Summary
Denna artikel presenterar en parning-baserad metod för att underlätta överuttryck screening i spirande jäst med en klädd plasmid-biblioteket.
Abstract
Spirande jäst har använts som modell i studerar proteiner som är associerad med mänskliga sjukdomar. Genome-wide genetisk screening är ett kraftfullt verktyg som ofta används i jäst studier. Ett uttryck för ett antal neurodegenerativa sjukdomar-associerade proteiner i jäst orsakar cytotoxicitet och samlad formation, går igenom resultaten ses hos patienter med dessa sjukdomar. Här, beskriver vi en metod för screening en jäst modell av amyotrofisk lateralskleros-associerade protein FUS för modifierare av dess toxicitet. Istället för att använda transformation, bygger denna nya screening plattform på parning av jäst att införa en klädd bibliotek av plasmider i jäst modellen. Metoden parning har två tydliga fördelar: för det första är högeffektiva; det andra kan pre transformerad klädd biblioteket av plasmider lagras för långsiktig som en glycerol lager och snabbt tillämpas på andra skärmar utan det arbetsintensiva steget omvandling in i jäst modellen varje gång. Vi visar hur denna metod kan framgångsrikt användas till skärmen för gener som ändra toxiciteten av FUS.
Introduction
Spirande jästen Saccharomyces cerevisiae har använts i grundforskningen1 för att förstå cellulära processer direkt relaterade till mänskliga sjukdomar. Dessutom, det har använts som modellorganism för studerar mänskliga sjukdomsassocierade proteiner, såsom de som är kopplade till de vanligaste neurodegenerativa sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom och amyotrofisk Lateral skleros (ALS)2. En fördel med jäst modellen är den lätthet med vilken en genome-wide skärm kan utföras för att identifiera cellulära vägar relaterade till toxiciteten av sjukdomsrelaterade proteiner, vilket ger inblick i mekanismen för deras giftighet. En sådan skärm kallas ett överuttryck skärmen bibliotek, där var och en av de 5 500 jäst generna i en klädd bibliotek förvandlas till en jäst-modell för att identifiera vilka gener kan ändra toxicitet när i ökad utsträckning. Denna screeningmetod har tillämpats framgångsrikt i jäst modeller av flera neurodegenerativa sjukdomar-associerade proteiner, inklusive huntingtin för Huntingtons sjukdom3, α-synuclein för Parkinsons sjukdom4,5 , Aβ för Alzheimers sjukdom6, och FUS och TDP-43 för ALS7,8,9. Medan det görs oftast i en hög genomströmning sätt10, förändrar det mest arbetsintensiva steget på skärmen individuellt 5.500 jäst gener från en klädd bibliotek. Det här steget måste utföras varje gång screening repeteras, och närhelst en nyinrättade jäst modell behöver studeras. Det är viktigt att hitta ett mer effektivt sätt att utföra denna uppgift.
Jästceller kan stabilt finns i både haploida och diploida former. Det finns två motsatta parning typer av haploida celler, parning typ en α. haploida celler för varje parning typ producera och utsöndra sina egna specifika parning feromon, som endast motsatt parning typ cellerna svarar på. Detta tillåter parning mellan en och α-celler att producera stabila diploida, a/α. Denna process är spontana och högeffektiv11. Vi kan dra nytta av denna unika livscykel S. cerevisiae att införa plasmiden biblioteket. Mer specifikt kommer varje gen i klädd plasmid biblioteket att omvandlas till haploida celler av en parning typ, dvs, α-cellen. Dessa celler innehåller bibliotek generna lagras sedan i glycerol lager i en klädd 96 brunnar-format. För varje modell av jäst som behöver undersökas, jästceller som innehåller bibliotek generna kan tinas upp från glycerol lager och screening kan göras genom parning med jäst modell av intresse i den motsatta parning typ, dvsparning typ en. Denna idé att använda parning för att föra samman två gener i jäst är inte ny. Det har tillämpats framgångsrikt i hög genomströmning jästen två-hybrid screening, där konstruera ett bete (dvs.Gal4-DNA-bindande domänen fusioner) i en parning typ förs samman genom parning med en byte konstruktion från ett klädd bibliotek 12. denna strategi har dock aldrig tillämpats i överuttryck bibliotek filmvisningar, som alltid har använt traditionella omvandling metoder.
Vårt laboratorium har inrättats en jäst modell av ALS-associerade protein FUS7. Genom överuttryck bibliotek screening med metoden omvandling upptäckte vi fem jäst gener (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1och VHR1) som rädda toxicitet av FUS när i ökad utsträckning. Dessa slutsatser bekräftades självständigt med en liknande studie av en annan grupp8. hUPF1, en mänsklig homolog av ECM32, visades senare att undertrycka toxicitet i primära neuronala celler13 och i en djurmodell av ALS14 också. Med dessa fem gener som bevis av princip, visar vi att alla fem gener på samma sätt rädda FUS toxicitet när de införs i FUS jäst modellen genom parning. Eftersom jästceller som innehåller bibliotek generna kan lagras permanent i glycerol lager och återupplivade när det behövs, tar denna parning-baserade metod bort tidskrävande steget att omvandlingen varje gång biblioteket behöver vara avskärmade mot. Eftersom parning är högeffektiva med någon plasmid förvandling inblandade, minskar denna strategi också avsevärt kostnaden i samband med rening och omvandling av en stor plasmid bibliotek. Vi kommer att framgångsrikt tillämpa denna metod på ett bibliotek som screening mot jäst modell av FUS.
Proceduren för parning-baserad screening är kortfattat beskrivs i figur 1. Inledningsvis, förvandlas klädd plasmid biblioteket till en haploida jäst stam för parning typ α med ett högt dataflöde jäst omvandling protokoll där varje brunn en plattan med 96 brunnar innehåller jäst förvandlas med ett specifikt bibliotek plasmid. Denna samling av omvandlade jäst sparas som en glycerol lager som kan tinas upp och återupplivas för användning senare. Den jäst modellen av intresse, i detta fall FUS toxicitet, måste genereras i en haploida jäst stam med motsatt parning typ (parning typ en). I en hög genomströmning sätt använder sterila 96-pin replikerare, FUS belastningen och jäststammar innehållande plasmid biblioteket överförs till 96 brunnar som innehåller rika medier och tillåtet att mate. Efter parning, en liten volym från varje brunn av parning kultur överförs till 96 brunnar som innehåller syntetiska dropout media i vilka endast diploida jäst som innehåller båda FUS och bibliotek gener kan växa. En robotic tubkikare maskin används sedan överföra jästkultur från varje brunn på agarplattor där uttrycket av FUS och bibliotek generna induceras. Dessutom är jästkultur fläckig för att styra agarplattor där FUS och bibliotek generna inte uttrycks. Efter tillväxt på agarplattor, gener som rädda eller förvärra FUS toxicitet identifieras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Det protokoll som beskrivs här är utformad för screening bibliotek plasmider som ingår i tio 96 brunnar men kan skalas upp eller ner med detta. Protokollet måste upprepas för att slutföra hela biblioteket screening. Vanligtvis, kan screening mot 10 plattor av bibliotek gener varje gång hanteras bekvämt av 1 person.
1. beredning för 96 brunnar jäst omvandling
Obs: Detta steg görs som tidigare beskrivna7,10.
- Alikvotens 5 µL (ca 50-100 ng) av plasmid DNA från en klädd plasmid bibliotek i varje brunn för en runda-bottenplatta med 96 brunnar.
Obs: Ett exempel på sådan ett bibliotek skulle vara en jäst gen överuttryck bibliotek10. - Inokulera 150 mL jäst pepton dextros (YPD) media i en 500 mL-mätkolv med en koloni (2 – 3 mm diameter) av den haploida jästsort W303α. Inkubera dem över natten vid 30 ° C under skakning (200 rpm).
- Följande morgon, mäta OD600 övernattande kultur och späd den jäst kulturen till OD600 = 0,1 i (upp till) 2 L av YPD. Inkubera det vid 30 ° C under skakning (200 rpm) för ~ 5 h tills kulturen når OD600 = 0,4 – 0,6.
2. jäst omvandling
- Skörden jäst kulturen genom att fylla 8 sterila 250 mL centrifug flaskor och centrifugering dem i rumstemperatur vid 3 000 x g i 10 min. Häll av supernatanten utan att störa pelleten.
Obs: Utför alla centrifugering steg vid rumstemperatur. - Tvätta jästen med steril-destillerat H2O. För detta, tillsätt 100 mL steril H2O till varje centrifug flaska och vortex det att resuspendera cellpelleten. Kombinera de tvättade cellerna till 2 flaskor och centrifugera dem vid 3 000 x g för 5 min. Häll av supernatanten.
- Tvätta cellerna i varje flaska i 100 mL 0,1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc; 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA) och centrifugera dem 3 000 x g för 5 min. Häll av supernatanten.
- Samtidigt centrifugering, koka 5 mL av lax spermier DNA (10 mg/mL) vid 100 ° C med en motorvärmare för 3 min och sedan kyla den på is.
- Återsuspendera cellpelleten i 25 mL 0,1 M LiOAc/1XTE i varje flaska, kombinera de återsuspenderade cellerna och överföra dem till en 150 mL kolv. Tillsätt 5 mL av nedkylda lax spermier DNA och inkubera det vid 30 ° C under skakning (225 rpm) i 30 min.
- Häll cell blandningen i en steril engångs reagens reservoir och, med hjälp av en flerkanalspipett, överföra 35 µL av cell blandningen till varje brunn av runda-96 brunnar bottenplattan som innehåller bibliotek plasmiden DNA. Vortex 96-brunnen plattor med en tallrik vortexer för 1 min vid 1000 rpm. Inkubera plattorna för 30 min vid 30 ° C utan att skaka.
Obs: Stapla inte plattorna, så att värmen kan överföra mer effektivt. Vi har funnit att vortexa 96 brunnar plattorna vid 1000 rpm orsakar inte vätska spilla ur brunnarna, men en säker vortex hastigheten bör testas innan utför steg. - I en kolv, förbereda 200 mL transformation bufferten som innehåller en slutlig koncentration på 40% PEG3350, 10% DMSO och 0,1 M LiOAc. Förbereda den omvandling buffert omedelbart före användning och blanda grundligt genom att skaka.
- Ta bort 96 brunnar från 30 ° C inkubatorn och blanda dem för 30 s vid 1000 varv med den platta vortexer. Tillsätt 125 µL av omvandling bufferten till varje brunn och sedan vortex plattorna för 1 min vid 1000 rpm.
- Inkubera plattorna vid 30 ° C under 30 minuter och värm sedan chock jästen genom att placera plattorna i en 42 ° C inkubator för 15 min.
Obs: Stapla inte plattorna. - Centrifugera plattorna under 5 minuter vid 3000 x g. Ta bort omvandling bufferten från brunnarna genom att invertera plattorna över en soptunna och kraftfullt dumpning bufferten från plattorna. Snabbt blot inverterad plattorna på en ren pappershandduk för att avlägsna vätska ovanpå plattorna.
- Skölj cellerna genom att lägga till de plattor 200 µL minimal dropout medium motsvarar den valbara markören på biblioteket Plasmiden.
Obs: Vi använt en syntetisk Ura-medium. - Centrifugera plattorna under 5 minuter vid 3000 x g och avlägsna supernatanten över en soptunna som i steg 2.10.
- Tillsätt 160 µL av minimal Ura-medium innehållande 2% glukos. Virvel pläterar för 1 min vid 1000 rpm och inkubera dem vid 30 ° C för 48 h utan att skaka. Efter 48 h, Observera att en pellet transformerad jäst synlig längst ned i varje brunn.
- Använder en flytande dispenser, tillsätt 100 µL av Ura-media som innehåller glukos i varje brunn en ny uppsättning 96 brunnar.
- Vortex plåtarna som innehåller transformerade jästen (från steg 2.13) vid 1000 rpm för 30 s. med en steril plast 96-pin replicator, placera stiften i brunnar som innehåller transformerade jästen och sedan Inokulera dem i motsvarande brunnar av nya plattor fylld med media. Inkubera nya plattor vid 30 ° C under 24 h.
Obs: Om arbetar med 10 plattor, mediet kan också lämnas ut manuellt med flerkanaligt pipetter. - Efter 24 h, bör en pellet av jäst vara synlig i botten av varje brunn innehållande framgångsrikt transformerat jäst. Om du vill spara dessa jäststammar som glycerol lager, tillsätt 50 μl 50% glycerol i varje brunn, virvel pläterar för 30 s vid 1000 rpm, förslut plattorna med tätningsband och frysa dem vid-80 ° C.
Obs: Ovanstående steg behöver bara utföras en gång. Framtida filmvisningar av annan jäst modeller mot samma bibliotek disponibla reagens reservoaren kan starta från glycerol bestånden och omedelbart gå vidare från stegen nedan.
3. parning mellan celler som innehåller bibliotek gener och fråga jäst
- För att återuppliva de bibliotek stammarna från glycerol lager, ta de 96 brunnar ur-80 ° C frysen, ta bort den tätning band och låt jästen Tina i rumstemperatur i ca 30 min.
- När jästen har tinats, använda en steril plast 96-pin replicator att Inokulera glycerol bestånden till 160 µL av färska Ura-media innehållande 2% glukos i 96 brunnar och inkubera dem vid 30 ° C under 24 h. omedelbart efter stammarna som biblioteket används , förslut plattorna med tätningsband och återföra dem till-80 ° C frysen.
- Samma dag de bibliotek stammarna (W303α) är tinade, Inokulera fråga jäst stam (här, FUS i W303a) till 50 mL YPD och odla den över natten vid 30 ° C under skakning vid 250 rpm.
- Nästa morgon, häll den frågan jäst stammen till en steril engångs reagens reservoir och alikvotens 160 µL fråga stam till varje brunn en plattan med 96 brunnar med hjälp av en flerkanalspipett.
- Använda den flytande dispensern, fördela 160 µL av YPD media i varje brunn av tio 96 brunnar. Använda dessa plattor senare parning den frågan jäst stammen med bibliotek jästen.
- Kort vortex den plattan med 96 brunnar som innehåller frågan stam och sedan använda en steril 96-pin replicator att överföra frågan stam till YPD pläterar.
- Kort vortex biblioteket stam plattor och, för varje bibliotek stam plåt, Använd en ny steril 96-pin replicator för att överföra bibliotek stammar till YPD plattorna som har varit inokuleras med query stam.
Obs: Celler i glycerol förlora sin livskraft efter flera tö-frysa cykler. Återvänder den bibliotek stammar till långtidsförvaring (80 ° C frys) så snart som möjligt kommer att hålla biblioteket i bra kvalitet, och redo för framtida bruk. Underhålls, kan glycerol beståndet frysta och tinade minst 10 gånger. Vi rekommenderar även att hålla en arbetskopia och säkerhetskopior av glycerol beståndet. När arbetar beståndet inte fungerar, omedelbart göra en ny arbetar kopia från säkerhetskopian. - Inkubera plattorna YPD vid 30 ° C under 24 h. Observera att en pellet av jäst kommer att visas längst ned i varje brunn efter 24 h.
- Fyll 96 brunnar med en minimal dropout medium innehållande 2% raffinos, motsvarar de valbara markörerna på plasmiden i fråga stam samt bibliotek plasmiden (t.ex., här Ura - hans-).
- Använd en steril 96-pin replicator för att överföra jäst från den YPD parning kulturer till selektiva media. Inkubera plattorna 96 brunnar vid 30 ° C för 48 h; endast jäst celler som har parat och bildas diploida celler och därför innehåller både fråga plasmiden och bibliotek plasmiden kommer att kunna växa i detta media. Efter 2 dagar, Observera att en pellet är synlig på botten av brunnarna.
4. spotting Assay
-
Efter 48 h tillväxt i raffinos-innehållande selektiv media, spot jästen på agarplattor.
- Förbered 2 uppsättningar av Ura-hans-dropout plattor som innehåller 2% agar med tydlig polystyren plattor, en innehållande 2% galaktos och andra innehållande 2% glukos.
- Vortex 96-brunnen plattor för 1 min vid 1000 rpm, plats sedan jästen att Ura-hans-dropout plattorna som innehåller 2% galaktos och 2% agar (FUS och bibliotek gener induceras) och Ura-hans-dropout plattorna som innehåller 2% glukos och 2% agar (FUS och bibliotek gener förträngt) använder en robotic tubkikare maskin, som kulturen i varje brunn är fläckig på agar plattorna i fyra exemplar (dvskulturen i 1 väl är fläckig till 4 ställen på agarplattan).
- Efter spotting, låt agar plattorna torka, och sedan placera dem upp och ner i en 30 ° C inkubator. Fotografera de agar plattorna varje 24 h att spela in en snabbare/mer jäst tillväxt där toxicitet för fråga stammen räddas eller spela in en långsammare/mindre tillväxt där toxicitet för fråga belastningen förvärras. Inkubera plattorna i 4 dagar.
Obs: Kulturen i varje väl kan upptäckas på agarplattor 1-till-1, som visas i en föregående omvandling metod10. Emellertid, de 1-till-4 spotting här (vilket kan vara bekvämt ställa in maskinen robotic tubkikare) signifikant ökar robustheten av analysen genom att minska antalet falsklarm. Positiva träffar betraktas endast när alla 4 kolonier från samma väl visa en liknande fenotyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ALS-associerade protein FUS, en RNA/DNA-bindande protein, var tidigare studerat i haploida jäst7,8. Genetisk screening med hjälp av metoden omvandling-baserade upptäckte flera jäst gener som undertrycker FUS toxicitet. Den mänskliga homolog av en av generna som jäst visades senare vara effektiva på undertrycka toxicitet i en primär neuronala cell och råtta modell av ALS13. Här, vi använder samma jäst modell för att visa att överuttryck bibliotek screening kan utföras genom parning så effektivt genom omvandling.
FUS är giftigt för både haploida och diploida jästceller
Den tidigare jäst modellen av FUS och efterföljande överuttryck bibliotek screening utfördes i haploida cellbakgrund. Den parning-baserade metod ska fungera, behöver FUS toxicitet påvisas i diploida jäst. Detta gör vi parat FUS jäst modellen i w303a (parning typ en) med w303α förvandlas med en tom vektor (parning typ α). Som anges i figur 2, men inte lika stark som i haploida jäst, är FUS toxicitet tydligt i diploida jäst.
Suppression gener identifierats tidigare arbete i diploida jäst
Som ett bevis på principen för parning-baserade metoden testade vi de fem gener som tidigare identifierats från omvandling-baserade metoden. Parning användes för att introducera varje av de fem generna i den haploida jäst modellen av FUS (i W303a), och deras förmåga att rädda FUS toxicitet i efterföljande diploida jästen testades (W303a/α). Som visas i figur 3, rädda alla fem gener FUS toxicitet i diploida jäst, vilket indikerar att parning metoden var effektiv.
Ett pilotprojekt screening av 940 gener (klädd på tio 96 brunnar)
Efter de protokoll som beskrivs ovan, tillämpat vi metoden parning-baserade på en överuttryck bibliotek screening av 940 gener. Figur 4 visar en bild av en representativ plattan. Som anges på höger sida av bilden (FUS och bibliotek gener uttrycks), var FUS giftigt för diploida jäst. Bibliotek genen indikeras av den gröna fyrkanten räddade FUS toxicitet medan att anges med Röda torget ökad toxicitet.
Figur 1 : Diagram för screening jäst modeller av protein toxicitet med parning. En plasmid bibliotek (under kontroll av promotorn GAL1 som mycket framkallas i närvaro av galaktos) förvandlas till en haploida jäst stam (MATα) med ett högt dataflöde omvandling protokoll. Denna samling av jäst, omvandlas med de bibliotek plasmidsna, lagras som en glycerol lager vid-80 ° C och återupplivas vid behov för att para sig med den haploida jäst modellen av protein toxicitet (i vårt fall, en kopia av FUS integrerade på det HIS3 locus, GAL1 arrangören MATa). Diploida jäst som innehåller bibliotek plasmid och giftigt protein (FUS) väljs och fläckig till glukos (FUS och bibliotek genen 'off') och galaktos (FUS och bibliotek genen 'på') agarplattor. Tillväxten av jäst följdes för att identifiera gener som rädda eller förvärra toxiciteten av FUS. Den gröna rutan visar ett exempel på en suppressor gen som räddar FUS toxicitet, och den röda rutan visar ett exempel på en förstärkare-gen som förvärrar FUS toxicitet när i ökad utsträckning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : FUS är giftigt för både haploida och diploida jästceller. Haploida jäst (w303 MATa) omvandlas med pRS303Gal1-FUS var antingen omvandlas med en tom plasmid eller parad med jäst av motsatt parning typ (w303 MATα) omvandlas med samma tomma plasmiden att generera en diploida jäst stam. Dessa jäststammar tillsammans med en kontroll stam var sedan 5 x seriellt utspädda (från vänster till höger) och fläckig till Ura-hans-glukos medium (vänster, FUS uttryck förträngt) och Ura-hans-galaktosmalabsorption medium (höger, FUS uttryck inducerad). Bilden är tagen efter 2 dagar av tillväxt vid 30 ° C. Nästan identiska tillväxten av det haploida och diploida kontrollisolatet observerades, så bara det haploida kontrollisolatet visades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Fem jäst gener(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1och VHR1) rädda FUS toxicitet genom parning-baserade metoden. Plasmider som innehåller tidigare identifierade jäst gener som undertrycker FUS toxicitet förvandlades till en haploida jäst stam (w303 MATα). Dessa jäst parades sedan med haploida jäst av motsatt parning typ (w303 MATa) förvandlas med en FUS uttryck plasmid. Diploida jäst innehållande FUS och antingen en tom vektor eller en av de fem dämpning generna var markerad och fläckig i replikat på agarplattor som innehåller glukos (gener 'off') och galaktos (gener 'på'). (1) visar en kontroll jäst stam omvandlas med två tomma vektorer. (2) visar den diploida FUS jäst stammen med en tom vektor där uttrycket av FUS är mycket giftigt. (3 – 7) visar diploida jäst uttrycker FUS samt en dämpning gen som kan rädda FUS toxicitet. Varje nummer (1-7) visar två rader med tolv identiska replikerar. Bilden, som representerar tre oberoende experiment, togs efter 3 dagar av tillväxt vid 30 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Biblioteket screening för gener som rädda eller förvärra FUS toxicitet. Haploida jäst som innehåller FUS parades med haploida jäst som innehåller bibliotek generna. Efter parning, diploida celler som innehåller både FUS och en bibliotek gen valdes och sedan fläckig till glukos (FUS och bibliotek gener 'off') och galaktos agarplattor (FUS och bibliotek gener 'på') i fyra exemplar. På galaktos plattan, där FUS och bibliotek genen uttrycktes, kunde de flesta av jäst att växa bra. Detta indikerar att FUS är giftigt och de flesta bibliotek gener inte kunnat rädda toxicitet. Den gröna fyrkanten visar ett exempel på ett bibliotek-gen som dämpar FUS toxicitet och tillåter jästen att bilda kolonier. Den röda rutan visar ett exempel på ett bibliotek-gen som förvärrar FUS toxicitet. De plattor som visas här är representativa för 10 plattor av bibliotek gener som screenades mot. Bilden är tagen efter 3 dagar av tillväxt vid 30 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för att utföra en plasmid överuttryck skärm i jäst med parning för att införa plasmiden biblioteket i jäst modellen. Använder denna metod, kan flera jäst modeller av neurodegenerativa sjukdomar protein toxicitet säkerhetskontrolleras med samma samling av jäst förvandlas med en plasmid bibliotek. Den mödosamma processen med omvandling behöver bara utföras en gång, efter vilken högeffektiva jäst parning används för att införa plasmiden biblioteket i fråga stammen. Detta protokoll förlitar sig på användningen av robotliknande utrustning att avstå från media och spot jäst kulturer på agarplattor. Medan protokollet kan utföras utan användning av robotliknande utrustning, blir det mer tidskrävande. Denna metod var framgångsrikt används till skärmen för gener som kan ändra toxiciteten av FUS.
Vi observerade att FUS är något mindre giftigt i diploida jäst bakgrunden. Detta är troligtvis på grund av genen kopienummer och skillnader i tillväxttakt diploida jäst. Om inte den fenotyp som undersöks är parning typ eller ploiditeten-beroende, tillväxt fenotypen av toxiciteten är konsekvent haploida och diploida jäst. På grund av detta förväntas parning-baserade metoden arbeta allmänt i många jäst modeller av olika tillväxt fenotyper. Fenotypen av jäst modellen bör dock kontrolleras för att se till att det finns kvar i diploida bakgrunden innan denna screeningmetod utförs. Denna metod kan användas för att studera många olika fenotyper i jäst och är inte begränsat till studiet av neurodegenerativa protein toxicitet. Dessutom kan eventuella plasmid bibliotek innehållande jäst uttryck vektorer användas.
Efter utför skärmen, finns det ett antal kontroll-analyser som hjälper till att säkerställa identifierade träffar är specifika för den jäst modellen att vara skärmad. Förstärkare för toxicitet bör testas i jäst utan samtidig uttrycker proteinet sjukdom av intresse. Smakförstärkare som orsakar toxicitet oberoende av proteinet sjukdom av intresse bör tas bort från vidare studier. Det är viktigt att överväga huruvida dämpning av toxicitet påverkar uttrycket av proteinet sjukdom genom att påverka Gal1 arrangören. Någon dämpning som påverkar uttryck från Promotorn Gal1 bör tas bort från vidare studier.
Jäststammar som innehåller bibliotek plasmiden lagras permanent i glycerol lager och kan återupplivas snabbt när det behövs så att parning-baserade metoden kan enkelt tillämpas på andra jäst modeller där samma bibliotek gener måste vara avskärmade mot. Effektiviteten i metoden parning-baserade blir uppenbart när samma typ av screening används för att ta bort falska positiva eller när flera olika jäst modeller måste studeras. Vi har framgångsrikt använt denna metod för att skärmen en jäst modell TDP-43, ett annat protein kopplade till ALS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för de tankeväckande diskussionerna med medlemmar av JUEN laboratoriet och Zhong laboratorium och det ekonomiska stödet från Wright State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
