Summary
Denne artikkelen presenterer en parring-basert metode for å lette overuttrykte screening i spirende gjær bruker en plassert plasmider biblioteket.
Abstract
Spirende gjær har vært mye brukt som modell i å studere proteiner knyttet til menneskelige sykdommer. Genomet hele genetisk screening er et kraftig verktøy som vanligvis brukes i gjær studier. Uttrykk for en rekke nevrodegenerative sykdomsassosierte proteiner i gjær fører cytotoksisitet og samlet formasjon, recapitulating funn sett hos pasienter med disse lidelser. Her beskriver vi en metode for screening gjær modell av amyotrofisk Lateral sklerose-assosiert protein FUS for modifikatorer sin toksisitet. Istedet for benytter transformasjon, avhengig denne nye screening plattformen mating av gjær å innføre et plassert bibliotek av plasmider i gjær modellen. Parring metoden har to klare fordeler: for det første er svært effektiv; andre kan pre transformert plassert biblioteket av plasmider lagres for langsiktige som en glyserol lager og raskt anvendt til andre skjermer uten arbeidskrevende trinn av transformasjon i gjær modellen hver gang. Vi viser hvordan denne metoden kan med hell brukes til skjermen for tilblivelse endre toksisitet av Fu.
Introduction
Spirende gjær Saccharomyces cerevisiae har vært mye brukt i grunnleggende forskning1 for å forstå cellulære prosesser direkte knyttet til menneskelige sykdommer. Dessuten, det har blitt brukt som en modell organisme for studerer menneskelig sykdomsassosierte proteiner, slik som knyttet til de vanligste nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom og amyotrofisk Lateral sklerose (ALS)2. En fordel med gjær modellen er enkelt som et genom-widescreen kan utføres for å identifisere mobilnettet veiene gjelder toksisitet av sykdom-relaterte proteiner, dermed gi innsikt i mekanismen av giftigheten. En slik skjerm kalles en overuttrykte biblioteket skjerm, der hver av 5500 gjær genene i en plassert biblioteket er forvandlet til en gjær-modellen for å identifisere hvilke gener kan endre toksisitet når overexpressed. Denne metoden screening har vært anvendt gjær modeller av flere nevrodegenerative sykdomsassosierte proteiner, inkludert huntingtin for Huntingtons sykdom3, α-synuclein for Parkinsons sykdom4,5 , Aβ for Alzheimers6, og Fu og TDP-43 for ALS7,8,9. Mens det er vanligvis gjort i en høy gjennomstrømming måte10, transformerer det mest arbeidskrevende trinnet av skjermen individuelt 5500 gjær gener fra et plassert bibliotek. Dette trinnet må utføres hver gang Screeningen gjentas, og når en nyetablerte gjær modellen må studeres. Det er viktig å finne en mer effektiv måte å utføre denne oppgaven.
Gjærceller kan stabilt finnes i både haploid og diploide. Det er to motsatte mating haploid cellene, parring type en og α. Haploid celler av hver mating produserer og skiller ut sine egne spesifikke parring feromon, som bare de motsatte parring type cellene reagerer. Dette gjør mating imellom en og α celler til å produsere stabil diploide celler, en/α. Denne prosessen er spontan og svært effektiv11. Vi kan dra nytte av denne unike livssyklusen til S. cerevisiae å innføre plasmider biblioteket. Mer spesifikt, vil hver genet i plassert plasmider biblioteket bli forvandlet til haploid celler av en parring type, dvs, α-cellen. Disse cellene som inneholder biblioteket genene lagres deretter på glyserol lager i plassert 96-brønns format. For hver gjær modell som skal bli vist, gjærceller som inneholder biblioteket genene kan være tint fra glyserol lager og screening kan gjøres gjennom parring med gjær modell av interesse i motsatt parring type, dvsparring type en. Denne ideen om å bruke parring for å bringe sammen to gener i gjær er ikke nytt. Det har vært anvendt i høy gjennomstrømming gjær to-hybrid screening, som et agn konstruere (dvs.Gal4-DNA-bindende domene fusjoner) i én parring er samlet gjennom parring med en prey konstruere fra et plassert bibliotek 12. men denne strategien er aldri brukt i overuttrykte bibliotek screenings, som alltid har brukt tradisjonelle transformasjon metoder.
Vårt laboratorium etablerte gjær modell av ALS-assosiert protein FUS7. Gjennom overuttrykte biblioteket screening med metoden transformasjon oppdaget vi fem gjær gener (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1og VHR1) som redde toksisitet av FUS når overexpressed. Disse funnene ble uavhengig bekreftet med en liknende studie av en annen gruppe8. hUPF1, en menneskelig homolog av ECM32, ble vist å undertrykke toksisitet i primære neuronal celler13 og i en dyremodell ALS14 også. Bruke disse fem gener som bevis på prinsippet, viser vi at alle fem gener tilsvarende redde FUS toksisitet når de blir introdusert inn i FUS gjær modellen av parring. Siden gjærceller som inneholder biblioteket genene kan lagret permanent på glyserol lager og gjenopplivet når nødvendig, fjernes denne parring-basert metode tidkrevende trinn av transformasjon hver gang biblioteket må bli vist mot. Siden parring er svært effektiv med ingen plasmider transformasjon involvert, reduserer denne strategien også betydelig kostnadene forbundet med rensing og transformasjon av et stort plasmider bibliotek. Vi vil kunne bruke denne metoden et bibliotek screening mot gjær modell av Fu.
Fremgangsmåten for parring-basert screening er kort beskrevet i figur 1. I utgangspunktet er plassert plasmider biblioteket forvandlet til en haploid gjær stamme av parring type α bruker en høy gjennomstrømming gjær transformasjon protokoll der hver brønn av en 96-brønns plate inneholder gjær forvandlet en bestemt bibliotek plasmider. Denne samlingen av transformert gjær lagres som en glyserol lager som kan Tint og gjenopplivet for bruk senere. Gjær modellen av interesse, i dette tilfellet FUS toksisitet, må genereres i en haploid gjær belastning med motsatt parring type (parring type en). I en høy gjennomstrømming måte bruke sterilt 96-pinners replikatorer, Fu påkjenningen og gjær påkjenningen inneholder plasmider biblioteket overført til 96-brønns plater som inneholder rik media og lov til å mate. Etter parring, et lite volum fra hver brønn parring kultur overføres til 96-brønns plater som inneholder syntetisk dropout medier i som bare diploide gjær som inneholder begge Fu og biblioteket gener kan vokse. En robot småblødninger maskin brukes deretter overføre gjær kultur fra hver brønn på agar plater der uttrykk for Fu og biblioteket genene er indusert. I tillegg er gjær kultur oppdaget for å kontrollere agar plater der Fu og biblioteket genene ikke er uttrykk. Etter vekst på agar plater, gener som redde eller forverre FUS toksisitet vil bli identifisert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Protokollen beskrevet her er beregnet for screening biblioteket plasmider i ti 96-brønns plater, men kan skaleres opp eller ned tilsvarende. Protokollen må gjentas for å fullføre hele biblioteket screening. Vanligvis kan screening mot 10 plater av biblioteket gener hver gang komfortabelt håndteres av 1 person.
1. forberedelse til 96-brønns gjær transformasjon
Merk: Dette trinnet er gjort som tidligere beskrevet7,10.
- Aliquot 5 µL (ca 50-100 ng) av plasmider DNA fra en plassert plasmider biblioteket i hver brønn av en runde 96-brønnen-bunnplaten.
Merk: Et eksempel på slik en bibliotek ville være en gjær genet overuttrykte biblioteket10. - Vaksinere 150 mL gjær pepton druesukker (YPD) medium i en 500 mL kolbe med en koloni (2-3 mm diameter) av haploid gjær belastning W303α. Inkuber dem over natten på 30 ° C med skjelvende (200 rpm).
- Neste morgen, måle OD600 av natten kultur og fortynne gjær kulturen OD600 = 0,1 (opptil) 2 l av YPD. Inkuber det ved 30 ° C med skjelvende (200 rpm) ~ 5 h til kultur når OD600 = 0,4-0.6.
2. gjær transformasjon
- Innhøstingen gjær kulturen ved å fylle 8 sterilt 250 mL sentrifuge flasker og sentrifugering dem ved romtemperatur 3000 x g for 10 min. hell av nedbryting uten å forstyrre pellet.
Merk: Utfør alle sentrifugering trinnene ved romtemperatur. - Vask gjær med sterilt-destillert H2O. For dette, legge 100 mL steril H2O til hver sentrifuge flaske og vortex den resuspend cellen pellets. Kombinere vasket cellene i 2 flasker og sentrifuger på 3000 x g for 5 min. hell av nedbryting.
- Vask cellene i hver flaske i 100 mL 0.1 M LiOAc/1XTE (100 mM LiOAc, 10 mM Tris, pH 8.0; 1 mM EDTA) og sentrifuge dem 3000 x g for 5 min. hell av nedbryting.
- Mens sentrifugering, koke 5 mL av laks sæd DNA (10 mg/mL) ved 100 ° C med en blokk-ovn for 3 min og deretter avkjøles den på is.
- Resuspend celle pellet i 25 mL 0.1 M LiOAc/1XTE i hver flaske, kombinere resuspended cellene og overføre dem til en 150 mL kolbe. Legg til 5 mL av pre-avkjølt laks sperm DNA og ruge det ved 30 ° C med skjelvende (225 rpm) i 30 min.
- Hell blandingen cellen i et sterilt disponibel reagens reservoar, og bruke en flerkanals pipette, overføre 35 µL av cellen blandingen i hver brønn av runde-96-brønns bunnplaten inneholder biblioteket plasmider DNA. Vortex 96-brønnen plater med en plate vortexer for 1 min på 1000 rpm. Inkuber platene i 30 min på 30 ° C uten å riste.
Merk: Ikke stabelen platene, slik at varmen kan overføre mer effektivt. Vi har funnet at vortexing 96-brønns platene på 1000 rpm forårsaker ikke væsken renne ut av brønnene, men en sikker vortex hastighet bør testes før trinnet. - I en bolle, forberede 200 mL transformasjon bufferen inneholder en siste konsentrasjon av 40% PEG3350, 10% DMSO og 0.1 M LiOAc. Forberede transformasjon bufferen umiddelbart før bruk og bland det godt ved å riste.
- Fjern 96-brønns plater settefiskanlegg 30 ° C og bland dem for 30 s på 1000 rpm med platen vortexer. Legge 125 µL av transformasjon bufferen til hver brønn og deretter vortex platene for 1 min på 1000 rpm.
- Inkuber platene på 30 ° C i 30 min og deretter varme sjokk gjær ved å plassere plater i en 42 ° C inkubator i 15 min.
Merk: Ikke stabelen platene. - Sentrifuge platene i 5 min på 3000 x g. Fjern transformasjon bufferen fra brønnene snu platene over søppelbøtten og kraftig dumping bufferen fra platene. Raskt blot invertert platene på et rent papirhåndkle fjerne væske på platene.
- Skyll cellene ved å legge til plater 200 µL av minimal dropout middels tilsvarende valgbar markøren biblioteket plasmider.
Merk: Vi brukte en syntetisk Ura-medium. - Sentrifuge platene i 5 min på 3000 x g og fjerne nedbryting over søppelbøtten som i trinn 2.10.
- Legge til 160 µL av minimal Ura mellomstore som inneholder 2% glukose. Vortex platene for 1 min på 1000 rpm og Inkuber dem ved 30 ° C i 48 timer uten risting. Etter 48 timer, Merk at pellets transformert gjær er synlig nederst hver brønn.
- Bruker en flytende dispenser, legge til 100 µL av Ura medier som inneholder glukose i hver brønn av et nytt sett med 96-brønns plater.
- Vortex platene som inneholder transformert gjær (fra trinn 2.13) på 1000 rpm for 30 s. bruker en steril plast 96-pinners replikator, plassere pinnene i brønnene som inneholder transformert gjær og deretter vaksinere dem inn i tilsvarende brønnene av nye platene fylt med media. Inkuber nye plater på 30 ° C i 24 timer.
Merk: Hvis jobber med 10 plater, mediet kan også bli utlevert manuelt med flerkanals pipetter. - Etter 24 timer skal pellets gjær vises i bunnen av hver brønn som inneholder ble transformert gjær. For å lagre disse gjær påkjenningen som glyserol aksjer, tilsett 50 µL 50% glyserol hver brønn, vortex platene for 30 s på 1000 rpm, forsegle platene med tetting tape og fryse dem på-80 ° C.
Merk: Trinnene ovenfor trenger bare å utføres èn gang. Fremtidige screenings av ulike gjær modeller mot samme bibliotek disponibel reagens reservoaret kan starte fra glyserol aksjer og går umiddelbart fra trinnene nedenfor.
3. parring mellom cellene som inneholder biblioteket gener og spørring gjær
- For å gjenopplive den bibliotek stammer fra glyserol lager, ta 96-brønns platene av-80 ° C fryseren, Fjern tetting tape, og la gjær tine i romtemperatur i ca 30 min.
- Når gjær har tint, bruk en steril plast 96-pinners replikator til å vaksinere glyserol aksjer du 160 µL av fersk Ura medier som inneholder 2% glukose i 96-brønnen plater og ruge dem ved 30 ° C i 24 h. straks biblioteket stammene brukes , forsegle platene med tetting tape, og returnere dem til-80 ° C fryseren.
- På samme dag biblioteket stammer (W303α) er tint, vaksinere spørringen gjær påkjenningen (her, Fu i W303a) å 50 mL av YPD og vokse det overnatting på 30 ° C med skjelvende på 250 rpm.
- Neste morgen, hell spørringen gjær påkjenningen et sterilt disponibel reagens reservoar og aliquot 160 µL av spørringen belastningen i hver brønn av en 96-brønns plate med en flerkanals pipette.
- Bruker flytende dispenser, dispensere 160 µL av YPD media i hver brønn av ti 96-brønns plater. Bruk disse platene senere for parring spørringen gjær påkjenningen med biblioteket gjær.
- Kort vortex 96-brønns platen inneholder spørring belastning og bruk en steril 96-pinners replikator overføre spørringen belastning å YPD platene.
- Kort vortex biblioteket belastning plater, og for hvert bibliotek belastning plate, bruke en ny sterilt 96-pinners replikator overføre biblioteket stammene til YPD platene som har vært inokulert med spørringen belastningen.
Merk: Celler i glyserol mister sin levedyktighet etter flere Tin-fryse sykluser. Tilbake biblioteket stammene til lagring (-80 ° C fryser) så snart som mulig vil holde biblioteket i god kvalitet, og klar for fremtidig bruk. Skikkelig vedlikeholdt, kan glyserol aksjen være frosset og tint minst 10 ganger. Vi anbefaler også sterkt å holde en arbeidskopi og sikkerhetskopier av glyserol aksjen. Når aksjen arbeider ikke fungerer, umiddelbart gjøre en ny arbeider Kopier fra sikkerhetskopien. - Inkuber YPD platene på 30 ° C i 24 h. Merk at pellets gjær blir synlig nederst hver brønn etter 24 timer.
- Fyll 96-brønns plater med en minimal dropout medium som inneholder 2% raffinose, tilsvarer valgbar markører plasmider i spørringen belastningen og biblioteket plasmider (f.eksher Ura - hans-).
- Bruk en steril 96-pinners replikator overføre gjær fra YPD parring kulturer til selektiv media. Inkuber 96-brønns platene på 30 ° C i 48 timer; bare gjær celler som har paret og dannet diploide celler og derfor inneholder både den spørringen plasmider og biblioteket plasmider vil kunne vokse i dette mediet. Etter 2 dager, observere at pellets er synlig på bunnen av brønnene.
4. se analysen
-
Etter 48t av veksten i raffinose inneholder selektiv media, spot gjær på agar plater.
- Forberede 2 sett med Ura-hans-dropout plater som inneholder 2% agar klart polystyren plater, én som inneholder 2% galaktose og andre som inneholder 2% glukose.
- Vortex 96-brønnen plater for 1 min på 1000 rpm, deretter oppdage gjær Ura-hans-dropout platene som inneholder 2% galaktose og 2% agar (FUS og biblioteket gener er indusert) og Ura-hans-dropout platene som inneholder 2% glukose og 2% agar (FUS og biblioteket gener undertrykt) bruker en robot småblødninger maskin, som kulturen i hver vel er oppdaget på agar plater i quadruplicate (dvs.kulturen i 1 godt er oppdaget til 4 plassene på agar platen).
- Etter spotting, la agar platene tørr, og deretter sett dem opp ned i en 30 ° C inkubator. Fotografere agar plater hver 24 h registrere en raskere/mer gjær vekst som toksisitet til spørringen belastning er reddet eller registrere en tregere/mindre vekst som toksisitet til spørringen belastning er forsterket. Inkuber platene for 4 dager.
Merk: Kulturen i hver godt kan bli sett på agar plater 1-til-1, som vist i en tidligere transformasjon-basert metode10. Men, 1-til-4 småblødninger her (som kan være praktisk satt opp med robot småblødninger maskinen) øker robust analysen ved å redusere antall falske positiver. Positiv treff anses bare når alle 4 kolonier fra samme vel viser en lignende fenotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ALS-assosiert protein Fu, en RNA/DNA bindende protein, ble tidligere studert i haploid gjær7,8. Genetisk screening ved hjelp av metoden transformasjon-baserte oppdaget flere gjær gener som undertrykker FUS toksisitet. Den menneskelige homolog av en av gjær genene ble senere vist for å være effektiv på undertrykke toksisitet primære neuronal cellen og rotte modell av ALS13. Her, vi bruker samme gjær modell for å vise at overuttrykte bibliotek screening kan utføres av parring effektivt ved transformasjon.
FUS er giftig for både haploid og diploide gjærceller
Forrige gjær modell av Fu og påfølgende overuttrykte biblioteket screening ble utført i haploid cellebakgrunnen. For metoden parring-baserte arbeide må FUS toksisitet påvises i diploide gjær. Dette gjør vi parret FUS gjær modellen i w303a (parring type en) med w303α forvandlet med en tom vektor (parring type α). Som vist i figur 2, men ikke så sterk som i haploid gjær, er Fu toksisitet tydelig i diploide gjær.
Undertrykkelse gener tidligere identifisert innarbeide diploide gjær
Som et bevis på prinsippet for metoden parring-basert testet vi fem genene tidligere identifisert fra metoden transformasjon-basert. Parring ble brukt til å presentere hver av de fem genene i haploid gjær modell av FUS (i W303a), og deres evne til å redde toksisitet av FUS i påfølgende diploide gjær ble testet (W303a/α). Som vist i Figur 3, redde alle fem gener toksisitet av FUS i diploide gjær, som indikerer at metoden parring var effektivt.
En pilot screening av 940 gener (plassert på ti 96-brønns plater)
Følgende protokoller som beskrevet ovenfor, brukt vi metoden parring-basert til en overuttrykte biblioteket screening av 940 gener. Figur 4 viser et bilde av en representant plate. Som vist på høyre side av figuren (FUS og biblioteket gener uttrykt), var Fu giftig for diploide gjær. Biblioteket genet angis av den grønne firkanten reddet FUS toksisitet mens som den røde firkanten forbedret toksisitet.
Figur 1 : Diagram for screening gjær modeller av protein toksisitet bruker parring. Et plasmider bibliotek (under kontroll GAL1 som er svært indusert i nærvær av galaktose) er forvandlet til en haploid gjær belastning (MATα) bruker en høy gjennomstrømming transformasjon protokoll. Denne samlingen av gjær, forvandlet biblioteket plasmider, lagres som en glyserol lager ved-80 ° C, og gjenopplivet ved behov å pare med haploid gjær modell av protein toksisitet (i vårt tilfelle, en kopi av FUS integrert på HIS3 locus, GAL1 arrangøren MATa). Diploide gjær som inneholder biblioteket plasmider og giftige protein (FUS) velges og oppdaget glukose (FUS og bibliotek gen "off") og galaktose (Fu og bibliotek gen "på") agar plater. Veksten av gjær ble fulgt for å identifisere gener som redde eller forverre toksisitet av Fu. Den grønne firkanten angir et eksempel på en suppressor genet som redder FUS toksisitet, og den røde firkanten angir et eksempel på en enhancer genet at exacerbates FUS toksisitet når overexpressed. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Fu er giftig for både haploid og diploide gjærceller. Haploid gjær (w303 MATa) forvandlet med pRS303Gal1-Fu er forvandlet en tom plasmider eller parret med gjær av motsatt parring type (w303 MATα) forvandlet den samme tom plasmider å generere en diploide gjær belastninger. Disse gjær påkjenningen sammen med en kontroll belastning ble deretter 5 x serielt utvannet (fra venstre til høyre) og flekket Ura-hans-glukose medium (venstre, Fu uttrykk undertrykt) og Ura-hans-galaktose medium (høyre, Fu uttrykk indusert). Bildet ble tatt etter 2 dager med vekst på 30 ° C. Nesten identisk veksten av haploid og diploide belastningen ble observert, så bare haploid kontroll belastningen ble vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Fem gjær gener (ECM32, NAM8, SBP1, SKO1og VHR1) redde FUS toksisitet gjennom parring-basert metode. Plasmider inneholder tidligere identifisert gjær gener som undertrykker FUS toksisitet ble forvandlet til en haploid gjær belastning (w303 MATα). Disse gjær ble deretter parret med haploid gjær av motsatt parring type (w303 MATa) forvandlet en Fu uttrykk plasmider. Diploide gjær som inneholder Fu og en tom vektor eller en av fem undertrykkelse genene ble valgt og flekkete i gjentak agar plater som inneholder glukose (gener 'av') og galaktose (gener "på"). (1) viser en kontroll gjær belastninger forvandlet med to tomme vektorer. (2) viser diploide Fu gjær påkjenningen med en tom vektor der uttrykk for Fu er svært giftig. (3 – 7) viser diploide gjær uttrykke FUS samt en undertrykkelse genet som kan redde FUS toksisitet. Hvert tall (1 – 7) viser to rader med tolv identiske replikerer. Bildet, som representerer tre uavhengige eksperimenter, ble tatt etter 3 dager for vekst på 30 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Biblioteket screening for gener som redde eller forverre FUS toksisitet. Haploid gjær som inneholder FUS ble paret med haploid gjær som inneholder biblioteket gener. Etter parring, ble diploide celler som inneholder både Fu og et bibliotek gen valgt og deretter oppdaget glukose (FUS og biblioteket gener 'av') og galaktose agar plater (FUS og biblioteket gener "på") i quadruplicate. På galaktose plate, der Fu og biblioteket genet ble uttrykt, klarte de fleste av gjær ikke å vokse godt. Dette indikerer at Fu er giftig og de fleste biblioteket gener klarte ikke å redde toksisitet. Den grønne firkanten viser et eksempel med et bibliotek som undertrykker FUS toksisitet og lar gjær til skjemaet kolonier. Den røde firkanten angir et eksempel på et bibliotek gen at exacerbates FUS toksisitet. Platene vises her er representant for 10 plater av biblioteket gener som ble vist mot. Bildet ble tatt etter 3 dager for vekst på 30 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for å utføre en plasmider overuttrykte skjerm i gjær bruker parring for å innføre plasmider biblioteket i gjær modellen. Bruker denne tilnærmingen, kan flere gjær modeller neurodegenerative sykdom protein toksisitet bli vist med samme samling av gjær forvandlet med plasmider biblioteker. Møysommelige prosessen med transformasjon må bare utføres når, etter som svært effektiv gjær parring brukes å innføre plasmider biblioteket i spørringen belastningen. Denne protokollen avhengige av bruk av robot-utstyr til å dispensere media og spot gjær kulturer på agar plater. Mens protokollen kan utføres uten bruk av robot-utstyr, vil det være mer tidkrevende. Denne metoden var pleide å skjermen for tilblivelse kan endre toksisitet av Fu.
Vi observerte at Fu er litt mindre giftig i diploide gjær bakgrunnen. Dette er mest sannsynlig genet antall kopier og forskjeller i veksten av diploide gjær. Med mindre fenotypen som blir undersøkt er parring type eller ploidy-avhengige, vekst fenotypen av toksisitet er konsekvent i haploid og diploide gjær. Derfor er parring-baserte metoden forventet å jobbe mye i mange gjær modeller av ulike vekst fenotyper. Likevel må fenotypen av gjær modellen bekreftes sørge for at det er fortsatt til stede i diploide bakgrunnen før denne metoden screening utføres. Denne metoden kan brukes til å studere mange Norge i gjær og er ikke begrenset til studiet av nevrodegenerative protein toksisitet. I tillegg kan noen plasmider biblioteket inneholder gjær uttrykk vektorer brukes.
Etter utfører skjermen, er det en rekke bekreftelse analyser som vil bidra til å sikre de identifiserte treffene er spesifikke for gjær modellen er vist. Enhancers toksisitet bør testes i gjær uten co uttrykke sykdom protein av interesse. Enhancers forårsaker toksisitet uavhengig av sykdom protein av interesse bør elimineres fra videre studier. Det er viktig å vurdere om suppressors toksisitet påvirker uttrykk for sykdom protein ved å påvirke Gal1 arrangøren. Noen suppressors påvirker uttrykk fra Gal1 Promotøren bør elimineres fra videre studier.
Gjær påkjenningen inneholder biblioteket plasmider lagres permanent i glyserol lager og kan bli raskt gjenopplivet ved behov slik at metoden parring-baserte kan lett brukes på andre gjær modeller der samme bibliotek gener må bli vist mot. Effektiviteten av metoden parring-baserte blir åpenbart når den samme typen screening brukes til å fjerne falske positiver eller flere ulike gjær modeller må studeres. Vi har brukt denne metoden for å skjermen en gjær modell av TDP-43, en annen protein knyttet til ALS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for de gjennomtenkte diskusjonene med medlemmer av Ju laboratoriet og Zhong laboratorium og økonomisk støtte fra Wright State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
