Summary
हम तैयारी और मूली के विभिंन किस्मों से एनglycans के विश्लेषण के लिए एक सरल और तेजी से विधि का वर्णन (Raphanus कुंकुम) ।
Abstract
हाल के वर्षों में, पौधों की कार्बोहाइड्रेट moieties काफी ध्यान प्राप्त हुआ है, के रूप में वे पार के एक संभावित स्रोत हैं, प्रतिक्रियाशील, एलर्जी उत्तेजक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं । इसके अलावा, कार्बोहाइड्रेट संरचनाओं भी संयंत्र चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । यहां, हम एक सरल और तेजी से तैयार करने और विश्लेषण के लिए glycans मूली के विभिंन किस्मों (Raphanus कुंकुम) का उपयोग कर एक n-glycanase संयंत्र व्युत्पंन कार्बोहाइड्रेट संरचनाओं की रिहाई के लिए विशिष्ट का प्रयोग । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, क्रूड trichloroacetic एसिड मूली homogenates की हाला PNGase एच+के साथ इलाज किया गया, और एक फ्लोरोसेंट टैग के रूप में 2-aminobenzamide का उपयोग कर लेबल । लेबल एनglycan नमूने बाद में अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया गया (UPLC) जुदाई और मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption ionization-उड़ान के समय (मालदी-तोफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक विस्तृत संरचनात्मक के लिए मूल्यांकन और मूली के सापेक्ष abundancies- Nव्युत्पंन-glycan संरचनाओं मात्रा । इस प्रोटोकॉल भी विभिंन अंय प्रजातियों के पौधे से एन-glycans के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और समारोह और Nके प्रभाव मानव स्वास्थ्य पर glycans के आगे की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है ।
Introduction
n-पौधों में glycans हाल के वर्षों में बढ़ा ध्यान आकर्षित किया है, पिछले अनुसंधान के रूप में प्रकाश डाला गया है प्रतिरक्षा पार के एक संभावित स्रोत के रूप में glycans-प्रतिक्रियाओं कि एलर्जी1,2 भड़काना हो सकता है . यह पहले से प्रदर्शन किया गया है कि N-glycans पर संयंत्र नच उत्प्रेरक गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं3,4, thermostability और तह5,6 या उपसेलुलर स्थानीयकरण और स्राव7. glycan संरचनाओं को उनके संबंधित कार्यों के साथ सहसंबंधित करने के लिए, N-glycans पहले या तो या तो रासायनिक या enzymatically नच से जारी किया जाना चाहिए । दोनों Nऔर O-glycans जारी करने के लिए शास्त्रीय रासायनिक विधि β-उंमूलन है, जिसमें alkaline नमूना उपचार borohydride के साथ कमी के साथ एक alditol8उपज है । हालांकि, यह प्रक्रिया एक fluorophore के साथ लेबलिंग precludes और monosaccharide इकाइयों के glycan संरचना के अंत को कम करने से महत्वपूर्ण क्षय का कारण बनता है । रासायनिक deglycosylation पर आधारित अमोनियम हीड्राकसीड/कार्बोनेट ट्रीटमेंट भी एक सामांय रूप से प्रयुक्त वैकल्पिक पद्धति9है । इन रासायनिक रिहाई के तरीकों में से न तो बरकरार प्रोटीन, जो एक ही मास रेंज में पेप्टाइड टुकड़ों के हस्तक्षेप के बिना unलेबल्ड glycan पूल के जन spectrometric विश्लेषण की अनुमति देता है नीचा । हालांकि, इन पद्धतियों की एक खामी हैं1, 3-fucosylated N-glycans, एक आम कार्बोहाइड्रेट संरचना10पौधों में पाया की वृद्धि की गिरावट दर है । वैकल्पिक रूप से, एंजाइमी रिलीज़ पेप्टाइड:N-glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) का उपयोग करने के तरीके भी व्यापक रूप से लागू होते हैं । रिकॉमबिनेंट PNGase एफ ( Flavobacterium meningosepticumसे) सबसे आम पसंद है और एक कोर glycans, 3 हैं111,12असर संरचनाओं को छोड़कर N-fucose के सभी प्रकार की रिहाई की अनुमति देता है । इसलिए, PNGase एक (बादाम के बीज से पृथक) आमतौर पर संयंत्र N-glycans13के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, इस एंजाइम deglycosylates केवल proteolytically-व्युत्पंन glycopeptides, और देशी नच14deglycosylate करने में असमर्थ है । इसलिए, एक बहु कदम नमूना workup आगे विश्लेषण है, जो glycans की व्यापक हानि, विशेष रूप से कम बहुतायत15के उन कारणों से पहले की आवश्यकता है । विधि का समग्र लक्ष्य एक सरल और मजबूत तरीके से एन-glycan रिलीज और प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह पेश करने के लिए है । अंतर्निहित तर्क है कि PNGase ज+है, जो हाल ही में Terriglobus रोसेस में की खोज की थी और ई. कोलाईमें व्यक्त recombinantly जा सकता है, hydrolyze N-glycans सीधे अम्लीय में प्रोटीन पाड़ से कर सकते हैं 16शर्तें । वैकल्पिक तरीकों पर PNGase ज+ का उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि फ्लोरोसेंट लेबलिंग प्रतिक्रियाओं प्रतिक्रिया बफ़र्स17,18बदलने के बिना एक ही प्रतिक्रिया ट्यूब में किया जा सकता है । सरल तैयारी की स्थिति और कम बहुतायत के उच्च वसूली oligosaccharides इस विधि N-glycans के विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण उपकरण बनाते हैं । यह प्रोटोकॉल विभिंन प्रजातियों के पौधे से एन-glycans के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. नमूना संग्रह
- ताजा मूली (Raphanus कुंकुम एल) के विभिंन किस्मों की खरीद ।
2. मूली से प्रोटीन का अलगाव
- Homogenize 10 मिनट के लिए एक रसोई ब्लेंडर के साथ ताजा मूली के लगभग १०० ग्राम ।
- एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब और १४,००० × g पर 4 ° c में 20 मिनट के लिए अघुलनशील सामग्री को दूर करने के लिए घोल स्थानांतरण ।
- supernatant ध्यान से एक नया ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में स्थानांतरण और 2 एम trichloroacetic एसिड (टीसीए) समाधान के एक बराबर मात्रा में जोड़ें ।
नोट: टीसीए को जोड़ना घुलनशील (glyco) प्रोटीन हाला । - 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १४,००० × जी में केंद्रापसारक और छर्रों (glyco) प्रोटीन से supernatant हटा दें ।
- पानी के 20 मिलीलीटर के साथ गोली धो और 4 डिग्री सेल्सियस पर १४,००० × जी में 5 मिनट के लिए घुलनशील oligosaccharides और polysaccharides को दूर करने के लिए केंद्रापसारक ।
- चरण २.५ दोहराएँ । चार बार ।
- फिर से 1 मिलीलीटर में छर्रों निलंबित पानी और एक ताजा १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
3. N-Glycans की तैयारी
- २.७ कदम से प्रोटीन समाधान के ५० µ एल मिक्स । (ताजा मूली के 5 ग्राम के बराबर) 10 मिमी एसिटिक एसिड में रिकॉमबिनेंट PNGase एच के ०.२ म्यू के साथ ।
- 12 एच के लिए ३७ ° c पर प्रतिक्रिया मिश्रण मशीन मशीन के बाद, 5 मिनट के लिए १४,००० × जी में केंद्रापसारक अतिरिक्त प्रोटीन और एंजाइम को दूर करने के लिए ।
- एक ताजा १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरण ।
4. एन-Glycans का शुद्धिकरण
- n-glycans को समृद्ध और लवण और अन्य अशुद्धियों को दूर करने के लिए ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) स्तंभ तैयार करें प्रतिक्रिया मिश्रण से, fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) लेबलिंग एजेंट n-glycan के लिए selectivity को बढ़ाना derivatization ।
- स्तंभ को धोने के लिए पानी के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
- एसपीई-स्तंभ सक्रिय करने के लिए trifluoroacetic अम्ल (TFA, ०.१% v/v) युक्त ८०% acetonitrile समाधान की 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
- एसपीई-स्तम्भ को equilibrate करने के लिए ३ मिलीलीटर पानी में डालें ।
- नमूना चरण ३.३ से स्तंभ पर स्थानांतरित करें और प्रवाह-के माध्यम से छोड़ें ।
- स्तंभ को धोने और प्रवाह के माध्यम से त्यागने के लिए जल के १.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
- Elute का उपयोग कॉलम से जारी N-glycans जलीय 20% acetonitrile समाधान के १.५ मिलीलीटर, युक्त ०.१% TFA (वी/वी) में एक 2 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब ।
- कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक वाष्पीकरण द्वारा विलायक निकालें । जब तक नमूना पूरी तरह से शुष्क है लुप्त हो जाना ।
5. प्रतिदीप्ति Derivatization ऑफ एन-Glycans
- 2-ab समाधान की 1 मिलीलीटर तैयार करें, जिसमें ३५ mM 2-ab और ०.१ M सोडियम cyanoborohydride dimethyl sulfoxide/एसिटिक एसिड सॉल्यूशन (7:3, v/
- जोड़ें 5 µ एल के 2-अब सूखे नमूनों को हल (४.५ कदम.) छह अलग मूली से व्युत्पंन । भंवर जब तक पूरी तरह से भंग प्रत्येक नमूना ।
- ६५ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए मिश्रण की मशीन ।
- नमूना 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए नीचे ठंडा करते हैं, और acetonitrile के ४० µ l के 5 µ l को जोड़ने के लिए । 3 मिनट के लिए १४,००० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक ।
- एक ३०० µ l उच्च वसूली HPLC शीशी में supernatant से ४८ µ एल स्थानांतरण । एक महीने तक के लिए-20 ° c पर derivatized N-glycan नमूने संग्रहीत करें ।
6. N-glycans के HILIC-UPLC profile
- ३३० एनएम/420 एनएम, क्रमशः उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर एक ऑनलाइन प्रतिदीप्ति detectorset से जुड़े एक मानक UPLC प्रणाली का उपयोग कर नमूनों का विश्लेषण ।
- विश्लेषण के लिए ६० ° c के कॉलम तापमान पर एक hydrophobic इंटरेक्शन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (HILIC)-UPLC glycan कॉलम का प्रयोग करें ।
- कमजोर द्वारा विलायक एक तैयार स्टॉक समाधान के ५० मिलीलीटर (1 एम अमोनियम formation समाधान, पीएच ४.५) के साथ ९५० मिलीलीटर तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LCMS)-ग्रेड पानी । स्टॉक समाधान निम्नानुसार तैयार करें:
- LCMS-ग्रेड एच2ओ के ७०० मिलीलीटर के लिए ४३ मिलीलीटर फार्मिक एसिड जोड़ें
- जलीय अमोनिया समाधान के dropwise अलावा द्वारा ४.५ को पीएच समायोजित करें (25% डब्ल्यू/
- एक मापने सिलेंडर के लिए विलायक हस्तांतरण और 3 महीने के लिए 4-6 डिग्री सेल्सियस पर LCMS ग्रेड एच2ओ. स्टोर के साथ १००० मिलीलीटर तक भरें ।
- उपयोग LCMS-विलायक बी के रूप में ग्रेड acetonitrile
- निम्न ग्रेडिएंट रेफरेंस के साथ अलग एन-glycans:
- विलायक ए में विलायक बी के ९५% जोड़ने के द्वारा शुरू ०.५ मिलीलीटर पर प्रवाह की दर/0 से ४४.५ मिनट के लिए मिनट ।
- से 0 मिनट के लिए 6 मिनट, धीरे से एक रैखिक ढाल to78% के साथ विलायक बी के अनुपात में कमी ।
- से 6 मिनट के लिए ४४.५ मिनट, धीरे से एक रैखिक ढाल के साथ विलायक बी के अनुपात में कमी ५५.९% ।
- ४४.५ मिनट से ४६.५ मिनट के लिए, तेजी से ५५.९% से एक रैखिक ढाल के साथ विलायक बी के अनुपात में कमी 0% और 2 मिनट के लिए 0% पर पकड़, और कॉलम की धुलाई शुरू । प्रवाह की दर को कम करने के लिए ४४.५ से ५५ मिनट ०.२५ मिलीलीटर/
- इस कॉलम को आगे बढ़ाकर विलायक बी से ९५% से ४८.५ मिनट से ५०.५ मिनट और ४.५ मिनट के लिए ९५% पर पकड़ ।
- स्तंभ को ९५% विलायक B की प्रारंभिक शर्तों पर ०.५ मिलीलीटर/मिनट से ५७ मिनट के लिए ५०.५ में पुन: equilibrate ।
- UPLC प्रणाली में नमूने के ४५ µ एल इंजेक्षन ।
- Elute N-glycans UPLC द्वारा 15 और ४० मिनट के बीच अवधारण समय के साथ ।
- प्रत्येक मनाया UPLC पीक अंश 2 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों का उपयोग कर लीजिए और केंद्रापसारक वाष्पीकरण द्वारा नमूनों सूखी ।
- लगभग 1 pmol के 2-एबी लेबल dextran मानक (2 − 20 ग्लूकोज इकाइयों) संयंत्र-N-glycan profiling जांचना करने के लिए, और मानकीकृत ग्लूकोज इकाइयों में अपने रेफरेंस टाइम्स आवंटित करने के लिए ।
७. मालदी-तोफ MS विश्लेषण
- LCMS ग्रेड पानी के 5 µ एल में कदम ६.८ से नमूनों को भंग. मिश्रण 1 µ l का नमूना समाधान और 1 µ l के 6-aza-2-thiothymine (ATT) समाधान (०.३% w/v में ७०% v/v जलीय acetonitrile), और पिपेट-तोफ नमूना वाहक पर मिश्रण ।
- प्रारंभ बटन दबाकर सकारात्मक आयन मोड में एक मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमीटर साधन का उपयोग कर नमूनों का विश्लेषण करें ।
- साथ मालदी-तोफ-एमएस विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा का विश्लेषण ।
- स्पेक्ट्रा एक खुला स्रोत glycan व्याख्या सॉफ्टवेयर19का उपयोग कर व्याख्या । 2-AB लेबलिंग, [M + Na]+के लिए खोज पैरामीटर सेट करें, और शुद्धता पैरामीटर सेट करने के लिए २.० डा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
चित्रा 1 वर्णित प्रोटोकॉल के एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन से पता चलता है, के अलगाव सहित (glyco-) मूली से प्रोटीन, Nकी तैयारी-glycans, UPLC विश्लेषण, और मालदी-तोफ-MS इन घटकों का विश्लेषण । चित्रा 2 derivatized एनके प्रतिनिधि UPLC chromatograms-विश्लेषण मूली किस्मों के glycans से पता चलता है । चित्रा 3 2AB-derivatized एन-glycan मालदी-तोफ-मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग संरचनाओं के प्राप्त परिणामों को दर्शाता है । चित्रा 4 प्रत्येक मूली फसल से N-glycans की मात्रात्मक रचना से पता चलता है.
चित्रा 1 : मूली नच से जारी N-glycans के लिए वर्णित विश्लेषण विधि का योजनाबद्ध अवलोकन. विधि (glyco-) प्रोटीन और एनglycans, UPLC profiling और मालदी-तोफ-एमएस विश्लेषण की तैयारी भी शामिल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : न 2-एबी लेबल के glycan प्रोफाइल न -glycans । N-glycans लाल मूली, हरी मूली, gegeol मूली, daikon, चेरी मूली और तरबूज मूली से पृथक कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : मास spectrometric का विश्लेषण न -HILIC-UPLC द्वारा पृथक glycan नमूने. प्रत्येक spectrogram में एन-glycans एक ही चोटी द्वारा एकत्र किए जाते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : की मात्रात्मक रचना न -प्रत्येक मूली फसल से glycans. हलकों और वर्धमान के आकार 2AB के सापेक्ष बहुतायत का प्रतिनिधित्व-लेबल N-मूली से glycans नच । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
प्रोटोकॉल हम यहां प्रस्तुत किया है मूली के विभिंन किस्मों के एनglycan प्रोफाइल की तुलना की अनुमति देता है । मौजूदा प्रोटोकॉल की तुलना में इस विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ है कि N-glycans के एंजाइमी रिलीज़ और 2-AB के साथ derivatization प्रतिक्रिया के बीच कोई बफ़र परिवर्तन आवश्यक हैं । इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम एनके शुद्धि glycans एसपीई कॉलम का उपयोग कर रहा है, के रूप में नमक या प्रतिक्रिया मिश्रण में अंय दोष दूर विफलता नकारात्मक प्रतिदीप्ति derivatization क्षमता प्रभाव हो सकता है । विधि के रूप में यहां प्रस्तुत केवल विभिंन N-glycans के सापेक्ष बहुतायत के आकलन परमिट; निरपेक्ष ठहराव चरण २.१ में एक आंतरिक मानक (जैसे maltopentose) के अतिरिक्त की आवश्यकता होगी ।
वैकल्पिक रूप से, derivatization एजेंट यहाँ (2-AB) उपयोग किया गया आसानी से 2-aminopyridine (2-AP) या अन्य derivatization एजेंट्स का उपयोग करके संशोधित किया जा सकता है । ५.३ कदम से प्राप्त एनglycan डेरिवेटिव भी आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), मजबूत या कमजोर आयनों एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (सक्सेना या मोम), या रिवर्स चरण HPLC तरीकों से अलग किया जा सकता है (हालांकि हीन संकल्प के साथ होने की संभावना) । आगे की संरचनाओं की जांच करने के लिए n-glycans, अनुक्रमिक exoglycosidase उपचार उपयोग किया जा सकता चरण ५.३ के बाद अधिक विवरण के साथ n-glycans की संरचना की विशेषता है । अंतत:, चरण ६.८ से नमूने आगे मालदी-तोफ-MSn-आधारित फ़्रेग्मेंटेशन विधियों का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है । हमारे प्रोटोकॉल के संभावित भविष्य अनुप्रयोगों के समारोह की जांच शामिल है और एनके स्वास्थ्य प्रभाव-मूली या अंय प्रजातियों के पौधे से glycans ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस कार्य को चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या ३१४७१७०३, A0201300537 और ३१६७१८५४ को J.V. और L.L., अनुदान संख्या ३१४७०४३५ से G.Y.), और १०० विदेशी प्रतिभा योजना (अनुदान संख्या JSB2014012 को J.V.) द्वारा भाग में समर्थन दिया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
- Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
- Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
- Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
- Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
- Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
- Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
- Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
- Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
- Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
- Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
- Fan, J. -Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
- Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
- Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
- Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
- Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
- Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
- Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
- Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).
