ובכן אבל וניתן לשנותם למעלה או למטה בהתאם. הפרוטוקול צריך לחזור כדי להשלים את ההקרנה כל ספריה. בדרך כלל, הקרנה נגד 10 צלחות של ספריית גנים בכל פעם ניתן לטפל בנוחות על ידי אדם אחד.
1. הכנה 96-ובכן שמרים טרנספורמציה
הערה: שלב זה מתבצע כמו בעבר תיאר7,10.
- Aliquot 5 µL (בערך 50 – 100 ng) של פלסמיד DNA מספריה פלסמיד ערוכים כל טוב של צלחת 96-ובכן סיבוב המדרגה.
הערה: דוגמה כזו ספרייה יהיה ספריית10ביטוי גנים שמרים. - לחסן 150 מ ל מדיה דקסטרוז (YPD) peptone שמרים בבקבוקון 500 מ"ל עם מושבה (2 – 3 מ מ קוטר) של המתח הפלואידי שמרים W303α. דגירה אותם בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות (200 סל ד).
- למחרת בבוקר, למדוד את יתר600 של התרבות לילה ו לדלל את תרבות שמרים OD600 = 0.1 ב (עד) 2 ל' של YPD. תקופת דגירה זה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות (200 סל ד) של ~ 5 h עד התרבות מגיע OD600 = 0.4-0.6.
2. שמרים טרנספורמציה
- קציר התרבות שמרים על ידי מילוי שמיניית צנטריפוגה סטרילי 250 מ ל ו צריך שתוציאו אותם בטמפרטורת החדר x 3000 g עבור 10 דקות יוצקים את תגובת שיקוע מבלי לשבש את פעולת בגדר.
הערה: לבצע את כל השלבים צנטריפוגה בטמפרטורת החדר. - לשטוף את השמרים עם סטרילי מזוקק H2O. בשביל זה, להוסיף 100 מ של סטרילי H2O כל בקבוק צנטריפוגה, מערבולת זה ל resuspend בגדר תא. לשלב את התאים שטף 2 בקבוקים ו צנטריפוגה אותם ב x 3000 g עבור 5 דק יוצקים את תגובת שיקוע.
- רוחצים את התאים כל בקבוק ב- 100 מ של 0.1 M LiOAc/1XTE (100 מ מ LiOAc; 10 מ מ. טריס, pH 8.0; 1 מ מ EDTA) את centrifuge אותם ב x 3000 g עבור 5 דק לשפוך את תגובת שיקוע.
- בזמן, צריך שתוציאו להרתיח 5 מ של זרע סלמון DNA (10 מ"ג/מ"ל) ב- 100 ° C באמצעות תנור בלוק במשך 3 דקות, ואז צנני את זה על קרח.
- Resuspend בגדר תא ב 25 מ של 0.1 M LiOAc/1XTE ב כל בקבוק, לשלב את התאים resuspended ולהעביר אותם אל בקבוק 150 מ. הוסף 5 מ של טרום מקורר הזרע סלמון DNA, דגירה זה ב 30 ° C עם טלטול (225 סל ד) למשך 30 דקות.
- שופכים את התערובת תא לתוך מאגר ריאגנט חד פעמי סטרילי, באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להעביר כל טוב של צלחת 96-ובכן עגול-התחתון המכיל את פלסמיד ספריית דנ א 35 µL של תערובת תא. מערבולת 96-ובכן צלחות באמצעות vortexer צלחת עבור 1 דקות ב- 1000 סל ד. דגירה הלוחות למשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד.
הערה: לא מחסנית הצלחות, אז החום ניתן להעביר בצורה יעילה יותר. מצאנו כי vortexing הצלחות 96-ובכן-1,000 סל ד אינו גורם נוזלי לשפוך החוצה הבארות, אך מהירות מערבולת בטוח צריך להיבדק לפני ביצוע השלב. - בבקבוקון, להכין 200 מ של המאגר טרנספורמציה המכילה ריכוז סופי של 40% PEG3350, דימתיל סולפוקסיד 10% ו- 0.1 M LiOAc. הכנת המאגר טרנספורמציה מיד לפני השימוש ומערבבים אותו ביסודיות ע י ניעור.
- הסר 96-ובכן הצלחות מן החממה של 30 מעלות צלזיוס ומערבבים אותם ל 30 s ב 1,000 סל ד באמצעות vortexer על צלחת. להוסיף µL 125 המאגר טרנספורמציה כל טוב ולאחר מכן מערבולת הלוחות עבור 1 דקות בכל 1,000 סל ד.
- דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וחום ואז הלם השמרים על-ידי הצבת הלוחות חממה 42 º C למשך 15 דקות.
הערה: לא מחסנית את הצלחות. - Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 3000 g. הסר המאגר טרנספורמציה מן הבארות על ידי היפוך הלוחות על פח אשפה ולזרוק בכוח המאגר של הלוחות. כתם במהירות את הצלחות הפוכה על מגבת נייר נקי כדי להסיר את כל נוזל על הצלחות.
- יש לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 200 הצלחות של הנשירה מינימלי בינונית המתאים דה מרקר לבחירה על פלסמיד הספרייה.
הערה: השתמשנו ההחלטיים סינתטי-בינוני. - Centrifuge הלוחות עבור 5 דקות ב x 3000 g ולהסיר את תגובת שיקוע על סל פסולת כמו שלב 2.10.
- הוסף µL 160 של מינימלי עורה-בינוני המכיל 2% גלוקוז. מערבולת הלוחות עבור 1 דקות ב- 1,000 סל ד דגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות מבלי לרעוד. לאחר 48 שעות, שימו לב כי גלולה של שמרים טרנספורמציה גלוי בחלק התחתון של כל טוב.
- בעזרת מתקן נוזלי, להוסיף 100 µL של עורה-מדיה המכילה גלוקוז לבאר כל סדרה חדשה של 96-ובכן צלחות.
- מערבולת הלוחות המכילים שמרים טרנספורמציה (מתוך שלב 2.13) ב- 1,000 סל ד ל 30 ס' באמצעות משכפל 96 פינים פלסטיק סטרילית, למקם את הסיכות הבארות המכילים שמרים טרנספורמציה, ואז לחסן אותם לתוך הבארות המקביל של הלוחות החדשים מלא מדיה. דגירה הלוחות חדש ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
הערה: אם עובד עם 10 צלחות, המדיום יכול גם ובשמפו באופן ידני באמצעות פיפטות רב ערוצית. - לאחר 24 שעות, גלולה של שמרים צריך להיות גלוי כל הבאר המכילים שמרים בהצלחה טרנספורמציה. לשמירת זנים אלו שמרים גליצרול מניות, להוסיף 50 µL של גליצרול 50% מכל קידוח, מערבולת הלוחות ל 30 s ב 1,000 סל ד, לאטום את הצלחות עם דבק סלוטייפ לסתימה ולהקפיא אותן ב- 80 ° C
הערה: השלבים לעיל רק צריך להתבצע פעם אחת. הקרנות עתידיים של מודלים שמרים שונים נגד המאגר ריאגנט חד פעמיים באותה ספריה ניתן להתחיל המניות גליצרול, פנה/י מיד מן השלבים שלהלן.
3. הזדווגות בין תאים המכילים גנים ספריית ושמרים שאילתה
- כדי להחיות את זני ספריית המלאי גליצרול, לקחת את הצלחות 96-ובכן מהמקפיא-80 ° C, הסר איטום הקלטת, ולתת השמרים להפשיר בטמפרטורת החדר במשך כ 30 דקות.
- ברגע השמרים יש הקרת, השתמש משכפל 96 פינים פלסטיק סטרילית כדי לחסן את מניות גליצרול µL 160 של טרי עורה-מדיה המכיל 2% גלוקוז ב 96-ובכן צלחות דגירה אותם ב 30 ° C עבור ה 24. מיד לאחר זנים ספריית משמשים , חותם את הצלחות עם דבק סלוטייפ לסתימה, ולהחזיר אותם במקפיא-80 ° C.
- באותו יום ספריה זנים (W303α) הם הקרת, לחסן את המתח שמרים שאילתה (כאן, FUS ב W303a) 50 מ של YPD לגדל אותו בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.
- למחרת בבוקר, שופכים את המתח שמרים שאילתה מאגר ריאגנט חד פעמי סטרילי, ולאחר aliquot µL 160 של המתח שאילתה כדי כל טוב של צלחת 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
- באמצעות מנפק נוזלי, לוותר על 160 µL של YPD מדיה לתוך כל טוב של עשר לוחות 96-ובכן. השתמש הצלחות האלה מאוחר יותר להזדווגות המתח שמרים שאילתה עם שמרים הספרייה.
- בקצרה מערבולת הצלחת 96-ובכן המכיל את המתח שאילתה ולאחר מכן להשתמש משכפל 96 פינים סטרילי כדי להעביר את השאילתה זן אל צלחות YPD.
- בקצרה מערבולת הספרייה זן צלחות ולהשתמש, עבור כל אחד מהלוחות זן בספריה, משכפל 96-pin חדש סטרילי כדי להעביר זנים ספריית הפלטות YPD שיש, כמובן עם המתח שאילתה.
הערה: תאים גליצרול לאבד את הכדאיות שלהם לאחר מספר מחזורים ההפשרה-להקפיא. מבוקש זנים ספריית אחסון לטווח ארוך (מקפיא-80 ° C) בהקדם האפשרי לשמור על הספריה באיכות טובה, ומוכנים לשימוש עתידי. מתוחזק כראוי, המניה גליצרול ניתן להיות קפוא, הקרת לפחות 10 פעמים. אנו גם ממליצים לשמור עותק לעבודה של עותקי גיבוי של המניה גליצרול. כאשר המניה עבודה לא עובד, מיד לעשות חדש עובד עותק מעותק הגיבוי. - דגירה הלוחות YPD ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה ה הערה כי גלולה של שמרים יהיה גלוי בחלק התחתון של כל טוב לאחר 24 שעות.
- מילוי 96-ובכן צלחות עם מדיום הנשירה מינימלי המכיל 2% raffinose, התואם את סמני לבחירה על פלסמיד בנימה זו שאילתה כמו גם על ספריית פלסמיד (למשל, כאן עורה - שלו-).
- השתמש משכפל 96 פינים סטרילי כדי להעביר שמרים YPD הזדווגות תרבויות בתקשורת סלקטיבי. דגירה הלוחות 96-ובכן ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות; רק תאים שיש הזדווגו שמרים דיפלואידי בנוי תאים, לכן, להכיל פלסמיד השאילתה את שני ו פלסמיד הספריה יוכלו לגדול מדיה זו. לאחר יומיים, להתבונן גלולה מוצגת בתחתית הבארות.
4. הבחינה Assay
-
לאחר 48 שעות של צמיחה בתקשורת סלקטיבי המכילים raffinose, במקום השמרים על פלטות אגר.
- להכין 2 סטים של צלחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% אגר באמצעות לוחות פוליסטירן ברור, אחד המכיל 2% גלקטוז והמכיל גלוקוזה 2% אחרים.
- מערבולת 96-ובכן לוחות עבור 1 דקות ב- 1,000 סל ד, ואז במקום השמרים את הצלחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% גלקטוז ו 2% אגר (גנים FUS וספריית הם המושרה) וכדי הלוחות עורה-שלו-נשירת המכיל 2% גלוקוז ו- 2% אגר (FUS וספריית גנים מודחק) באמצעות מכונת spotting רובוטית, לפיו התרבות בכל הוא מקום טוב על גבי הלוחות אגר ב ארבע פעמים (קרי, התרבות 1 הוא מקום טוב למקומות 4 בצלחת אגר).
- לאחר הבחינה, תן את הצלחות אגר יבש, ולאחר מכן למקם אותם במהופך בתוך חממה 30 מעלות צלזיוס. לצלם את הצלחות אגר כל 24 שעות לרשום צמיחה מהירה יותר או יותר שמרים שבו הוא חולץ רעילות לאמץ השאילתה או לרשום צמיחה איטית יותר/פחות שבו רעילות לאמץ השאילתה היא מתעצמת. תקופת דגירה לוחיות הרישוי של 4 ימים.
הערה: התרבות בכל טוב ניתן הבחין על פלטות אגר 1 ל-1, כפי שמוצג של שיטה המבוססת על השינוי הקודם10. עם זאת, את 1-4 אכון כאן (אשר ניתן להגדיר בנוחות לשימוש במכונה spotting רובוטית) מגביר באופן משמעותי את היציבות של וזמינותו על-ידי הפחתת מספר תוצאות חיוביות שגויות. כניסות חיוביות נחשבים רק כאשר כל המושבות 4 מאותו מראים הפנוטיפ דומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
החלבון ALS-הקשורים FUS, RNA/DNA מחייב חלבון, נחקרה בעבר שמרים הפלואידי7,8. השיטה מבוססת על שינוי גנטי. הסינון באמצעות גילו מספר גנים שמרים לדיכוי FUS רעילות. Homolog האנושית של אחד הגנים שמרים הודגם מאוחר יותר כדי להיות אפקטיבית שיתוק רעילות תאים עצביים הראשי ומודל עכברוש של ALS13. כאן, אנו משתמשים באותו דגם שמרים להראות כי ביטוי בספריה ההקרנה יכול להתבצע על ידי הזדווגות באופן יעיל על ידי שינוי.
FUS רעיל בשני תאי שמרים הפלואידי, דיפלואידי.
הדגם הקודם שמרים FUS, ביטוי עוקבות ספריית ההקרנה בוצעה על רקע תא הפלואידי. עבור פעולת ההזדווגות מבוססי לעבודה, רעילות FUS צריך להיות הפגינו שמרים דיפלואידי. כדי לעשות זאת, אנחנו הזדווגו המודל שמרים FUS ב- w303a (ההזדווגות סוג) עם w303α הפך עם וקטור ריק (ההזדווגות מסוג α). כפי שמעידה איור 2, אמנם לא כמו חזק כמו שמרים הפלואידי, FUS רעילות זו באה לידי ביטוי שמרים דיפלואידי.
דיכוי גנים זוהו בעבר עבודה שמרים דיפלואידי
מהווה הוכחה של עיקרון השיטה מבוססת על הזדווגות, בדקנו את הגנים חמש זוהו בעבר מן השיטה מבוססת על שינוי. ההזדווגות שימש כדי להציג כל אחד הגנים חמש לתוך מודל שמרים הפלואידי FUS (ב W303a), נבדקה יכולתם להציל את הרעילות של FUS ב שמרים דיפלואידי עוקבות (W303a/α). כפי שמוצג באיור3, כל הגנים חמש להציל את הרעילות של FUS ב שמרים דיפלואידי, המציין כי שיטת החיזור היה יעיל.
הקרנה פיילוט של 940 גנים (מופנים על צלחות 96-ובכן עשר)
בעקבות הפרוטוקולים שתוארו לעיל, אנו להחיל בשיטה ההזדווגות המבוססת על ההקרנה ספריה ביטוי של גנים 940. איור 4 מציג תמונה של לוח נציג אחד. כמצוין בצד ימין של הדמות (FUS וספריית גנים ביטוי), FUS היה רעיל שמרים דיפלואידי. הגן ספריית שצוין על-ידי הריבוע הירוק חולץ FUS רעילות בזמן זה שציין הכיכר האדומה משופרת רעילות.
איור 1 : תרשים לסינון שמרים מודלים של רעילות חלבון באמצעות הזדווגות. ספריה פלסמיד (תחת שליטה של האמרגן GAL1 אשר מאוד הנגרמת בנוכחות גלקטוז) הופכת זן שמרים הפלואידי (MATα) באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה תפוקה גבוהה. זה אוסף של שמרים, טרנספורמציה עם פלסמידים הספרייה, מאוחסן מניה גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס, הוא קם לתחייה בעת הצורך כדי להזדווג עם הדגם שמרים הפלואידי של חלבון רעילות (במקרה שלנו, עותק אחד של FUS משולב-מיקומה HIS3, יזם GAL1 מאטה). שמרים דיפלואידי המכיל את ספריית פלסמיד, חלבון רעיל (FUS) נבחרה, הבחין גלוקוז (ג'ין FUS וספריית 'off'), פלטות אגר גלקטוז (ג'ין FUS וספריית 'על'). צמיחת השמרים עקבו לזיהוי גנים להציל או להחריף הרעילות של FUS. ריבוע ירוק מציין לדוגמה של גנים משתיק קול שמצילה FUS רעילות, ומציין הכיכר האדומה הוא דוגמה ג'ין מעצם זה מחמיר רעילות FUS כאשר overexpressed. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : FUS רעיל בשני תאי שמרים הפלואידי, דיפלואידי. שמרים הפלואידי (w303 מאטה) הפך עם pRS303Gal1-FUS טרנספורמציה עם פלסמיד ריק או הזדווגה עם שמרים מסוג ההזדווגות הנגדי (w303 MATα) הפך עם פלסמיד ריק אותו כדי ליצור זן שמרים דיפלואידי. זנים אלו שמרים יחד עם זן הבקרה היו אז 5x באופן סדרתי מדולל (משמאל לימין) ו מנומר בינוני עורה-שלו-גלוקוז (מודחקים ביטוי שמאלה, FUS) ואת עורה-שלו-גלקטוז בינוני (מימין, ביטוי FUS המושרה). התמונה צולמה לאחר יומיים של צמיחה ב 30 º C. הצמיחה כמעט זהה של המתח הפלואידי ושליטה דיפלואידי נצפתה, אז רק שהמתח שליטה הפלואידי הוצגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : חמישה גנים שמרים (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, ו VHR1) להציל את רעילות FUS באמצעות השיטה מבוססת על הזדווגות. פלסמידים המכיל גנים שמרים שזוהה בעבר לדיכוי FUS רעילות הפכו זן שמרים הפלואידי (w303 MATα). היו אלה שמרים ואז הזדווגה עם שמרים הפלואידי של הסוג ההזדווגות הנגדי (w303 מאטה) הפך עם פלסמיד ביטוי FUS. שמרים דיפלואידי המכיל FUS וקטור ריק או באחד הגנים דיכוי חמש היה הנבחר, הבחין ב משכפל על פלטות אגר המכילה גלוקוז (גנים 'off'), גלקטוז (גנים 'על'). (1) מראה זן שמרים שליטה טרנספורמציה עם שני וקטורים ריק. (2) מציג את המתח שמרים FUS דיפלואידי עם וקטור ריק שבו הביטוי של FUS הוא רעיל מאוד. (3 – 7) מראים שמרים דיפלואידי לבטא FUS, כמו גם גן דיכוי כי ניתן להציל FUS רעילות. כל מספר (1-7) מראה שתי שורות 12 זהה משכפל. צולמה התמונה, המייצגים שלושה ניסויים עצמאית, לאחר שלושה ימים של צמיחה ב 30 º C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : ספריית ואיתור הגנים או להחריף FUS רעילות. שמרים הפלואידי המכיל FUS היה הזדווגו עם שמרים הפלואידי המכיל את הגנים הספרייה. לאחר ההזדווגות, דיפלואידי תאים המכילים FUS והן ספריית הגן נבחר, נצפה גלוקוז (גנים FUS וספריית 'off'), גלקטוז פלטות אגר (גנים FUS וספריית 'על') בארבע פעמים. בצלחת גלקטוז, שבו היו הביע FUS, את ספריית הגן, רוב השמרים הצליחו לגדול היטב. אפשרות זו מציינת כי FUS רעיל, רוב הגנים הספרייה לא הצליחו להציל את רעילות. ריבוע ירוק מדגים דוגמה של ספריית גן כי מעלימה FUS רעילות ומאפשרת את השמרים למושבות טופס. הכיכר האדומה מציינת דוגמה של ספריית גן כי מחריף FUS רעילות. הלוחות המוצגים כאן הם נציג של 10 צלחות של ספריית גנים אשר הוקרנו נגד. התמונה צולמה לאחר 3 ימים של צמיחה ב 30 º C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לבצע מסך ביטוי פלסמיד באמצעות הזדווגות כדי להציג את ספריית פלסמיד לתוך המודל שמרים שמרים. באמצעות גישה זו, מספר מודלים שמרים רעילות חלבון מחלות ניווניות יכולים להיות מוקרן באמצעות אוסף אותם שמרים טרנספורמציה עם ספרייה פלסמיד. תהליך מפרך של שינוי רק צריך להתבצע פעם אחת, לאחר שמרים יעילים ביותר אשר ההזדווגות משמשת להציג הספרייה פלסמיד לתוך המתח שאילתה. פרוטוקול זה מסתמכים על השימוש של הציוד רובוטית כדי לוותר על מדיה ותרבויות שמרים ספוט על פלטות אגר. בעוד הפרוטוקול יכול להתבצע ללא השימוש של ציוד רובוטית, זה יהיה זמן רב יותר. השיטה הזאת הייתה בהצלחה בשימוש עבור גנים יכולים לשנות הרעילות של FUS מסך.
הבחנו כי FUS הוא מעט פחות רעיל ברקע שמרים דיפלואידי. . זה ככל הנראה עקב מספר עותק הגן ואת הבדלי קצב צמיחה של שמרים דיפלואידי. אלא אם כן פנוטיפ זה נחקר הזדווגות סוג או פלואידיות-תלוי פנוטיפ צמיחה של הרעילות הוא עקבי שמרים הפלואידי, דיפלואידי. לכן, השיטה מבוססת על הזדווגות צפוי לעבוד נרחב בשלל דגמים שמרים של פנוטיפים שונים של צמיחה. בכל זאת, פנוטיפ של המודל שמרים צריך לאמת כדי לוודא כי זה עדיין נוכחים ברקע דיפלואידי לפני שיטה זו ההקרנה מבוצעת. בשיטה זו ניתן ללמוד רבות פנוטיפים שונים בשמרים, אינה מוגבלת המחקר רעילות חלבון ניווניות. בנוסף, ניתן להשתמש בכל וקטורים של פלסמיד ספריית ביטוי שמרים המכיל.
לאחר ביצוע המסך, ישנם מספר מבחני אימות אשר יסייעו להבטיח שהלהיטים שזוהו הן ספציפיות על הדגם שמרים מוקרן. משפרי רעילות צריך להיבדק ב שמרים מבלי להביע החלבון המחלה עניין משותף. מוצרי טיפוח טבעיים וגורם רעילות עצמאית של החלבון המחלה עניין צריכים להיות מסולקים מן לימוד נוסף. חשוב לקחת בחשבון אם מדכאי רעילות משפיעים על ביטוי של החלבון המחלה על ידי המשפיעים על האמרגן Gal1. כל מדכאי המשפיעים על ביטוי של האמרגן Gal1 צריכים להיות מסולקים מן לימוד נוסף.
זני שמרים המכיל את פלסמיד ספריית מאוחסנים לצמיתות במלאי גליצרול, ניתן לחדש במהירות בעת הצורך כך השיטה מבוססת על הזדווגות ניתן להחיל בקלות את דגמים אחרים שמרים שבו הגנים ספריית אותו צריך להיות מוקרן נגד. יעילות השיטה מבוססת על הזדווגות הופך להיות ברור כאשר אותו סוג של ההקרנה משמש כדי להסיר תוצאות חיוביות שגויות או כאשר מספר מודלים שונים שמרים צריך להילמד. אנחנו משתמשים בהצלחה בשיטה זו למסך דגם שמרים של TDP-43, חלבון אחר המקושר ALS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
. אנחנו אסירי תודה על הדיונים מתחשב עם חברי המעבדה Ju Zhong מעבדה, ואת התמיכה הכלכלית מטעם אוניברסיטת מצב רייט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
