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Genetics

सहवास आधारित खमीर में एक्सप्रेस पुस्तकालय स्क्रीनिंग

Published: July 6, 2018 doi: 10.3791/57978
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Wright State University

Summary

यह लेख एक संभोग आधारित विधि प्रस्तुत करने के लिए नवोदित खमीर में व्यक्त स्क्रीनिंग की सुविधा एक सरणी प्लाज्मिड पुस्तकालय का उपयोग कर ।

Abstract

नवोदित खमीर व्यापक रूप से मानव रोगों के साथ जुड़े प्रोटीन का अध्ययन में एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है । जीनोम-वाइड आनुवंशिक स्क्रीनिंग एक शक्तिशाली आमतौर पर खमीर अध्ययन में प्रयोग किया जाता उपकरण है । neurodegenerative रोग के एक नंबर की अभिव्यक्ति खमीर में प्रोटीन जुड़े cytotoxicity और समग्र गठन, recapitulating इन विकारों के साथ रोगियों में देखा निष्कर्षों का कारण बनता है । यहां, हम अपनी विषाक्तता के संशोधक के लिए पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस-जुड़े प्रोटीन FUS के एक खमीर मॉडल स्क्रीनिंग के लिए एक विधि का वर्णन । इसके बजाय परिवर्तन का उपयोग कर के, इस नए स्क्रीनिंग मंच खमीर के सहवास पर निर्भर करता है खमीर मॉडल में plasmids की एक सरणी पुस्तकालय परिचय । सहवास विधि में दो स्पष्ट लाभ हैं: पहला, यह अत्यधिक कुशल है; दूसरा, पूर्व plasmids की सरणी पुस्तकालय बदल एक ग्लिसरॉल शेयर के रूप में लंबी अवधि के लिए संग्रहीत किया जा सकता है, और जल्दी से श्रम के बिना अंय स्क्रीन पर लागू-खमीर मॉडल में परिवर्तन के गहन कदम हर बार । हम प्रदर्शन कैसे इस विधि सफलतापूर्वक जीन है कि FUS की विषाक्तता को संशोधित करने के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae व्यापक रूप से बुनियादी वैज्ञानिक अनुसंधान में प्रयोग किया गया है1 सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए सीधे मानव रोगों से संबंधित । इसके अलावा, यह मानव रोग से जुड़े प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है, ऐसे सबसे आम neurodegenerative रोगों से जुड़े लोगों के रूप में, अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, Huntington की बीमारी, और पेशीशोषी सहित पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS)2. खमीर मॉडल का एक लाभ के साथ आसानी से जो एक जीनोम के साथ व्यापक स्क्रीन को सेलुलर रास्ते रोग से संबंधित प्रोटीन की विषाक्तता से संबंधित पहचान प्रदर्शन किया जा सकता है, इस प्रकार उनके विषाक्तता के तंत्र में अंतर्दृष्टि दे रही है । ऐसा ही एक स्क्रीन एक एक्सप्रेस पुस्तकालय स्क्रीन, जिसमें एक सरणी पुस्तकालय में ५,५०० खमीर जीन के प्रत्येक एक खमीर मॉडल में तब्दील हो जाता है की पहचान करने के लिए जो जीन विषाक्तता को संशोधित कर सकते है जब व्यक्त की है । इस स्क्रीनिंग पद्धति को सफलतापूर्वक कई neurodegenerative रोग-संबद्ध प्रोटीन के खमीर मॉडल में लागू किया गया है, जिसमें Huntington के रोग के लिए huntingtin3, α-synuclein पार्किंसंस रोग के लिए4,5 , अल्जाइमर रोग के लिए Aβ6, और FUS और टीडीपी-४३ के लिए ALS7,8,9. हालांकि यह आमतौर पर एक उच्च प्रवाह तरीके10में किया जाता है, सबसे श्रम-स्क्रीन के गहन कदम व्यक्तिगत रूप से एक सरणी पुस्तकालय से ५,५०० खमीर जीन बदल रहा है । यह कदम हर बार स्क्रीनिंग दोहराया है प्रदर्शन किया जाना चाहिए, और जब भी एक नए स्थापित खमीर मॉडल का अध्ययन करने की जरूरत है । यह इस कार्य को पूरा करने के लिए एक अधिक कुशल तरीका खोजने के लिए महत्वपूर्ण है ।

खमीर कोशिकाओं अगुणित और द्विगुणित दोनों रूपों में छुरा मौजूद कर सकते हैं । अगुणित कोशिकाओं के दो विपरीत संभोग प्रकार हैं, संभोग प्रकार एक और α. अगुणित कोशिकाओं प्रत्येक संभोग प्रकार के उत्पादन और अपने स्वयं के विशिष्ट संभोग फेरोमोन, जो करने के लिए केवल विपरीत संभोग प्रकार कोशिकाओं का जवाब स्रावित । यह एक और α कोशिकाओं के बीच सहवास करने के लिए स्थिर द्विगुणित कोशिकाओं का उत्पादन की अनुमति देता है, एक/α । इस प्रक्रिया को सहज और अत्यधिक कुशल11है । प्लाज्मिड पुस्तकालय का परिचय देने के लिए हम एस cerevisiae के इस अनूठे जीवन चक्र का लाभ उठा सकते हैं । अधिक विशेष रूप से, सरणी प्लाज्मिड पुस्तकालय में प्रत्येक जीन एक संभोग प्रकार, यानी, α सेल के अगुणित कोशिकाओं में तब्दील हो जाएगा । पुस्तकालय जीन युक्त इन कोशिकाओं को तो ग्लिसरॉल स्टॉक में एक सरणी ९६-अच्छी तरह से प्रारूप में संग्रहीत किया जाएगा । प्रत्येक खमीर मॉडल है कि की जरूरत है के लिए जांच की, पुस्तकालय जीन युक्त खमीर कोशिकाओं ग्लिसरॉल स्टॉक से गल सकता है, और स्क्रीनिंग विपरीत संभोग प्रकार में ब्याज की खमीर मॉडल के साथ संभोग के माध्यम से किया जा सकता है, यानी, संभोग प्रकार एक । एक साथ खमीर में दो जीन लाने के लिए सहवास का उपयोग करने का यह विचार नया नहीं है. यह सफलतापूर्वक उच्च प्रवाह खमीर दो में लागू किया गया है संकर स्क्रीनिंग, जिसमें एक चारा का निर्माण (यानी, Gal4 डीएनए-एक संभोग प्रकार में बंधन डोमेन संलयन) एक शिकार के साथ सहवास के माध्यम से एक साथ लाया जाता है एक सरणी पुस्तकालय से निर्माण 12. हालांकि, इस रणनीति हमेशा पारंपरिक परिवर्तन तरीकों का इस्तेमाल किया है, जो व्यक्त पुस्तकालय की स्क्रीनिंग, में लागू नहीं किया गया है.

हमारी प्रयोगशाला पहले ALS के एक खमीर मॉडल-जुड़े प्रोटीन FUS7की स्थापना की । परिवर्तन विधि का उपयोग कर के माध्यम से व्यक्त पुस्तकालय स्क्रीनिंग हम पांच खमीर जीन की खोज (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, और VHR1) कि FUS के बचाव विषाक्तता जब व्यक्त । इन निष्कर्षों को स्वतंत्र रूप से एक और8समूह द्वारा एक समान अध्ययन के साथ पुष्टि की गई । hUPF1, ECM32के एक मानव homolog, बाद में प्राथमिक न्यूरॉन्स कोशिकाओं में विषाक्तता को दबाने के लिए दिखाया गया था13 और ALS के एक पशु मॉडल में14 के रूप में अच्छी तरह से. सिद्धांत के सबूत के रूप में इन पांच जीनों का प्रयोग, हम प्रदर्शित करता है कि सभी पांच जीन इसी तरह FUS विषाक्तता बचाव जब वे संभोग द्वारा FUS खमीर मॉडल में पेश कर रहे हैं । चूंकि खमीर पुस्तकालय जीन युक्त कोशिकाओं ग्लिसरॉल स्टॉक में स्थाई रूप से संग्रहीत किया जा सकता है और जब भी जरूरत पुनर्जीवित, इस संभोग आधारित विधि समय परिवर्तन की खपत कदम हर बार पुस्तकालय के खिलाफ जांच की जरूरत को हटा देंगे । संभोग के बाद से कोई प्लाज्मिड शामिल परिवर्तन के साथ अत्यधिक कुशल है, इस रणनीति भी काफी शोधन और एक बड़ी प्लाज्मिड पुस्तकालय के परिवर्तन के साथ जुड़े लागत कम हो जाती है । हम सफलतापूर्वक FUS के खमीर मॉडल के खिलाफ एक पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए इस पद्धति को लागू करेगा ।

संभोग के लिए प्रक्रिया आधारित स्क्रीनिंग संक्षेप में चित्रा 1में वर्णित है । शुरू में, सरणी प्लाज्मिड पुस्तकालय संभोग प्रकार के एक अगुणित खमीर तनाव में तब्दील हो जाता है α एक उच्च प्रवाह खमीर परिवर्तन प्रोटोकॉल जिसमें एक ९६ के एक अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुआं का उपयोग एक विशिष्ट पुस्तकालय प्लाज्मिड के साथ बदल खमीर शामिल हैं । रूपांतरित खमीर का यह संग्रह एक ग्लिसरॉल स्टॉक के रूप में सहेजा गया है जो बाद में उपयोग के लिए गल और पुनर्जीवित किया जा सकता है । ब्याज की खमीर मॉडल, इस मामले FUS विषाक्तता में, विपरीत संभोग प्रकार (संभोग प्रकार एक) के साथ एक अगुणित खमीर तनाव में उत्पंन किया जाना चाहिए । एक उच्च प्रवाह बाँझ ९६-पिन प्रतिकृतियों का उपयोग कर तरीके में, FUS तनाव और प्लाज्मिड पुस्तकालय युक्त खमीर उपभेदों ९६ के लिए स्थानांतरित कर रहे है अच्छी तरह से अमीर मीडिया युक्त प्लेटों और दोस्त को अनुमति दी । संभोग के बाद, संभोग संस्कृति का एक अच्छी तरह से एक छोटी सी मात्रा ९६ को हस्तांतरित-अच्छी तरह से सिंथेटिक dropout मीडिया जिसमें केवल द्विगुणित दोनों FUS और पुस्तकालय जीन युक्त खमीर विकसित कर सकते है युक्त प्लेट है । एक रोबोट खोलना मशीन तो प्रत्येक अच्छी तरह से जहां FUS की अभिव्यक्ति और पुस्तकालय जीन प्रेरित किया जाता है आगर प्लेटों पर से खमीर संस्कृति हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल होता है ।  इसके अतिरिक्त, खमीर संस्कृति जहां FUS और पुस्तकालय जीन व्यक्त नहीं कर रहे है प्लेटों आगार नियंत्रित करने के लिए देखा जाता है । आगर प्लेटों पर विकास के बाद, जीन है कि बचाव या ख़राब FUS विषाक्तता की पहचान की जाएगी ।

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल यहां वर्णित स्क्रीनिंग लाइब्रेरी plasmids के लिए डिज़ाइन किया गया है १० ९६-अच्छी तरह से प्लेट में निहित है, लेकिन ऊपर या नीचे तदनुसार बढ़ाया जा सकता है । पूरी लाइब्रेरी स्क्रीनिंग पूरी करने के लिए प्रोटोकॉल को दोहराया जाने की जरूरत है । आमतौर पर, पुस्तकालय जीन के 10 प्लेटों के खिलाफ स्क्रीनिंग हर बार आराम से 1 व्यक्ति द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है ।

1. ९६ के लिए तैयारी-अच्छी तरह से खमीर परिवर्तन

नोट: यह चरण पहले वर्णित7,10के रूप में किया जाता है ।

  1. Aliquot 5 µ l (के बारे में 50-100 एनजी) एक सरणी प्लाज्मिड पुस्तकालय से प्लाज्मिड डीएनए की एक अच्छी तरह से एक दौर के नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली ।
    नोट: इस तरह के एक पुस्तकालय का एक उदाहरण एक खमीर जीन एक्सप्रेस10पुस्तकालय होगा ।
  2. Inoculate १५० मिलीलीटर में खमीर peptone डेक्सट्रोज (YPD) मीडिया की एक ५०० मिलीलीटर कुप्पी में एक कॉलोनी (2 – 3 मिमी व्यास) के साथ अगुणित खमीर तनाव W303α । उन्हें मिलाते हुए (२०० rpm) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात गर्मी ।
  3. निंनलिखित सुबह, मापने रातोंरात संस्कृति के आयुध डिपो६०० और खमीर के आयुध डिपो को पतला६०० = ०.१ में (अप करने के लिए) 2 YPD के एल । यह 30 ° c में मिलाते हुए (२०० rpm) ~ 5 h के लिए जब तक संस्कृति आयुध डिपो६०० = 0.4-0.6 तक पहुंच के साथ मशीन ।

2. खमीर परिवर्तन

  1. 8 बाँझ २५० मिलीलीटर की बोतलें भरने और उन्हें कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ३,००० एक्स जी में केंद्रापसारक द्वारा खमीर संस्कृति फसल । गोली बाधित बिना supernatant बंद डालो ।
    नोट: कमरे के तापमान पर सभी केंद्रापसारक कदम बाहर ले ।
  2. खमीर बाँझ-आसुत एच2ओ के साथ धो लो । इसके लिए, प्रत्येक केंद्रापसारक बोतल और भंवर के लिए यह सेल गोली reसस्पेंड करने के लिए बाँझ एच2ओ के १०० मिलीलीटर जोड़ें । 2 बोतलों में धोया कोशिकाओं का मिश्रण है और उंहें 5 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक । बंद supernatant डालो ।
  3. 0.1 m LiOAc/1XTE (१०० mm LiOAc; 10 mm Tris, pH ८.०; 1 mm EDTA) के १०० मिलीलीटर में प्रत्येक बोतल में कोशिकाओं को धोएं और उन्हें 5 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक करें । बंद supernatant डालो ।
  4. जब केंद्रापसारक, सामन शुक्राणु डीएनए के 5 मिलीलीटर फोड़ा (10 मिलीग्राम/१०० डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए एक ब्लॉक हीटर का उपयोग कर और फिर यह बर्फ पर ठंडा ।
  5. प्रत्येक बोतल में 0.1 m LiOAc/1XTE के 25 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड, reसस्पैंड कोशिकाओं गठबंधन और एक १५० मिलीलीटर कुप्पी के लिए उन्हें हस्तांतरण । पूर्व ठंडा सामन शुक्राणु डीएनए के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 30 मिनट के लिए मिलाते (२२५ rpm) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर यह मशीन ।
  6. एक बाँझ प्रयोज्य एजेंट जलाशय में एक सेल मिश्रण डालो और, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, स्थानांतरण ३५ µ एल कक्ष मिश्रण के प्रत्येक अच्छी तरह से दौर के नीचे ९६-अच्छी तरह से पुस्तकालय प्लाज्मिड डीएनए युक्त थाली । भंवर ९६-अच्छी तरह से १,००० rpm पर 1 मिनट के लिए एक थाली भंवर का उपयोग कर प्लेटें । मिलाते हुए बिना 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्लेट्स की मशीन ।
    नोट: प्लेटों स्टैक नहीं है, तो गर्मी और अधिक कुशलता से स्थानांतरित कर सकते हैं । हमने पाया है कि ९६-१,००० rpm पर अच्छी तरह से प्लेटें तरल कारण कुओं से बाहर फैल नहीं है, लेकिन एक सुरक्षित भंवर गति कदम प्रदर्शन करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए ।
  7. एक कुप्पी में, ४०% PEG3350, 10% DMSO, और 0.1 m LiOAc के अंतिम एकाग्रता युक्त परिवर्तन बफर के २०० मिलीलीटर तैयार करते हैं । परिवर्तन बफर तुरंत प्रयोग करने से पहले तैयार है और यह मिलाते हुए अच्छी तरह से मिश्रण ।
  8. 30 डिग्री सेल्सियस मशीन से ९६-अच्छी तरह से प्लेटें निकालें और 30 एस के लिए १,००० rpm पर प्लेट भंवर का उपयोग कर मिश्रण । परिवर्तन बफर के १२५ µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से और फिर भंवर 1 मिनट के लिए १,००० rpm पर प्लेटें ।
  9. 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें और फिर गर्मी सदमे खमीर 15 मिनट के लिए एक ४२ डिग्री सेल्सियस मशीन में प्लेट रखकर ।
    नोट: प्लेट्स स्टैक नहीं करें ।
  10. ३,००० x gपर 5 मिनट के लिए प्लेटें केंद्रापसारक एक बेकार बिन पर प्लेटों औंधा और जबरदस्ती प्लेटों से बफर डंपिंग द्वारा कुओं से परिवर्तन बफर निकालें. जल्दी से एक साफ कागज तौलिया पर उल्टे प्लेटों दाग प्लेटों के शीर्ष पर किसी भी तरल को दूर करने के लिए ।
  11. प्लेटों को जोड़कर कुल्ला कोशिकाओं २०० µ एल न्यूनतम dropout मध्यम के पुस्तकालय प्लाज्मिड पर चयन मार्कर के अनुरूप ।
    नोट: हम एक सिंथेटिक ुरा-माध्यम का इस्तेमाल किया ।
  12. ३,००० x जी में 5 मिनट के लिए प्लेटें और २.१० कदम के रूप में एक बेकार बिन पर supernatant निकालें ।
  13. जोड़ें १६० µ एल के न्यूनतम ुरा-मध्यम से युक्त 2% ग्लूकोज. भंवर १,००० rpm पर 1 मिनट के लिए प्लेटें और उंहें 30 डिग्री सेल्सियस पर ४८ एच के लिए मिलाते बिना मशीन । ४८ एच के बाद, ध्यान दें कि बदल खमीर की एक गोली एक अच्छी तरह के तल पर दिखाई है ।
  14. एक तरल मशीन का प्रयोग, ुरा-मीडिया के १०० µ एल जोड़ने के एक अच्छी तरह से ९६ का एक नया सेट की अच्छी तरह से प्लेटों में ग्लूकोज युक्त ।
  15. भंवर बदल खमीर से युक्त प्लेटें (२.१३ कदम से) के लिए १,००० rpm पर 30 एस । एक बाँझ प्लास्टिक ९६ का उपयोग कर-पिन रेप्लिकेटर, बदल खमीर युक्त कुओं में पिन जगह है और फिर उन्हें नई प्लेटों के इसी कुएँ में inoculate मीडिया से भरा । 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर नई प्लेट्स की मशीन
    नोट: यदि 10 प्लेट के साथ काम कर रहे हैं, माध्यम भी मैंयुअल रूप से मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर तिरस्कृत किया जा सकता है ।
  16. 24 घंटे के बाद, खमीर के एक गोली एक अच्छी तरह से सफलतापूर्वक खमीर रूपांतरित युक्त के तल में दिखाई जानी चाहिए । ग्लिसरॉल स्टॉक के रूप में इन खमीर उपभेदों को बचाने के लिए, ५०% ग्लिसरॉल के ५० µ एल जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से, भंवर १,००० rpm पर 30 एस के लिए प्लेटों सील, टेप सील और उंहें फ्रीज में-८० ° c ।
    नोट: उपरोक्त कदम केवल एक बार प्रदर्शन करने की जरूरत है । एक ही पुस्तकालय के खिलाफ विभिन्न खमीर मॉडल के भविष्य की स्क्रीन डिस्पोजेबल एजेंट जलाशय ग्लिसरॉल शेयरों से शुरू और नीचे दिए गए चरणों से तुरंत आगे बढ़ना कर सकते हैं ।

3. पुस्तकालय जीन और क्वेरी खमीर युक्त कोशिकाओं के बीच सहवास

  1. ग्लिसरॉल स्टॉक से पुस्तकालय उपभेदों को पुनर्जीवित करने के लिए, ९६-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के बाहर अच्छी तरह से प्लेटें ले, सील टेप को हटाने, और लगभग 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खमीर गल जाने ।
  2. एक बार खमीर गल गया है, एक बाँझ प्लास्टिक ९६-पिन रेप्लिकेटर का उपयोग करने के लिए ताजा ुरा के १६० µ एल के लिए ग्लिसरॉल शेयरों inoculate-मीडिया में 2% ग्लूकोज युक्त ९६-अच्छी तरह से प्लेटें और 30 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें गर्मी के लिए 24 ज. पुस्तकालय उपभेदों के तुरंत बाद उपयोग किया जाता है , सील टेप के साथ प्लेटें सील, और उंहें-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर को वापस ।
  3. एक ही दिन पुस्तकालय उपभेदों (W303α) गल रहे हैं, inoculate में क्वेरी खमीर तनाव (यहां, FUS W303a में) YPD के ५० मिलीलीटर और यह २५० rpm पर मिलाते के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ने ।
  4. अगली सुबह, एक बाँझ डिस्पोजेबल एजेंट जलाशय के लिए क्वेरी खमीर तनाव डालो, और aliquot १६० µ एल क्वेरी तनाव के एक अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर एक ९६ प्लेट की ।
  5. तरल मशीन का प्रयोग, १० ९६ की एक अच्छी तरह से प्लेटों में YPD मीडिया के १६० µ एल वितरण । बाद में पुस्तकालय खमीर के साथ क्वेरी खमीर तनाव संभोग के लिए इन प्लेटों का प्रयोग करें ।
  6. संक्षेप भंवर ९६-अच्छी तरह से क्वेरी तनाव युक्त थाली और फिर एक बाँझ ९६-पिन रेप्लिकेटर YPD प्लेटों के लिए क्वेरी तनाव हस्तांतरण करने के लिए उपयोग करें ।
  7. संक्षेप में पुस्तकालय तनाव प्लेटों भंवर और, प्रत्येक पुस्तकालय तनाव थाली के लिए, एक नया बाँझ ९६-पिन रेप्लिकेटर YPD प्लेटों कि क्वेरी तनाव के साथ inoculated किया गया है करने के लिए पुस्तकालय उपभेदों हस्तांतरण करने के लिए उपयोग करें ।
    नोट: ग्लिसरॉल में कोशिकाओं को कई गल-फ्रीज चक्र के बाद उनकी व्यवहार्यता खो देते हैं । लंबी अवधि के भंडारण के लिए पुस्तकालय उपभेदों रिटर्निंग (-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर) जितनी जल्दी हो सके पुस्तकालय अच्छी गुणवत्ता में रखना होगा, और भविष्य के उपयोग के लिए तैयार है । ठीक से बनाए रखा, ग्लिसरॉल स्टॉक जमे हुए और कम से 10 बार गल सकता है । हम भी दृढ़ता से एक काम की नकल और ग्लिसरॉल स्टॉक के बैकअप प्रतियां रखने की सिफारिश । कार्य स्टॉक काम नहीं करता है, तो तुरंत एक नया कार्यशील प्रतिलिपि बैकअप प्रतिलिपि से बना है ।
  8. 24 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर YPD प्लेट्स की मशीन ध्यान दें कि खमीर की एक गोली 24 घंटे के बाद एक अच्छी तरह से एक के नीचे में दिखाई जाएगी ।
  9. भरें ९६-अच्छी तरह से एक ंयूनतम dropout 2% raffinose युक्त मध्यम, क्वेरी तनाव में प्लाज्मिड पर चयन मार्करों के लिए इसी के साथ और साथ ही पुस्तकालय प्लाज्मिड (जैसे, यहां ुरा-अपने-) ।
  10. एक बाँझ ९६-पिन रेप्लिकेटर का उपयोग करने के लिए चयनात्मक मीडिया YPD संभोग संस्कृतियों से खमीर हस्तांतरण. ४८ एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर ९६-अच्छी तरह से प्लेटें; केवल खमीर कोशिकाओं है कि और दोस्त है द्विगुणित कोशिकाओं का गठन किया है और इसलिए, दोनों क्वेरी प्लाज्मिड और पुस्तकालय प्लाज्मिड इस मीडिया में विकसित करने में सक्षम हो जाएगा शामिल हैं । 2 दिनों के बाद गौर करें कि कुएं के नीचे एक गोली दिखाई दे रही है ।

4. खोलना परख

  1. raffinose-युक्त चयनात्मक मीडिया में वृद्धि के ४८ ज के बाद, स्थान पर खमीर प्लेट्स आगर ।
    1. ुरा-उसकी-dropout प्लेटों के 2 सेट 2% स्पष्ट polystyrene प्लेटों, जिसमें 2% गैलेक्टोज और अन्य युक्त 2% ग्लूकोज का उपयोग कर आगर तैयार.
    2. भंवर ९६-१,००० rpm पर 1 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्लेटें, फिर ुरा के लिए खमीर हाजिर-अपने-dropout 2% गैलेक्टोज और 2% आगार युक्त प्लेटें (FUS और पुस्तकालय जीन प्रेरित कर रहे हैं) और ुरा-अपने-dropout 2% ग्लूकोज युक्त प्लेटों और 2% आगर (FUS और पुस्तकालय जीन दमित) एक रोबोट खोलना मशीन का उपयोग कर, जिसके द्वारा एक अच्छी तरह से संस्कृति quadruplicate में आगर प्लेटों पर देखा जाता है (यानी, 1 में संस्कृति अच्छी तरह से देखा जाता है 4 आगर प्लेट पर स्पॉट) ।
    3. खोलना के बाद, आगार प्लेटें सूख जाने दो, और फिर उंहें एक 30 डिग्री सेल्सियस मशीन में उल्टा जगह है । फोटोः आगर हर 24 घंटे में एक तेज/अधिक खमीर विकास रिकॉर्ड करने के लिए जो में विषाक्तता क्वेरी तनाव को बचाया है या एक धीमी/कम वृद्धि रिकॉर्ड करने के लिए जो में विषाक्तता के लिए क्वेरी तनाव गहरा है । 4 दिनों के लिए प्लेटें की मशीन ।
      नोट: प्रत्येक कुआं में संस्कृति एक पिछले रूपांतरण-आधारित विधि10में दिखाया गया के रूप में 1-to-1, आगर पर देखा जा सकता है । हालांकि, 1-से-4 यहां खोलना (जो आसानी से स्थापित किया जा सकता है रोबोट खोलना मशीन का उपयोग कर) काफी झूठी सकारात्मकता की संख्या को कम करने से परख की मजबूती बढ़ जाती है । सकारात्मक हिट्स तभी माने जाते हैं जब एक ही तरह से सभी 4 कॉलोनियां एक जैसी phenotype दिखाती हैं ।

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Representative Results

ALS-जुड़े प्रोटीन FUS, एक आरएनए/डीएनए बाइंडिंग प्रोटीन, पहले अगुणित खमीर7,8में अध्ययन किया गया था । आनुवंशिक परिवर्तन-विधि आधारित स्क्रीनिंग का उपयोग कई खमीर जीन है कि FUS विषाक्तता को दबाने की खोज की । खमीर जीन में से एक के मानव homolog बाद में एक प्राथमिक ंयूरॉंस सेल और13ALS के चूहे मॉडल में विषाक्तता को दबाने में प्रभावी प्रदर्शन किया गया । यहां, हम एक ही खमीर मॉडल का उपयोग कर रहे है दिखाने के लिए कि एक्सप्रेस पुस्तकालय स्क्रीनिंग के रूप में परिवर्तन के द्वारा प्रभावी रूप से संभोग द्वारा किया जा सकता है ।

FUS दोनों अगुणित और द्विगुणित खमीर कोशिकाओं को विषाक्त है
FUS और बाद में एक्सप्रेस लाइब्रेरी स्क्रीनिंग के पिछले खमीर मॉडल अगुणित सेल पृष्ठभूमि में किया गया था । संभोग के लिए आधारित विधि काम करने के लिए, FUS विषाक्तता द्विगुणित खमीर में प्रदर्शन किया जाना चाहिए । ऐसा करने के लिए, हम w303a में FUS खमीर मॉडल मेट (संभोग प्रकार एक) w303α के साथ एक खाली सदिश के साथ बदल (संभोग प्रकार α) । के रूप में चित्रा 2में संकेत दिया है, हालांकि अगुणित खमीर के रूप में के रूप में मजबूत नहीं है, FUS विषाक्तता द्विगुणित खमीर में स्पष्ट है ।

दमन जीन पहले द्विगुणित खमीर में काम की पहचान
संभोग के लिए सिद्धांत का एक प्रमाण के रूप में विधि आधारित है, हम पांच पहले परिवर्तन से पहचान जीन आधारित पद्धति का परीक्षण किया । संभोग के लिए FUS के अगुणित खमीर मॉडल में पांच जीन के प्रत्येक परिचय (W303a में), और उनके बाद द्विगुणित खमीर में FUS की विषाक्तता से बचाव करने की क्षमता का परीक्षण किया गया था (W303a/α/ जैसा कि चित्रा 3में दिखाया गया है, सभी पांच जीन द्विगुणित खमीर में FUS की विषाक्तता से बचाव, यह दर्शाता है कि संभोग विधि प्रभावी था ।

९४० जीन की एक पायलट स्क्रीनिंग (१० ९६ पर सरणी-अच्छी तरह से प्लेट्स)
प्रोटोकॉल के बाद ऊपर वर्णित है, हम संभोग लागू ९४० जीन की एक एक्सप्रेस पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए विधि आधारित है । चित्रा 4 एक प्रतिनिधि प्लेट की एक तस्वीर प्रदर्शित करता है. के रूप में चित्रा के दाईं ओर संकेत (FUS और पुस्तकालय जीन व्यक्त), FUS के लिए विषाक्त था द्विगुणित खमीर । पुस्तकालय जीन ग्रीन स्क्वायर द्वारा संकेत FUS विषाक्तता बचाया जबकि लाल वर्ग बढ़ाया विषाक्तता द्वारा संकेत दिया ।

Figure 1
चित्रा 1 : जांच के लिए आरेख प्रोटीन विषाक्तता के खमीर मॉडल संभोग का उपयोग । एक प्लाज्मिड पुस्तकालय (GAL1 प्रमोटर जो उच्च गैलेक्टोज की उपस्थिति में प्रेरित है के नियंत्रण में) एक अगुणित खमीर तनाव में तब्दील हो (MATα) एक उच्च प्रवाह परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग कर । खमीर के इस संग्रह, पुस्तकालय plasmids के साथ बदल गया है, पर एक ग्लिसरॉल शेयर के रूप में जमा-८० ° c, और पुनर्जीवित जब प्रोटीन विषाक्तता के अगुणित खमीर मॉडल के साथ मेट की जरूरत (हमारे मामले में, FUS HIS3 लोकस, GAL1 प्रमोटर पर एकीकृत की एक प्रति , मटा). द्विगुणित खमीर युक्त पुस्तकालय प्लाज्मिड और विषैले प्रोटीन (FUS) का चयन कर रहे है और ग्लूकोज के लिए देखा (FUS और पुस्तकालय जीन ' बंद ') और गैलेक्टोज (FUS और लाइब्रेरी जीन ' पर ') आगर प्लेटें । खमीर के विकास के लिए जीन की पहचान है कि बचाव या FUS की विषाक्तता ख़राब पीछा किया गया था । ग्रीन स्क्वायर एक दमन जीन का एक उदाहरण इंगित करता है कि FUS विषाक्तता बचाता है, और लाल वर्ग एक बढ़ाने जीन है कि FUS विषाक्तता ख़राब जब व्यक्त की एक उदाहरण इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : FUS दोनों अगुणित और द्विगुणित खमीर कोशिकाओं को विषाक्त है । अगुणित खमीर (w303 MATa) pRS303Gal1 के साथ तब्दील-FUS या तो एक खाली प्लाज्मिड के साथ बदल रहे थे या विपरीत संभोग प्रकार (w303 MATα) के खमीर के साथ साथी एक ही खाली प्लाज्मिड के साथ बदल एक द्विगुणित खमीर तनाव उत्पंन । एक नियंत्रण तनाव के साथ ये खमीर उपभेदों थे तो 5x प्रश्नपत्र पतला (बाएं से दाएं) और ुरा को देखा-अपने ग्लूकोज मध्यम (बाएं, FUS अभिव्यक्ति दमित) और ुरा-अपने-गैलेक्टोज माध्यम (ठीक है, FUS अभिव्यक्ति प्रेरित) । चित्र 30 डिग्री सेल्सियस पर विकास के 2 दिनों के बाद लिया गया था । अगुणित और द्विगुणित नियंत्रण तनाव के लगभग समान वृद्धि मनाया गया था, इसलिए केवल अगुणित नियंत्रण तनाव दिखाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 : पांच खमीर जीन (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, और VHR1) संभोग आधारित विधि के माध्यम से FUS विषाक्तता बचाव । FUS विषाक्तता को दबाने कि पहले से पहचान खमीर जीन युक्त Plasmids एक अगुणित खमीर तनाव (w303 MATα) में बदल रहे थे । ये खमीर तो विपरीत संभोग प्रकार (w303 माता) एक FUS अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के साथ बदल के अगुणित खमीर के साथ मेट थे । द्विगुणित खमीर युक्त FUS और या तो एक खाली सदिश या पांच दमन जीन में से एक का चयन किया गया था और ग्लूकोज युक्त प्लेटों पर दोहराने में देखा (जीन ' बंद ') और गैलेक्टोज (जीन ' पर ') । (1) एक नियंत्रण खमीर दो खाली वैक्टर के साथ बदल तनाव से पता चलता है । (2) एक खाली सदिश के साथ द्विगुणित FUS खमीर तनाव से पता चलता है जहां FUS की अभिव्यक्ति बहुत विषाक्त है । (3-7) दिखाएं द्विगुणित खमीर व्यक्त FUS के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक दमन जीन है कि FUS विषाक्तता बचाव कर सकते हैं । प्रत्येक संख्या (1-7) बारह समान दोहराने की दो पंक्तियों से पता चलता है । तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करने वाली तस्वीर 30 डिग्री सेल्सियस पर विकास के 3 दिनों के बाद लिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : जीन के लिए पुस्तकालय स्क्रीनिंग कि बचाव या FUS विषाक्तता ख़राब । अगुणित खमीर युक्त FUS अगुणित पुस्तकालय जीन युक्त खमीर के साथ साथी था । सहवास के बाद, FUS और एक पुस्तकालय जीन दोनों से युक्त द्विगुणित कोशिकाओं का चयन किया गया और फिर ग्लूकोज को देखा गया (FUS और पुस्तकालय ' जीन बंद ') और गैलेक्टोज आगर प्लेट्स (FUS और लाइब्रेरी जीन ' पर ') quadruplicate में. गैलेक्टोज प्लेट पर, जिसमें FUS और लाइब्रेरी जीन व्यक्त किए गए थे, अधिकांश खमीर अच्छी तरह से विकसित नहीं हो पा रहे थे । यह इंगित करता है कि FUS विषाक्त है और सबसे पुस्तकालय जीन विषाक्तता से बचाव करने में असमर्थ थे । हरे रंग का वर्ग एक पुस्तकालय जीन का एक उदाहरण है कि FUS विषाक्तता को रोकता है और खमीर कालोनियों फार्म करने के लिए अनुमति देता है दर्शाता है । लाल वर्ग एक पुस्तकालय जीन है कि FUS विषाक्तता ख़राब का एक उदाहरण इंगित करता है । यहां दिखाए गए प्लेटों पुस्तकालय जीन है कि खिलाफ जांच की गई 10 प्लेटों के प्रतिनिधि हैं । चित्र 30 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि के 3 दिनों के बाद लिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए खमीर में एक प्लाज्मिड व्यक्त स्क्रीन संभोग का उपयोग करने खमीर मॉडल में प्लाज्मिड पुस्तकालय परिचय प्रदर्शन । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, neurodegenerative रोग प्रोटीन विषाक्तता के कई खमीर मॉडल एक प्लाज्मिड पुस्तकालय के साथ बदल खमीर के एक ही संग्रह का उपयोग कर दिखलाई जा सकता है । परिवर्तन की श्रमसाध्य प्रक्रिया केवल एक बार प्रदर्शन करने की जरूरत है, जिसके बाद अत्यधिक कुशल खमीर संभोग के लिए क्वेरी तनाव में प्लाज्मिड पुस्तकालय परिचय प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल रोबोट उपकरणों के उपयोग पर निर्भर करता है के लिए मीडिया और स्पॉट खमीर संस्कृतियों प्लेटों पर वितरण आगार । जबकि प्रोटोकॉल रोबोट उपकरणों के उपयोग के बिना किया जा सकता है, यह अधिक समय लगता होगा । इस विधि सफलतापूर्वक FUS की विषाक्तता को संशोधित कर सकते हैं कि जीन के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

हमने देखा है कि FUS थोड़ा कम द्विगुणित खमीर पृष्ठभूमि में विषाक्त है । इस जीन की प्रतिलिपि संख्या और द्विगुणित खमीर की वृद्धि दर में अंतर के कारण सबसे अधिक संभावना है । जब तक कि phenotype का अध्ययन किया जा रहा है संभोग प्रकार या ploidy-निर्भर है, विषाक्तता के विकास phenotype अगुणित और द्विगुणित खमीर में संगत है । इस वजह से, संभोग आधारित विधि विभिंन विकास phenotypes के कई खमीर मॉडल में व्यापक रूप से काम करने की उंमीद है । इसके बावजूद, खमीर मॉडल के phenotype सत्यापित किया जाना चाहिए कि यह अभी भी द्विगुणित पृष्ठभूमि में इस स्क्रीनिंग विधि के प्रदर्शन से पहले मौजूद है सुनिश्चित करने के लिए । इस विधि खमीर में कई अलग phenotypes अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और neurodegenerative प्रोटीन विषाक्तता के अध्ययन तक ही सीमित नहीं है । इसके अलावा, किसी भी प्लाज्मिड पुस्तकालय खमीर अभिव्यक्ति वैक्टर युक्त इस्तेमाल किया जा सकता है ।

स्क्रीन प्रदर्शन करने के बाद, वहां सत्यापन परख कि मदद की पहचान की हिट सुनिश्चित करने के एक नंबर रहे है खमीर मॉडल के लिए विशिष्ट है दिखलाई जा रहा है । विषाक्तता के बढ़ाने सह के बिना खमीर में परीक्षण किया जाना चाहिए-ब्याज की बीमारी प्रोटीन व्यक्त । बढ़ाने के कारण विषाक्तता रोग से स्वतंत्र ब्याज की प्रोटीन आगे के अध्ययन से समाप्त किया जाना चाहिए । इस बात पर विचार करना जरूरी है कि क्या विषाक्तता के दमन से Gal1 प्रवर्तक प्रभावित होकर रोग प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर रहे हैं. Gal1 प्रवर्तक से अभिव्यक्ति को प्रभावित करने वाले किसी भी दमन को आगे के अध्ययन से समाप्त किया जाना चाहिए ।

खमीर उपभेदों पुस्तकालय प्लाज्मिड युक्त स्थाई रूप से ग्लिसरॉल स्टॉक में संग्रहित कर रहे है और जल्दी से पुनर्जीवित किया जा सकता है जब जरूरत है ताकि संभोग आधारित विधि आसानी से अंय खमीर मॉडल में एक ही पुस्तकालय जीन के खिलाफ जांच की जरूरत को लागू किया जा सकता है । संभोग की दक्षता आधारित विधि स्पष्ट हो जाता है जब स्क्रीनिंग के एक ही प्रकार के लिए झूठी सकारात्मक या जब एकाधिक अलग खमीर मॉडल का अध्ययन करने की आवश्यकता को दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हम सफलतापूर्वक तेदेपा के एक खमीर मॉडल-४३, एक और ALS से जुड़े प्रोटीन स्क्रीन करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम जू प्रयोगशाला और Zhong प्रयोगशाला के सदस्यों के साथ विचारशील विचार विमर्श के लिए आभारी हैं, और राइट राज्य विश्वविद्यालय से वित्तीय सहायता ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
salmon Sperm DNA (SS-DNA) Sigma-Aldrich   D1626
YPD broth Research Products International (RPI) Y20090
Granulated Agar Fisher Sci BP97445
D-(+)-Glucose Research Products International (RPI) G32040
D-(+)-Galactose Research Products International (RPI) G33000
D-(+)-Raffinose Pentahydrate Research Products International (RPI) R20500
Ammonium Sulfate Fisher Sci A702-500
Synthetic Ura- drop out medium Clontech 630416
Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil Clontech 630422
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate Research Products International (RPI) Y20060
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Sci S67496
Lithium acetate, anhydrous Fisher Sci AC268640010
Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) Spectrum Chemical  PO125-12KG
96 Pin Replicator  Scinomix SCI-5010-OS
Nunc OmniTray Thermo Sci 140156
Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid Fisher Sci 07-200-760 non-treated, sterile
Eppendorf Research plus Multichannel Pipette Eppendorf TI13690052 30-300ul volume
Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters Fisher Sci 88-860-023
Eppendorf MixMate Eppendorf 21-379-00
Eppendorf 5810R Centrifuge Fisher Sci 05-413-112
Avanti J-26 XPI Centrifuge Beckman 393127
MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser BioTek
Rotor HDA   Singer Instruments

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आनुवंशिकी मुद्दा १३७ खमीर संभोग उच्च प्रवाह अधिक अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग neurodegeneration प्रोटीन खुलासा
सहवास आधारित खमीर में एक्सप्रेस पुस्तकालय स्क्रीनिंग
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Hayden, E., Chen, S., Chumley, A.,… More

Hayden, E., Chen, S., Chumley, A., Zhong, Q., Ju, S. Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast. J. Vis. Exp. (137), e57978, doi:10.3791/57978 (2018).

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