Summary
이 문서는 기준점과 플라스 미드 라이브러리를 사용 하 여 신진 효 모에 overexpression 심사를 용이 하 게 하 짝짓기 기반 메서드를 제공 합니다.
Abstract
싹 트는 효 모 단백질 인간의 질병와 관련 된 공부에 모델로 널리 사용 되었습니다. 게놈 전체 유전자 검사는 일반적으로 효 모 연구에 사용 되는 강력한 도구입니다. 다양 한 효 모에 신경 퇴행 성 질환 관련 단백질의 식이 세포 독성 및 집계 형성, 업과 연구 결과 이러한 장애를 가진 환자에서 발생 합니다. 여기, 그 독성의 한정자 루 경화 증 관련 단백질 FUS의 효 모 모델을 검사 하는 방법을 설명 합니다. 변환을 사용 하 여, 대신이 새로운 심사 플랫폼 효 모 모델에 플라스 미드의 기준점과 라이브러리를 소개 하는 효의 짝짓기에 의존 합니다. 짝짓기 방법에는 두 명확한 이점이 있다: 첫째로, 그것은 매우 효율적인; 둘째, 플라스 미드의 사전 변환 된 기준점과 라이브러리 저장할 수 있습니다 글리세롤 주식으로 장기적이 고 신속 하 게 효 모 모델에 변환의 노동 집약 단계 없이 다른 스크린에 적용에 대 한 각 시간. 어떻게이 방법은 성공적으로 사용할 수 있습니다 설명 수정 FUS의 독성 유전자에 대 한 화면으로.
Introduction
싹 트는 효 모 Saccharomyces cerevisiae 널리 사용 되었습니다 기본 과학 연구1 에 직접 인간의 질병에 관련 된 세포 프로세스를 이해 하. 또한, 그것은 사용 되는 모델 생물으로 가장 흔한 신경 퇴행 성 질환, 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 헌팅턴 병, 그리고 루를 포함 하 여에 연결 등 인간의 질병 관련 단백질, 공부에 대 한 옆 경화 증 (ALS)2. 효 모 모델의 장점은는 게놈 넓은 스크린 따라서 그들의 독성의 메커니즘에 대 한 통찰력을 주는 질병 관련 단백질의 독성에 관련 된 세포 경로 식별 하기 위해 수행할 수 있는 용이성입니다. 이러한 한 화면은 기준점과 라이브러리에 5500 효 모 유전자 각각의 어떤 유전자 독성 overexpressed 때 수정할 수 있습니다 식별 하는 효 모 모델로 변환 됩니다 overexpression 라이브러리 화면을 이라고 합니다. 이 검사 방법은 여러 신경 퇴행 성 질환 관련 단백질의 Huntington의 질병3, 파 킨 슨 병4,5 α-synuclein huntingtin 포함 효 모 모델에 성공적으로 적용 된 , 알 츠 하이 머 병6, FUS 및 TDP-43 ALS7,,89Aβ. 일반적으로는 높은 처리량 방법10에서 이루어집니다, 하는 동안 화면의 가장 노동 집약적인 단계는 개별적으로 기준점과 라이브러리에서 5500 효 모 유전자 변형 시키는. 심사, 반복 때마다가이 단계를 수행 해야 합니다 그리고 때마다 새로 설립된 된 효 모 모델 공부 될 필요가 있다. 그것은이 작업을 수행 하는 더 효율적인 방법을 찾을 수 해야 합니다.
효 모 세포는 단일과 2 중 형태로 안정적으로 존재할 수 있습니다. 두 유형의 단일 셀, 짝짓기 형식 짝짓기 반대는 각 짝짓기의 α. 단일 셀 생산을 입력 하 고 짝짓기 형식 셀 반대만 응답 하는 그들의 자신의 특정 짝짓기 페로몬을 분 비 하는 고. 이로써 간의 짝짓기는 생산 안정 된 2 중 세포, / α α 세포. 이 과정은 자발적이 고 매우 효율적인11. 우리 플라스 미드 도서관 소개 S. cerevisiae 의이 독특한 라이프 사이클의 활용할 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, 기준점과 플라스 미드 도서관에서 각 유전자 한 짝짓기 종류, 즉, α 셀의 단일 세포로 변형 됩니다. 라이브러리 유전자를 포함 하는 이러한 셀 다음 글리세롤 주식 기준점과 96 잘 형식에서에 저장 됩니다. 상영 하는 각 효 모 모델, 라이브러리 유전자를 포함 하는 효 모 세포 글리세롤 주식에서 재개 수 있습니다 되 고 반대 짝짓기 종류, 즉, 짝짓기 종류의 효 모 모델 짝짓기를 통해 심사를 할 수 있는 한. 효 모에 두 개의 유전자를 함께가지고 짝짓기를 사용의이 아이디어를 새로운 되지 않습니다. 2 하이브리드 심사, 있는 미끼 생성 한 짝짓기 형식에 (즉, Gal4 DNA 바인딩 도메인 융해) 소집 짝짓기 기준점과 라이브러리에서 먹이 구조를 통해 높은 처리량 효 모에 성공적으로 적용 된 그러나 12.,이 전략 적 overexpression 라이브러리 검 진, 항상 전통적인 변환 방법 사용에 적용 되었습니다.
우리의 실험실 이전 ALS 관련 단백질 FUS7의 효 모 모델을 설립. 변환 메서드를 사용 하 여 overexpression 라이브러리 심사를 통해 우리 FUS overexpressed 때의 독성을 구출 하는 5 개의 효 모 유전자를 (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, 및 VHR1)을 발견 했다. 이들이 발견 했다 독립적으로 확인 하지 비슷한 연구와 다른 그룹8. hUPF1, ECM32의 인간 상 동 기관 나중 기본 신경 세포13 와 ALS14 도의 동물 모델에서 독성을 억제 하기 위해 표시 했다. 이 5 개의 유전자를 사용 하 여 원리의 증거로, 그들은 짝짓기에 의해 FUS 효 모 모델에 소개 될 때 모든 5 개의 유전자 마찬가지로 FUS 독성을 구조 설명 합니다. 라이브러리 유전자를 포함 하는 효 모 세포 글리세롤 주식에 영구적으로 저장 하 고 필요할 때마다 부활 수 있습니다, 이후이 짝짓기 기반 메서드 변환 라이브러리에 대 한 검사를 해야 할 때마다 시간이 많이 걸리는 단계를 제거 합니다. 짝짓기 하는 것이 없는 플라스 변환 관련 고효율 이후이 전략 또한 크게 정화 및 큰 플라스 미드 도서관의 변화와 관련 된 비용을 줄입니다. 우리 도서관 FUS의 효 모 모델에 대 한 심사를 성공적으로이 메서드를 적용 됩니다.
짝짓기 기반 검사 절차 그림 1에 간략하게 설명 되어 있습니다. 처음, 기준점과 플라스 미드 도서관 종류 α 96 잘 접시의 각 잘 포함 효 모 특정 라이브러리 플라스 미드로 변형 되어 있는 높은 처리량 효 모 전이 프로토콜을 사용 하 여 짝짓기의 단일 효 모 긴장으로 변화 됩니다. 이 컬렉션 변환 효 해 동 하 고 나중에 사용 하기 위해 부활 수 있는 글리세롤 주식으로 저장 됩니다. 이 경우 FUS 독성에 관심사의 효 모 모델 반대 짝짓기 형식과 단일 효 모 스트레인에 생성 해야 합니다 (유형 짝짓기는). 살 균 96 핀 복제기를 사용 하 여 높은 처리량으로, FUS 긴장과 플라스 미드 도서관을 포함 하는 효 모 종자는 96 잘 접시 포함 된 리치 미디어를 전송 하며 수 친구. 짝짓기, 각 작은 볼륨 다음 짝짓기 문화의 잘 96 잘 접시 합성 강하 미디어 모두 FUS를 포함 하는 2 중 효 모에 포함 된 전송 및 라이브러리 유전자 성장할 수 있다. 로봇 탐지 기계는 FUS 및 라이브러리 유전자의 표정을 유도 된 한 천 배지 위에 각 우물에서 효 모 문화를 전송에 사용 됩니다. 또한, 효 모 문화는 어디 FUS 및 라이브러리 유전자 표현 되지 않는다 하는 한 천 배지를 제어 하 발견 됩니다. 한 천 배지에서 성장, 다음 구조 또는 악화 FUS 독성 유전자 식별 합니다.
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Protocol
참고: 여기에 설명 된 프로토콜 10 96 잘 접시에 포함 된 라이브러리 플라스 미드를 상영을 위해 설계 되었습니다 하지만 확장 될 수 있습니다 또는 그에 따라 아래로. 프로토콜은 라이브러리 전체 심사를 완료 하는 데 반복 될 필요가 있다. 일반적으로, 라이브러리 유전자의 10 판에 대 한 심사 때마다 1 사람이 편안 하 게 처리할 수 있습니다.
1. 96 잘 누 룩 변환에 대 한 준비
참고:이 단계는 수행 이전 설명된7,10.
- Aliquot 5 µ L (약 50-100 ng)의 플라스 미드 DNA 라운드 아래 96 잘 접시의 각 음에 기준점과 플라스 미드 도서관에서.
참고: 이러한 라이브러리의 예로 효 모 유전자 overexpression 라이브러리10것입니다. - 단일 효 모 스트레인 W303α의 식민지 (2-3 m m 직경)와 500 mL 플라스 크에 효 모 펩 포도 당 (YPD) 미디어의 150 mL 접종 떨고 (200 rpm)와 30 ° C에서 그들을 밤새 품 어.
- 다음 아침, 하룻밤 문화의 OD600 을 측정 하 고 OD600 효 모 문화를 희석 = 0.1 YPD 2 L (을)에서. 품 어 그것 동요 (200 rpm)와 30 ° c ~ 5 h에 대 한 문화 OD600 에 도달할 때까지 = 0.4-0.6.
2. 누 룩 변환
- 8 살 균 250 mL 원심 병 작성 및 10 분에 대 한 3000 x g 에서 실내 온도에 그들을 centrifuging 효 모 문화는 펠 렛을 방해 하지 않고 부는 상쾌한 어 추수.
참고: 상 온에서 원심 분리 단계를 모두 수행 합니다. - 워시 살 균 증류수 H2o.와 누 룩 이 위해 살 균 H2O의 100 mL에 추가 각 원심 병 및 소용돌이 그것 셀 펠 릿 resuspend. 2 병 및 원심 분리기 3000 x g 5 분에서 부는 상쾌한 어로 씻어 세포를 결합 합니다.
- 각 병 100 mL에 0.1 M LiOAc/1XTE (100mm LiOAc; 10 mM Tris, pH 8.0; 1 mM EDTA)의 세포를 세척 하 고 5 분 부는 상쾌한 오프에 대 한 3000 x g 에서 원심.
- Centrifuging, 하는 동안 3 분에 대 한 블록 히터를 사용 하 여 100 ° C에서 연어 정자 DNA (10mg/mL)의 5 mL을 삶아 고 얼음에 그것을 냉각.
- 각 병에 0.1 M LiOAc/1XTE의 25 mL에 셀 펠 릿을 resuspend, resuspended 셀을 결합 하 고 150 mL 플라스 크에 그들을 전송. 사전 냉각된 연어 정자 DNA의 5 mL을 추가 하 고 30 분 (225 rpm)을 떨고와 30 ° C에서 품 어.
- 멸 균 일회용 시 저수지로 셀 혼합물을 부 어 하 고, 세포 혼합물의 35 µ L을 라운드-96-잘 바닥판 포함 하는 라이브러리 플라스 미드 DNA의 각 영역 전송 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여. 소용돌이 96 잘 접시 1000 rpm에서 1 분 동안 접시 vortexer를 사용 하 여. 동요 하지 않고 30 ° C에서 30 분 동안 접시를 품 어.
참고: 열 보다 효율적으로 전송할 수 있도록, 접시를 스택을 하지 않습니다. 우리는 vortexing 1000 rpm에서 96 잘 접시는 우물 밖으로 유출에 액체를 발생 하지 않습니다 하지만 안전 소용돌이 속도 단계를 수행 하기 전에 테스트 해야 합니다 발견. - 플라스 크에 40 %PEG3350 마지막 농도, 10 %DMSO, 그리고 0.1 M LiOAc 변환 버퍼의 200ml를 준비 합니다. 즉시 사용 하기 전에 변환 버퍼를 준비 하 고 떨고에 의해 철저 하 게 혼합.
- 30 ° C 배양 기에서 제거 96 잘 접시와 30에 대 한 그들을 섞어 접시 vortexer를 사용 하 여 1000 rpm에서 s. 추가 변환 버퍼의 125 µ L 각 잘 그리고 소용돌이를 1 분 동안 접시 1000 rpm.
- 30 분 동안 30 ° C에서 번호판을 품 어 그리고 15 분 동안 42 ° C 인큐베이터에 접시를 배치 하 여 충격 누 룩을 열.
참고: 판 스택을 하지 않습니다. - 3000 x g에 5 분 동안 격판덮개 원심 폐기물 빈 위에 접시를 반전 하 고 강제로 격판덮개에서 버퍼를 덤핑 하 여 우물에서 변환 버퍼를 제거 합니다. 신속 하 게 거꾸로 번호판 번호판 위에 어떤 액체를 제거 하는 깨끗 한 종이 타월에 오 점.
- 최소한의 강하 중간에 해당 하는 라이브러리 플라스 미드에 선택 가능한 마커의 접시 200 µ L을 추가 하 여 셀을 씻어.
참고: 우리는 합성 우 라-매체를 사용합니다. - 3000 x g 에 5 분 동안 접시를 원심 고 단계 2.10에서 폐기물 bin에는 상쾌한을 제거 합니다.
- 최소한의 우 라-매체 포함 2% 포도의 160 µ L를 추가 합니다. 와 동 1000 rpm에서 1 분 동안 접시 및 48 h 30 ° C에서 흔들어 없이 그들을 품 어. 48 h 후 note 변형된 효 모의 공 각의 맨 아래에 표시 됩니다.
- 액체 디스펜서를 사용 하 여, 96 잘 접시의 새로운 세트의 각 음에 우 라-미디어 포함 포도 당 100 µ L를 추가 합니다.
- 와 동 30 1000 rpm (단계 2.13)에서 변형 된 효 모에 포함 된 접시 살 균 플라스틱 96 핀 복제기를 사용 하 여 s., 핀 변환 된 효 모에 포함 된 우물에 놓고 새로운 접시의 해당 우물에 그들을 예방합니다 미디어를 가득합니다. 24 h 30 ° C에서 새로운 번호판을 품 어.
참고: 10 접시를 사용 하는 경우 매체 수 또한 될 적절 멀티 채널 펫을 사용 하 여 수동으로. - 24 h 후 효 모의 펠 릿은 성공적으로 변환 된 효 모에 포함 된 각의 맨 아래에 표시 되어야 합니다. 글리세롤 주식으로 이러한 효 모 종자 저장, 각 음에 50% 글리세롤의 50 µ L을 추가 소용돌이 30 접시 1000 rpm에서 s 바다 표범 어업 테이프와 플레이트를 밀봉 하 고-80 ° c.에서 그들을 멈추게
참고: 위의 단계를 한 번 수행 해야 합니다. 동일한 라이브러리 일회용 시 저수지에 대해 다른 효 모 모델의 미래 상영 글리세롤 주식에서 시작 하 고 단계에서 즉시 진행 수 있습니다.
3. 쿼리 효 모 라이브러리 유전자를 포함 하는 셀 간의 짝짓기
- 글리세롤 주식에서 라이브러리 긴장을 회복, 96 잘 접시-80 ° C 냉동 고, 제거는 씰링 테이프, 고 누 룩 약 30 분 동안 실 온에서 녹여 밖으로 걸릴.
- 효 모는 해 동 되 면 살 균 플라스틱 96 핀 복제기를 사용 하 여 글리세롤 주식 96 잘 접시에 신선한 우 라-미디어 포함 2% 포도의 160 µ L 접종을 라이브러리 긴장 사용 후에 즉시 24 h. 30 ° C에서 그들을 품 어 바다 표범 어업 테이프와 번호판을 봉인 하 고-80 ° C 냉장고에 반환.
- 라이브러리 긴장 (W303α)는 해 동 하는 같은 날에 접종 쿼리 효 모 스트레인 (여기, W303a에는 FUS) YPD 50 mL를 하룻밤 250 rpm에서 떨고와 30 ° C에서 그것을 성장 하 고.
- 다음날 아침, 멸 균 일회용 시 저수지, 그리고 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시의 각 음에 쿼리 스트레인의 aliquot 160 µ L를 쿼리 효 모 스트레인을 붓는 다.
- 액체 디스펜서를 사용 하 여 10 96 잘 접시의 각 음에 160 µ L YPD 미디어의 분배. 라이브러리 효 모와 쿼리 효 모 스트레인 짝짓기 나중이 접시를 사용 합니다.
- 짧게 소용돌이 96 잘 접시 쿼리 긴장과 다음 사용 하 여 쿼리를 전송 하는 살 균 96 핀 복제기를 포함 하는 YPD 번호판 스트레인.
- 짧게 소용돌이 라이브러리 변형 판 및, 각 라이브러리 스트레인 플레이트를 사용 하 여 새로운 살 균 96 핀 복제기 쿼리 긴장으로 주사 하는 YPD 번호판 라이브러리 긴장을 전송.
참고: 셀 글리세롤에 여러 동결 눈 녹은 물 주기 후 그들의 생존 능력을 잃게됩니다. 돌아가서 라이브러리 긴장 장기 보관 (-80 ° C 냉동 고) 가능 한 한 빨리 좋은 품질, 라이브러리를 유지 하 고 나중을 위해 준비 됩니다. 제대로 유지, 글리세롤 재고 냉동 고 10 시간 이상 해 동. 우리는 또한 강력 하 게 작업 복사본 및 글리세롤의 백업 복사본을 유지 것이 좋습니다. 작업 사진, 작동 하지 않을 때 즉시 새로운 확인 작업 복사본 백업 복사본에서. - YPD 접시 24 h. 참고는 효의 펠 릿 표시 됩니다 각 우물의 바닥에서 24 시간 후에 30 ° c를 품 어.
- 2% 유, 해당 하는 라이브러리 (예를 들어, 여기 우 라-그의-)를 플라스 미드에 뿐만 아니라 쿼리 스트레인에 플라스 미드에 선택 가능한 마커를 포함 하는 최소의 강하 매체와 채우기 96 잘 접시.
- 살 균 96 핀 복제기를 사용 하 여 선택적 미디어 문화를 짝짓기 하는 YPD에서 누 룩을 전송. 48 h; 30 ° C에서 96 잘 접시를 품 어 만 성관계를 셀을 효 모와 형성 2 중 세포, 따라서 두 쿼리 플라스 미드를 포함 고 라이브러리 플라스 미드가이 미디어에서 성장할 수 있을 것입니다. 2 일 후 관찰 펠 릿 우물의 하단에 표시 됩니다.
4. 분석 결과 보 이나
-
유에 포함 된 선택적 미디어에 성장의 48 h 후 한 천 배지에서 효 자리.
- 2 %agar 분명 폴리스 티 렌 플레이트, 1 개 포함 2% 갈 락 토스와 다른 포함 2% 포도 당을 사용 하 여 포함 된 우 라 그의 강하 격판덮개의 2 세트를 준비 합니다.
- 1000 rpm에서 1 분 동안 소용돌이 96 잘 접시 다음 누 룩 2% 갈 락 토스와 2 %agar (FUS 및 라이브러리 유전자 유도 된다)를 포함 하는 우 라 그의 강하 번호판과 포도 당 2%와 2 %agar (FUS 및 라이브러리 유전자를 포함 하는 우 라 그의 강하 번호판 자리 억압)는 각 문화 잘 발견 quadruplicate에 한 천 배지 위에 로봇 탐지 기계를 사용 하 여 (즉, 1에서 문화 잘 발견 한 접시에 4 반점에).
- 구경, 후 한 천 배지, 건조 하 고 다음 거꾸로 30 ° C 배양 기에서 그들을 배치 하자. 쿼리 스트레인에 독성 구조는 더 빨리/더 효 모 성장 기록 또는 기록 쿼리 스트레인에 독성 악화 됩니다 느린/덜 성장 한 천 배지 모든 24 h에 사진. 4 일에 대 한 번호판을 품 어.
참고: 각 문화 잘 발견하실 수 있습니다 한 천 배지 1-1에 이전 변환 기반 방법10에서 같이. 그러나, 1-에-4 여기 안보 (로봇 탐지 기계를 사용 하 여 편리 하 게 설정할 수 있습니다)이 크게 잘못 된 반응의 수를 줄여 분석 결과의 견고성을 증가. 긍정적인 안타 때 동일한에서 모든 4 식민지 잘 유사한 표현 형을 표시만 여겨진다.
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Representative Results
ALS 관련 단백질 FUS, RNA/DNA 의무적인 단백질, 단일 효 모7,8이전 연구 했다. 유전자 검사를 사용 하 여 변환 기반 방법 FUS 독성을 억제 하는 여러 효 모 유전자 발견. 효 모 유전자의 인간 상 동 기관 나중 기본 신경 세포 및 ALS13의 쥐 모델에서 독성 억제에 효과적인 것으로 입증 되었다. 여기, 우리는 사용 하 여 동일한 효 모 모델 overexpression 라이브러리 심사 효과적으로 결합 하 여 수행할 수 있습니다 보여로 변환 하 여.
FUS는 모두 단일과 2 중 효 모 세포에 독성
FUS 및 후속 overexpression 라이브러리 심사의 이전 효 모 모델은 단일 셀 배경에서 수행 되었다. 작동 하도록 짝짓기-기반 방법, FUS 독성 2 중 효 모에 설명 될 필요가 있다. 이렇게 하려면, 우리 w303a에서 FUS 효 모 모델 성관계 (유형 짝짓기는) w303α (짝짓기 종류 α)는 빈 벡터와 변형으로. 비록 아니라 단일 효 모와 같이 강한 그림 2에 표시 된, FUS 독성 2 중 효 모에 분명 하다.
억제 유전자는 이전 2 중 효 모에는 작업을 식별
증거로 서의 짝짓기-기반 방법에 대 한 원리, 이전 변환 기반 방법에서 확인 된 5 개의 유전자 테스트. FUS (W303a)에서 단일 효 모 모델에는 5 개의 유전자의 각을 소개 하는 데 사용 했다 짝짓기와 후속 2 중 효 모에는 FUS의 독성을 구출 하기 위해 그들의 능력 테스트 (W303a/α). 그림 3에서 보듯이, 모든 5 개의 유전자 구조 짝짓기 방법 효과적 이었습니다 나타내는 2 중 효 모에는 FUS의 독성.
940 유전자 (10 96 잘 접시에 배열)의 파일럿 심사
위에서 설명한 프로토콜에 따라 우리 940 유전자의 overexpression 라이브러리 심사 짝짓기-기반 방법 적용. 그림 4 는 하나의 대표적인 접시의 그림을 표시합니다. 그림 (FUS 및 라이브러리 유전자 표현)의 오른쪽에 표시 된 대로 FUS 2 중 효 모에 유해 했다. 빨간색 사각형으로 표시 하는 독성을 강화 하는 동안 녹색 사각형으로 표시 된 라이브러리 유전자 FUS 독성을 구출.
그림 1 : 짝짓기를 사용 하 여 단백질 독성의 효 모 모델을 심사에 대 한 다이어그램. (갈 락 토스의 높은 유도 GAL1 발기인 통제) 플라스 미드 도서관 높은 처리량 변환 프로토콜을 사용 하 여 단일 효 모 스트레인 (MATα)으로 변환 됩니다. 효 모, 라이브러리 플라스 미드와 변환의이 컬렉션-80 ° c, 글리세롤 주식으로 저장 되 고 단일 효 모 모델 (우리의 경우, FUS HIS3 로커 스, GAL1 발기인에 통합의 복사본 하나에 단백질 독성의 짝 필요할 때 부활은 마 타). 2 중 효 모 라이브러리 플라스 미드 및 독성 단백질 (FUS)을 포함 하는 선택 하 고 ('끄기' FUS 및 라이브러리 유전자) 포도 당과 갈 락 토스 (FUS 및 라이브러리 유전자 '에') 한 천 배지를 발견. 누 룩의 성장 구조 또는 악화 FUS의 독성 유전자를 식별 하기 위해 뒤를 이었다. 녹색 사각형 FUS 독성, 구출 하는 억압 유전자의 예를 나타내고 빨간색 사각형 FUS 독성 overexpressed 때 악화 하는 증강 인자 유전자의 예를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : FUS는 모두 단일과 2 중 효 모 세포에 독성이. 단일 효 모 (w303 타) pRS303Gal1-FUS로 변형 중 하나는 빈 플라스 미드와 변형 또는 2 중 효 모 긴장을 생성 하는 동일한 빈 플라스 미드와 변형 반대 짝짓기 형식 (w303 MATα)의 효 모와 성관계. 컨트롤 스트레인 함께 이러한 효 모 종자 다음 5 직렬로 희석 (왼쪽에서 오른쪽)와 우 라 그의 포도 당 중간 (왼쪽된, FUS 식 억압)과 우 라 그의 갈 락 토스 중간 (오른쪽, FUS 식 유도)을 발견 했다. 그림 30 ° c.에 성장의 2 일 후에 찍은 단일과 2 중 제어 긴장의 거의 동일한 성장만 단일 컨트롤 변형을 표시 했다 관찰 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 5 효 모 유전자 (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1, 및 VHR1) 짝짓기 기반 방법을 통해 FUS 독성 구조. FUS 독성 억제 이전 확인 된 효 모 유전자를 포함 하는 플라스 미드는 단일 효 모 스트레인 (w303 MATα)으로 변모 했다. 이러한 효 모 FUS 식 플라스 미드와 변형 반대 짝짓기 형식 (w303 마 타)의 단일 효 모와 성관계 후 했다. FUS 빈 벡터 및 5 억제 유전자 중 하나를 포함 하는 2 중 효 모 포도 '오프' (유전자)를 포함 하는 한 천 배지와 갈 락 토스 ('에' 유전자)에 선택 되 고 발견에 복제 했다. (1) 두 개의 빈 벡터를 변형 제어 효 모 스트레인을 보여줍니다. (2)는 빈 벡터 FUS의 표정은 매우 독성로 2 중 FUS 효 모 스트레인을 보여줍니다. (3-7) 표시 FUS 독성을 구조 할 수 있는 억제 유전자로 서 FUS 표현 2 중 효 모. 각 번호 (1-7) 쇼 동일한 12의 두 행을 복제 합니다. 그림을 대표 하는 3 개의 독립적인 실험, 30 ° c.에 성장의 3 일 후에 찍은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 유전자 구조 또는 악화 FUS 독성에 대 한 라이브러리 심사. FUS를 포함 하는 단일 효 모 라이브러리 유전자를 포함 하는 단일 효 모와 성관계를 했다. 짝짓기 후 FUS 및 라이브러리 유전자를 모두 포함 하는 2 중 셀 선택 하 고 quadruplicate에서 한 천 배지 (FUS 및 라이브러리 유전자 '에') ('끄기' FUS 및 라이브러리 유전자) 포도 당과 갈 락 토스를 발견 했다. FUS 및 라이브러리 유전자 표현 되었다, 갈 락 토스 접시에 누 룩의 대부분 잘 성장할 수 있었다. 이 FUS 독성은 대부분 라이브러리 유전자 독성을 구출 하지 못했습니다 나타냅니다. 녹색 사각형 FUS 독성 억제 및 식민지를 형성 하는 효 모 라이브러리 유전자의 예를 보여 줍니다. 붉은 광장 FUS 독성 악화 라이브러리 유전자의 예를 나타냅니다. 여기에 표시 된 번호판에 대 한 상영 했다 도서관 유전자의 10 접시의 대표 있습니다. 그림 30 ° c.에 성장의 3 일 후에 찍은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 짝짓기 사용 하 여 효 모 모델에 플라스 미드 도서관을 소개 하는 효 모에 플라스 미드 overexpression 화면 수행 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 신경 퇴행 성 질병 단백질 독성의 여러 효 모 모델 수 상영 플라스 미드 도서관으로 변형 하는 효 모의 동일한 컬렉션을 사용 하 여. 변화의 힘 드는 과정만는 고효율 효 모 후 쿼리 스트레인에 플라스 미드 도서관을 소개 하는 짝짓기 한 번 수행 해야 합니다. 이 프로토콜은 미디어와 한 천 배지 위에 자리 효 모 문화 분배를 로봇 장비의 사용에 의존지 않습니다. 프로토콜의 로봇 장비를 사용 하지 않고 수행할 수 있습니다, 하는 동안 그것은 더 많은 시간이 소요 됩니다. 이 메서드는 성공적으로 FUS의 독성을 수정할 수 있는 유전자에 대 한 화면을 사용.
FUS 2 중 효 모 배경에서 약간 덜 독성은 관찰 합니다. 이 대부분 유전자 사본 수와 2 중 효의 성장 율에 차이. 하지 않는 한 공부 되는 표현 형은 짝짓기 형식 또는 ploidy 종속, 독성의 성장 형 단일과 2 중 효 모에 일치 하는. 이 때문에, 짝짓기-기반 방법 다양 한 성장 고기의 많은 효 모 모델에서 널리 일 예정 이다. 그럼에도 불구 하 고, 효 모 모델의 표현 형이 심사 메서드를 수행 하기 전에 그것은 여전히 2 중 배경에서 존재는 되도록 확인 되어야 한다. 이 방법은 효 모에 많은 다른 고기를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 신경 단백질 독성의 연구에 국한 되지 않습니다. 또한, 모든 플라스 미드 도서관 포함 효 모 식 벡터를 사용할 수 있습니다.
화면을 수행한 후 상영 되 고 효 모 모델에 특정 식별된 안타를 확인 하는 데 도움이 됩니다 확인 분석 실험의 여러 가지가 있습니다. 독성의 강화 공동 관심사의 질병 단백질을 표현 하지 않고 효 모에 테스트 되어야 합니다. 독립적인 관심사의 질병 단백질의 독성을 일으키는 강화 추가 연구에서 제거 되어야 합니다. 그것은 독성의 진압 Gal1 발기인에 영향을 미치는 여 식 질병 단백질의 영향 여부를 고려 하는 것이 중요입니다. 모든 진압 Gal1 발기인에서 식에 영향을 미치는 추가 연구에서 제거 되어야 합니다.
라이브러리 플라스 미드를 포함 하는 효 모 종자 글리세롤 주식에 영구적으로 저장 하 고 짝짓기 기반 메서드는 동일한 라이브러리 유전자에 대 한 상영 될 필요가 다른 효 모 모델에 쉽게 적용할 수 있도록 필요할 때 신속 하 게 부활 될 수 있습니다. 짝짓기-기반 방법의 효율성 심사의 동일한 종류는 가양성을 사용 하거나 여러 다른 효 모 모델 공부 될 필요가 있을 때 분명 한 된다. 우리가 성공적으로 TDP-43, 효 모 모델에이 방법을 사용 하는 다른 단백질은 ALS에 연결.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 주 실험실 및 종 실험실, 라이트 주립 대학에서 재정 지원의 구성원과 사려깊은 토론에 대 한 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
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