Summary
Vi beskriver en enkel og hurtig metode for udarbejdelse og analyse af N- glycans fra forskellige sorter af radise (Raphanus sativus).
Abstract
I de seneste år, har kulhydrat fraspaltning af planter modtaget betydelig opmærksomhed, da de er en potentiel kilde til cross-reactive, allergi-provokerende immunrespons. Derudover spille kulhydrat strukturer også en afgørende rolle i anlægget stofskifte. Her præsenterer vi en enkel og hurtig metode til at forberede og analysere N- glycans fra forskellige sorter af radise (Raphanus sativus) ved hjælp af en N- glycanase specifikke for frigivelse af plantebaserede kulhydrat strukturer. For at opnå dette, blev rå trichloreddikesyre bundfald af radise homogeniseret behandlet med PNGase H+, og mærket med 2-aminobenzamide som en fluorescerende tag. Mærket N- glycan prøver blev efterfølgende analyseret ved ultra performance væskekromatografi (UPLC) adskillelse og matrix assisted laser desorption ionisering-tid for flyvning (MALDI-TOF) massespektrometri for en detaljeret struktur evaluering og kvantificere relativ abundancies af radise-afledte N- glycan strukturer. Denne protokol kan også bruges til analyse af N- glycans fra forskellige andre plantearter, og kan være nyttige for yderligere undersøgelse af funktion og N- glycans virkninger på menneskers sundhed.
Introduction
N- glycans i planter har trukket øget opmærksomhed i de seneste år, som tidligere forskning har fremhævet N- glycans som en potentiel kilde til immunologiske krydsreaktioner, som kan fremkalde allergiske reaktioner1,2 . Det er blevet påvist tidligere at N- glycans på anlægget glykoproteiner kan påvirke katalytisk aktivitet3,4, thermostability og falsning5,6 eller subcellulært lokalisering og sekretion7. For at korrelere glycan strukturer med deres respektive funktioner, skal N- glycans først blive frigivet fra glykoproteiner enten kemisk eller enzymatisk. Den klassiske kemiske metode for at frigive N- og O- glycans er β-eliminering, hvor alkalisk prøve behandling er ledsaget af reduktion med ved at give en alditol8. Men denne procedure er til hinder for mærkning med en fluorophore og forårsager betydelige henfald af monosakkarid enheder fra den reducerende ende af glycan struktur. Kemiske deglycosylation baseret på ammoniumhydroxid/karbonat behandling er også et almindeligt anvendte alternativ metode9. Ingen af disse kemiske release metoder nedbryder intakte proteiner, som tillader massespektrometrisk analyse af umærket glycan puljer uden indblanding fra peptid fragmenter i den samme masseinterval. En ulempe ved disse metoder er imidlertid øget nedbrydning sats af en1, 3-fucosylated N- glycans, en fælles kulhydrat struktur findes i planter10. Alternativt, enzymatisk release metoder ved hjælp af peptid:N- glycanases (PNGases, EF 3.5.1.52) er også almindeligt anvendt. Rekombinante PNGase F (fra Flavobacterium meningosepticum) er det mest almindelige valg og tillader frigivelsen af alle typer af N- glycans, undtagen de strukturer, der er forsynet med en core en1, 3 fucose11,12. Derfor, PNGase A (isoleret fra mandel frø) bruges normalt til analyse af planten N- glycans13. Dog dette enzym deglycosylates kun proteolytically-afledt glycopeptider, og er i stand til at deglycosylate indfødte glykoproteiner14. Derfor kræves en multi-step prøve workup før yderligere analyse, der forårsager omfattende tab af glycans, især i de lave overflod15. Det overordnede mål med metoden er at præsentere en optimeret arbejdsgang for N- glycan frigivelse og fluorescens mærkning på en enkel og robust måde. Den underliggende logik er at PNGase H+, som for nylig blev opdaget i Terriglobus roseus og recombinantly kan udtrykkes i E. coli, kan hydrolyserer N- glycans direkte fra protein stillads i sure betingelser16. En afgørende fordel ved at anvende PNGase H+ over alternative metoder er, at fluorescerende mærkning reaktioner kan udføres i samme reaktion røret uden at ændre reaktion buffere17,18. Simpel forberedelse betingelser og høj inddrivelse af lav-overflod oligosaccharider gør denne metode et værdifuldt værktøj i analysen af N- glycans. Denne protokol er velegnet til analyse af N- glycans fra forskellige plantearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. prøvetagning
- Købe forskellige sorter af friske radise (Raphanus sativus L.).
2. isolering af Protein fra radise
- Homogeniseres ca. 100 g friske radise med et køkken blender i 10 min.
- Overføre gylle til en 50 mL-centrifugerør og centrifugeres ved 14.000 × g ved 4 ° C i 20 min. til at fjerne de uopløselige materiale.
- Overføre supernatanten omhyggeligt i en ny 50 mL-centrifugerør og tilføje et lige saa stort volumen af 2 M trichloreddikesyre (TCA) løsning.
Bemærk: Tilføje TCA vil udfælde opløselig (glyco) proteiner. - Der centrifugeres ved 14.000 × g ved 4 ° C i 30 min og Fjern supernatanten fra pelleted (glyco) proteiner.
- Vask pellet med 20 mL deioniseret vand og centrifugeres ved 14.000 × g ved 4 ° C i 5 min at fjerne opløseligt oligosakkarider, og polysakkarider.
- Gentag trin 2,5. fire gange.
- Genopslæmmes pellets i 1 mL deioniseret vand og overførsel til en frisk 1,5 mL centrifugeglas.
3. forberedelse af N- Glycans
- Mix 50 µL af protein løsning fra trin 2.7. (svarende til 5 g friske radise) med 0,2 mU af rekombinante PNGase H+ eddikesyre, 10 mM.
- Inkuber reaktionsblanding ved 37 ° C i 12 timer. Efter inkubation, centrifugeres ved 14.000 × g for 5 min at fjerne ekstra protein og enzym.
- Overføre supernatanten til en frisk 1,5 mL centrifugeglas.
4. rensning af N- Glycans
- Forberede den fast-fase ekstraktion (SPE) kolonne til at berige N- glycans og fjerne salte og andre urenheder fra reaktionsmiljøet, forøgelse af fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) mærkning agent for N- glycan selektivitet forædling.
- Tilføj 3 mL deioniseret vand til at vaske kolonnen.
- Tilføj 3 mL 80% acetonitril løsning indeholdende trifluoreddikesyre (TFA, 0,1% v/v) til active SPE-kolonne.
- Tilføj 3 mL deioniseret vand til blandingen henstår kolonnen SPE.
- Overføre prøven fra trin 3.3 over på kolonnen og kassér gennemstrømnings.
- Der tilsættes 1,5 mL deioniseret vand til at vaske kolonnen og kassér gennemstrømnings.
- Elueres den frigivne N- glycans fra kolonnen ved hjælp af 1,5 mL vandig 20% acetonitril løsning, der indeholder 0,1% TFA (v/v) i et 2 mL-centrifugerør.
- Fjerne opløsningsmidlet af centrifugal fordampning ved stuetemperatur. Inddampes, indtil prøven er helt tør.
5. fluorescens forædling af N- Glycans
- Forberede 1 mL 2-AB løsning, bestående af 35 mM 2-AB og 0,1 M natrium cyanoborohydride i dimethyl sulfoxid/eddikesyre syre (7:3, v/v).
- Tilsæt 5 µL af 2-AB løsning til de tørrede prøver (trin 4.5.) stammer fra seks forskellige radiser. Vortex hver prøve indtil helt opløst.
- Inkuber blanding i 2 timer ved 65 ° C.
- Lad prøven køle ned til stuetemperatur i 5 min., og tilsæt 5 µL med deioniseret vand og 40 µL af acetonitril. Der centrifugeres rør ved 14.000 x g i 3 min.
- Overføre 48 µL fra supernatanten til en 300 µL high-recovery HPLC hætteglas. Gemme de derivatized N- glycan prøver ved-20 ° C i op til en måned.
6. HILIC-UPLC profilering af N- glycans
- Analysere prøverne ved hjælp af en standard UPLC system forbundet til en online fluorescens detectorset excitation/emission bølgelængder af 330 nm/420 nm, henholdsvis.
- Bruge en hydrofob vekselvirkning væskekromatografi (HILIC)-UPLC glycan kolonne ved en kolonne temperatur på 60 ° C for analysen.
- Forberede opløsningsmiddel A ved at fortynde 50 mL af stamopløsningen (1 M ammonium formate løsning, pH 4.5) med 950 mL af liquid chromatography-massespektrometri (LCMS)-grade vand. Forberede stamopløsningen som følger:
- Tilføje 43 mL myresyre til 700 mL af LCMS-grade H2O.
- Justeres til pH 4.5 ved dråbevis tilsætning af vandige ammoniakopløsning (25% w/w).
- Overføre opløsningsmidlet til et måleglas og fylde op til 1000 mL med LCMS-grade H2O. butik på 4-6 ° C i op til 3 måneder.
- Bruge LCMS-grade acetonitril som opløsningsmiddel B.
- Adskille Nielsen- glycans med de følgende gradient eluering:
- Start ved at tilføje 95% af opløsningsmiddel B i opløsningsmiddel A. sæt strømningshastighed på 0,5 mL/min. fra 0 til 44,5 min.
- Fra 0 min til 6 min, gradvis at reducere andelen af opløsningsmiddel B med en lineær gradient to78%.
- Fra 6 min til 44,5 min, gradvis at reducere andelen af opløsningsmiddel B med en lineær gradient 55.9%.
- Fra 44,5 min til 46,5 min, hurtigt mindske andelen af opløsningsmiddel B med en lineær gradient fra 55.9% til 0% og holde på 0% for 2 min, og indlede vask af kolonnen. Reducere strømningshastigheden til 0,25 mL/min. fra 44,5 til 55 min.
- Vaske kolonnen yderligere ved at øge opløsningsmiddel B til 95% fra 48.5 min til 50,5 min og holde på 95% til 4,5 min..
- Re reagensglasset kolonnen Start betingelserne for 95% opløsningsmiddel B 0,5 mL/min. fra 50,5 til 57 min.
- Indsprøjtes 45 µL af prøven i UPLC systemet.
- Elueres af N- glycans af UPLC med retentionstider mellem 15 og 40 min.
- Indsamle hver observerede UPLC peak fraktion med 2 mL centrifugeglas og tør prøverne af centrifugal fordampning.
- Injicere ca 1 pmol 2-AB mærket dextran standard (2−20 glukose enheder) at kalibrere plante -N- glycan profilering, og tildele deres eluering gange i standardiseret glukose enheder.
7. MALDI-TOF MS analyse
- Opløse prøver fra trin 6,8 i 5 µL af LCMS-grade vand. Mix 1 µL af prøveopløsningen og 1 µL af 6-aza-2-thiothymine (ATT) løsning (0,3% w/v i 70% v/v vandige acetonitril) og pipette blandingen på MALDI-TOF prøve luftfartsselskab.
- Analysere prøverne ved hjælp af en MALDI-TOF massespektrometer instrument i positiv ion mode ved at trykke på knappen Start .
- Analysere de massespektre ved hjælp af den medfølgende MALDI-TOF-MS analyse software.
- Fortolke spektrene ved hjælp af en open source glycan fortolkning software19. Indstille søgeparametre for 2-AB mærkning, [M + Na]+, og indstille parameteren nøjagtighed til 2.0 Da.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et skematisk overblik over den beskrevne protokol, herunder isolering af (glyco-) proteiner fra radise, udarbejdelse af N- glycans, UPLC-analyse og MALDI-TOF-MS analyse af disse komponenter. Figur 2 viser repræsentative UPLC kromatogrammer af derivatized N- glycans af de analyserede radise kultivarer. Figur 3 viser resultaterne af de 2AB-derivatized N- glycan strukturer ved hjælp af MALDI-TOF-massespektrometri. Figur 4 viser den kvantitative sammensætning af N- glycans fra hver radise kultivar.
Figur 1 : Skematisk oversigt over den beskrevne analysemetode for N- glycans frigivet fra radise glykoproteiner. Metoden omfatter udarbejdelse af (glyco-) proteiner og N- glycans, UPLC profilering og MALDI-TOF-MS analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : N -glycan profiler af 2-AB mærket N - glycans. N- glycans er isoleret fra rød radise, grønne radise, gegeol radise, daikon, kirsebær radise og vandmelon radise. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Masse spektrometrisk analyse af N - glycan prøver isoleret ved HILIC-UPLC. N- glycans i hver spektrogram er indsamlet af den samme peak. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Kvantitativ sammensætning N - glycans fra hver radise kultivar. Størrelser af cirkler og halvmåner repræsenterer den relative forekomst af 2AB-mærket N- glycans fra radise glykoproteiner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, vi har præsenteret her tillader sammenligning af N- glycan profiler af forskellige sorter af radise. En væsentlig fordel ved denne metode i forhold til eksisterende protokoller er, at der kræves ingen buffer ændringer mellem enzymatisk frigivelsen af N- glycans og forædling reaktion med 2-AB. Den mest kritiske trin i denne procedure er rensning af N- glycans ved hjælp af kolonnen SPE som manglende evne til at fjerne salte eller andre urenheder i reaktionsblandingen kan have en negativ effekt fluorescens forædling effektivitet. Metoden tillader som præsenteres her kun vurderingen af de relative mængder af forskellige N -glycans; absolut kvantificering kræver tilsætning af en intern standard (såsom maltopentose) i trin 2.1.
Alternativt, forædling agent bruges her (2-AB) kan ændres nemt ved hjælp af 2-aminopyridine (2-AP) eller andre forædling agenter. De opnåede Nielsen- glycan derivater fra trin 5.3 kan også adskilt af størrelse udstødelse kromatografi (SEC), stærk eller svag anion udveksle kromatografi (SAX eller voks), eller omvendt-fase HPLC metoder (men sandsynligvis med ringere opløsning). Du kan yderligere kontrollere strukturer af N- glycans, kan sekventielle exoglycosidase behandlinger bruges efter trin 5.3 for at karakterisere struktur af N- glycans med flere detaljer. Endelig prøver fra trin 6.8 kunne analyseres yderligere ved hjælp af MALDI-TOF-MSn-baseret fragmentering metoder. Mulige fremtidige anvendelser af vores protokol omfatter undersøge funktion og sundhed virkningerne af N- glycans fra radise eller andre plantearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet i en del af Natural Science Foundation of China (tildele numre 31471703, A0201300537 og 31671854 til J.V. og ll, tildele nummeret 31470435 til G.Y.), og de 100 udenlandske talenter Plan (tilskud antal JSB2014012 til J.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
- Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
- Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
- Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
- Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
- Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
- Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
- Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
- Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
- Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
- Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
- Fan, J. -Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
- Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
- Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
- Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
- Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
- Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
- Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
- Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).
