Biochemistry

ダイコン品種使用 PNGase H⁺からN型糖鎖の解析

Published: June 25, 2018 doi: 10.3791/57979

Ya-Min Du¹, Shen-Li Zheng¹, Li Liu¹, Josef Voglmeir¹, Gabriel Yedid²

¹Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, ²College of Life Science, Nanjing Agricultural University

Summary

簡便・迅速な準備と大根 (ダイコン) の品種間におけるN型糖鎖の解析法について述べる。

Abstract

近年、植物の糖鎖は、十字反応、アレルギー誘発の免疫応答の潜在的なソースは、かなりの注目を受けた。さらに、炭水化物の構造はまた植物の代謝に重要な役割を果たします。簡便・迅速な準備と、 N型糖鎖大根 (ダイコン) の品種から植物由来の炭水化物構造の解放のためのN- glycanase 固有を使用しての分析法を紹介します。これを達成するには、大根ホモジネートの原油のトリクロロ酸析出された PNGase H⁺で扱われ、蛍光タグとして 2 aminobenzamide を使用してラベル付け。ラベル付きのN型糖鎖のサンプルを超高性能液体クロマトグラフィー (高精度) 分離して飛行 (MALDI-TOF) 質量分析法による詳細な構造のマトリックス支援レーザー脱離イオン化時間行った後評価と大根由来のN型糖鎖構造の相対的な abundancies を定量化します。このプロトコルは、他の各種の植物の種からN型糖鎖の解析も使用でき、関数のさらなる調査と人間の健康に及ぼすN型糖鎖の役に立つかもしれません。

Introduction

植物におけるN型糖鎖が注目増加近年、前の研究がアレルギー反応¹^,^{2 を引き起こすかもしれない免疫の内の潜在的なソースとしてN型糖鎖をハイライト表示します。}.それが実証されて以前植物糖タンパク質糖鎖のNは、触媒活性³^,⁴、耐熱性と折りたたみ式⁵^,⁶または細胞レベル下のローカリゼーションに影響を与えることができ、分泌⁷。糖鎖構造をそれぞれの機能に関連付ける、するためにN型糖鎖最初から解放しなければならない糖タンパク質化学的にまたは酵素によって。N- とO型糖鎖を解放するための古典的な化学方法は β-除去するアルカリサンプル治療と一緒に伴われる還元糖アルコール⁸を生成する水素化ホウ素。ただし、この手順は、蛍光でラベルを排除、糖鎖構造の還元末端から単糖類の単位の重要な崩壊を引き起こします。水酸化アンモニウム炭酸塩治療に基づいて化学糖鎖切り出しも一般的に使用される代替方法⁹です。これらの化学物質の放出方法のどちらも同じ質量範囲にラベルのない糖ペプチドフラグメントの干渉なしプールの質量分析が可能そのまま蛋白質が低下します。ただし、これらのメソッドの 1 つの欠点である α 1, 3 次N型糖鎖の増加の分解速度は共通の炭水化物構造植物¹⁰。また、ペプチドを用いた酵素リリース方法:N- 多糖分解酵素 (PNGases、EC 3.5.1.52) も広く適用されています。(病菌 meningosepticum) から組換え PNGase F は最も一般的な選択であり、コア α 1, 3 フコース¹¹^,¹²軸受構造を除いて、 N型糖鎖のすべてのタイプのリリースを許可します。したがって、PNGase A (アーモンドの種子から分離された) は通常植物¹³ N型糖鎖の解析に使用されます。しかし、この酵素 deglycosylates のみ生由来ペプチド、deglycosylate ネイティブ糖¹⁴ことができないと。したがって、詳細な分析、糖、低豊富¹⁵の特にそれらの広汎な損失を引き起こす前にマルチステップサンプル精密検査が必要です。メソッドの全体的な目標は、 N型糖鎖のリリースとシンプルで堅牢な方法で蛍光のために最適化されたワークフローを提示することです。基になる根拠は PNGase H⁺ Terriglobus ニチニチソウの最近発見された recombinantly , 大腸菌で発現することができます、ことができる酸性のタンパク質足場から直接N型糖鎖を加水分解条件¹⁶。PNGase H⁺を使った代替方法の主な利点は、反応バッファー¹⁷^,¹⁸を変更することがなく同じ反応管内の蛍光標識反応が可能です。簡単な調製条件と低豊富なオリゴ糖の高回収率このメソッドは、 N型糖鎖の解析で貴重なツールを作る。このプロトコルは、さまざまな植物の種からN型糖鎖の解析に適しています。

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Protocol

1. サンプルコレクション

新鮮な大根 (ダイコン) の異なる品種を購入します。

2. 大根から蛋白質の分離

10 分間キッチンミキサーで新鮮な大根の約 100 g をホモジナイズしてください。
50 mL の遠心管と不溶性物質を削除する 20 分のための 4 ° C で 14,000 × gで遠心スラリーに転送します。
新しい 50 mL 遠心チューブに上清を慎重に転送し、2 M トリクロロ酢酸 (TCA) ソリューションの等しい量を追加します。
注: TCA を追加は、水溶性 (糖) タンパク質を沈殿させます。
4 ° C、30 分で 14,000 × gで遠心分離機、ペレット (糖) 蛋白質から上澄みを取り外します。
14,000 × g水溶性オリゴ糖や多糖類を削除する 5 分の 4 ° c で 20 ml の脱イオン水と遠心分離機のペレットを洗浄します。
手順 2.5 を繰り返します。4 回。
再 1 mL の脱イオン水と新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに転送でペレットを中断します。

3. N型糖鎖の調製

手順 2.7 からタンパク質溶液のミックス 50 μ L。(新鮮な大根の 5 g に等しい) 組換え PNGase h⁺10 mM 酢酸 0.2 mu。
12 h の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。、孵化後余分な蛋白質および酵素を削除する 5 分 14,000 × gで遠心分離機します。
新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに上清を転送します。

4 N型糖鎖の精製

N型糖鎖を豊かにし、 N型糖鎖の蛍光 2 aminobenzamide (2 AB) ラベルエージェントの選択性を増やす反応混合物から塩および他の不純物を削除する固相抽出 (SPE) の列を準備します。誘導体化。
1. 3 mL の脱イオン水を洗い流すを追加します。
2. アクティブにトリフルオロ酢酸 (TFA, 0.1 %v/v) を含む 80% アセトニトリル溶液 3 mL SPE カラムを追加します。
3. SPE コラムを平衡させ脱イオン水 3 mL を追加します。
ステップ 3.3 列上からサンプルを転送し、流れを破棄します。
1.5 mL の脱イオン水コラムを洗浄し、流れを破棄するを追加します。
1.5 mL の 0.1% を含む 20% アセトニトリル水溶液を使用して、列からリリースされたN型糖鎖を溶出 TFA (v/v) 2 mL の遠心管に。
室温で遠心蒸発溶剤を削除します。このサンプルは、完全に乾燥するまでに蒸発させます。

5 N型糖鎖の蛍光誘導体化

35 mM 2 AB と 0.1 M ナトリウムシアノ水素化ホウ素ジメチルジメチルスルホキシド/酢酸酸溶液 (7:3 v/v) から成る、2 AB 溶液 1 mL を準備します。
六つの異なる大根由来の乾燥サンプル (ステップ 4.5.) 2 AB ソリューションの 5 μ L を追加します。渦各サンプルまで完全に分解します。
65 ° C で 2 h の混合物を孵化させなさい
5 分間室温までサンプルの涼しい許可し、5 μ L の脱イオン水とアセトニトリル 40 μ L を追加します。3 分間 14,000 x g でチューブを遠心します。
300 μ L 高回復高速液体クロマトグラフィーバイアルに上澄みから 48 μ L を転送します。1 ヶ月の-20 ° C で derivatized のN型糖鎖のサンプルを格納します。

6. 構築高精度のN型糖鎖のプロファイリング

それぞれ 330 nm/420 nm の励起/蛍光波長オンライン蛍光 detectorset に接続されている標準の高精度システムを使用してサンプルを分析します。
疎水性相互作用クロマトグラフィー (構築) を使用して-分析のための 60 ° C のカラム温度の高精度糖鎖列。
50 mL の原液 (1 M, ギ酸アンモニウム溶液、pH 4.5) の液体クロマトグラフィー質量分析計 (LCMS) 950 mL で希釈することによって溶剤 A を準備-水のグレードします。とおり、在庫ソリューションを準備します。
1. LCMS グレード H₂O を 700 mL にギ酸の 43 mL を追加します。
2. (奥行 25% アンモニア水を滴下して 4.5 に pH を調整します。
3. 溶媒をメスシリンダーに転送し、3 ヵ月の LCMS グレード H₂o. ストア 4-6 ° c と 1000 mL を入力します。
溶剤 B として LCMS グレードアセトニトリルを使用します。
N型糖鎖を次のグラジエントで区切ります。
1. まず 0 から 44.5 分溶媒 A. セット 0.5 mL/min の流量に溶剤 B の 95% を追加します。
2. 0 分から 6 分、線形のグラデーションの to78% の溶媒 B の割合を徐々に減少します。
3. 6 分から 44.5 分、55.9% に線形グラデーションの溶媒 B の割合を徐々に減少します。
4. 46.5 分 44.5 分からには、急速に 55.9% から 0% への線形グラデーションで溶剤 B の割合を減らすと 2 分 0% を保持し、列の洗濯を開始します。55 分 44.5 から 0.25 mL/分への流量を減らします。
5. 50.5 分 48.5 分から 95% に溶剤 B を増やすことによってさらに列を洗って、4.5 分の 95% を保持します。
6. 再度 0.5 mL/min で 95% 溶剤 B の開始条件にコラムを平衡させ、57 分 50.5 から。
高精度システムに 45 μ L のサンプルを注入します。
15 と 40 分間保持時間と、高精度での糖鎖を溶出します。
2 mL 遠心管を使用して各観測の高精度ピーク分数を収集し、遠心蒸発によってサンプルを乾燥します。
2 AB デキストラン標準 (2−20 グルコース単位) 工場 -N型糖鎖プロファイリング、調整し、標準化されたグルコース単位への溶出時間を割り当てるをラベルの約 1 pmol を注入します。

7. MALDI-TOF 質量分析

LCMS のステップ 5 で 6.8 μ L のサンプルを溶解-水のグレードします。ミックス 1 μ L の試料溶液及び 1 μ L 6 字-2 thiothymine (ATT) ソリューション (0.3 %w/v 70 %v/v アセトニトリル水溶液中で)、およびピペット MALDI-TOF サンプルキャリアの上に混合物の。
[スタート] ボタンを押すことによって肯定的なイオンモードで MALDI-TOF 質量分析計の計測器を使用してサンプルを分析します。
付属の MALDI TOF MS 解析ソフトウェアを使用して質量スペクトルを分析します。
オープンソース糖解釈ソフトウェア¹⁹を使用してスペクトルを解釈します。2 AB のラベル、[M+na]⁺の検索パラメーターを設定し、2.0 da 精度パラメーターを設定します。

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Representative Results

図 1は、(糖-) 大根、 N型糖鎖の調製、高精度分析とこれらのコンポーネントの MALDI TOF MS 分析からの蛋白質の分離を含む記述のプロトコルの概要を示しています。誘導体N型分析ダイコン品種の糖鎖の代表的な高精度のクロマトグラムを図 2に示します。図 3は、MALDI TOF 質量分析を用いた 2 ab 誘導体のN型糖鎖構造の結果を示しています。図 4は、各大根品種からN型糖鎖の定量的組成を示しています。

図 1: N型糖鎖大根糖タンパク質からリリースの記述分析方法の概要します。メソッドには、タンパク質 (糖-) とN型糖鎖、高精度のプロファイリングと MALDI TOF 質量分析の準備が含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2:Nラベル 2 ab 型糖鎖プロファイルN型糖鎖。N型糖鎖は、紅芯大根、緑の大根、gegeol 大根、大根、ラディッシュ、スイカ大根から分離されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3:多くの分光分析N型糖鎖サンプル構築高精度によって分離します。各スペクトログラムのN型糖鎖は、同じピークによって収集されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4:定量的組成N型糖鎖大根品種から。円および三日月のサイズは、大根糖タンパク質から 2 ab ラベルのN型糖鎖の相対的な豊かさを表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

我々はここで提示しているプロトコルは、さまざまな品種の大根のN型糖鎖のプロファイルの比較をできます。既存のプロトコルと比較してこの方法の重要な利点は、 N型糖鎖の酵素的リリースと 2 AB と誘導体化反応のバッファーの変更が必要ないことです。この手順の最も重要なステップは塩を削除する失敗として SPE カラムを用いたN型糖鎖の精製や反応混合物の他の不純物を蛍光誘導体化効率低下可能性があります。ここで示すだけを許可異なるN 型糖鎖の相対的な存在量の評価法絶対定量には、手順 2.1 (maltopentose) など内部標準添加が必要となります。

また、ここで使用される誘導体化剤 (2 AB) は、2-アミノピリジン (2 AP) またはその他の誘導体化剤を使用して簡単に変更できます。ステップ 5.3 から得られたN型糖鎖誘導体はサイズ排除クロマトグラフィー (SEC)、強いによっても分けることがまたは、弱陰イオン交換クロマトグラフィー (SAX またはワックス) または逆相高速液体クロマトグラフィー法 (ただし、解像度の劣化の可能性が高い)。さらにN型糖鎖の構造を確認するには、シーケンシャル exoglycosidase トリートメントの詳細を読むとN型糖鎖の構造を特徴付けるステップ 5.3 後に使用できます。最後に、ステップ 6.8 からのサンプルを分析できる MALDI TOF MSⁿを使用してさらに-基づく断片化法。大根または他の植物種からN型糖鎖の機能と健康効果を調べてプロトコルの将来のアプリケーションが含まれます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は自然科学基金、中国のによって部分的に支えられた (許可番号 31471703、A0201300537、J.V.、l. l.、31671854 許可番号 31470435 G.Y.)、および 100 外国の才能計画 (合弁会社許可番号 JSB2014012)。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
Trichloroacetic acid	SCR, Shanghai	80132618
Acetic acid glacial	Huada, Guangzhou	64-19-7
Acetonitrile	General-reagent	G80988C
Trifluoroacetic acid	Energy chemical	W810031
2-aminobenzamide	Heowns, Tianjin	A41900
Sodium cyanoborohydride	J&K Scientific Ltd	314162
Dimethyl sulfoxide	Huada, Guangzhou	67-68-5
2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol	Agilent Technologies	AT-5190-6998
6-Aza-2-thiothymine	Sigma	275514
Tools/Materials:
Kitchen blender	Bear, Guangzhou	LLJ-A10T1
Centrifuge	Techcomp	CT15RT
Centrifugal Evaporator	Hualida, Taicang	LNG-T120
SPE column	Supelco	Supelclean ENVI Carb SPE column
MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker	Autoflex
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	# 5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
Column oven	Hengxin	CO-2000
HPLC Column	Waters	Acquity UPLC BEH glycan column	2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size
LCMS-grade Water	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	# 100029
Formic acid	Aladdin	F112034
Ammonia solution	Aladdin	A112080