Summary
우리는 준비 및 N-glycans 무 (Raphanus sativus)의 다른 재배에서의 분석을 위한 간단 하 고 빠른 방법을 설명합니다.
Abstract
최근 몇 년 동안, 식물의 탄수화물 moieties 받은 관심, 그들은 cross-reactive, 알레르기 자극 면역 반응의. 또한, 탄수화물 구조 또한 식물 물질 대사에 중요 한 역할을 담당할. 여기, 우리가 준비 하 고 사용 하는 N-glycanase 특정 식물에서 파생 된 탄수화물 구조의 릴리스에 대 한 무 (Raphanus sativus)의 다른 재배 품 정에서 N-glycans를 분석 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시. 이 위해 무 homogenates의 원유 trichloroacetic 산 침전 PNGase H+로 치료 되었고 형광 태그 2-aminobenzamide를 사용 하 여 표시. 레이블이 지정 된 N-glycan 샘플 이후 울트라 성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 분리 및 세부 구조에 대 한 비행 (TOF MALDI) 질량 분석의 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 시간으로 분석 되었다 평가 및 무 파생 N-glycan 구조 상대 abundancies 척도를. 이 프로토콜 사용할 수 있습니다 또한 다양 한 다른 식물 종에서 N-glycans의 분석 그리고 함수 추가 조사 및 인간의 건강에 N-glycans의 효과 대 한 유용할 수 있습니다.
Introduction
식물에서 N-glycans 그린 관심 증가 최근 몇 년 동안, 이전 연구로 알레르기 성 응답1,2 유도할 수 있는 면역 cross-reactions의 N-glycans을 강조 표시 . 그것은 입증 되었습니다 이전 촉매 활동3,4, 내열성 및 접는5,6 또는 subcellular 지 방화 N-glycans 공장 glycoproteins에 영향을 미칠 수 있는 고 분 비7. Glycan 구조 그들의 각각 기능 연관, 위하여 N-glycans 먼저 해제 되어야 합니다 glycoproteins에서 화학적 또는 효소. N-및 O-glycans 방출에 대 한 고전적인 화학 방법은 β-제거, 알칼리 샘플 치료 borohydride alditol8를 가진 감소에 의해 동반입니다. 그러나,이 절차는 fluorophore로 하는 걸로 하 고 glycan 구조의 줄이는 끝에서 단 당 류 단위의 상당한 감퇴의 원인. 수산화 암모늄/탄산 치료에 따라 화학 deglycosylation는 또한 일반적으로 사용 되는 대체 방법9. 이러한 화학 릴리스 방법의 그대로 단백질 같은 대량 범위에 레이블이 없는 glycan 풀 펩 티 드 파편의 간섭 없이 대량 spectrometric 분석을 수 있는 성능이 저하 됩니다. 그러나, 이러한 방법의 한 가지 단점이 일반적인 탄수화물 구조 발견 식물10에서 α1, glycans-3-fucosylated N의 증가 저하 속도입니다. 또는, 펩 티 드를 사용 하 여 효소 분리 방법:N-glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) 또한 광범위 하 게 적용 됩니다. 재조합 PNGase F ( Flavobacterium meningosepticum)에서 가장 일반적인 선택 하 고 N-glycans, 코어 α1, fucose 311,12베어링 구조를 제외 하 고 모든 종류의 릴리스 합니다. 따라서, PNGase A (아몬드 씨에서 분리)으로 식물 N-glycans13의 분석을 위해 사용 됩니다. 그러나,이 효소 deglycosylates만 proteolytically-파생 된 glycopeptides, deglycosylate 기본 glycoproteins14수입니다. 따라서, 다단계 샘플 검사 결과 추가 분석, glycans, 특히 낮은 풍부15의 그의 광범위 한 손실이 발생 하기 전에 필요 합니다. N-glycan 릴리스 및 형광 간단 하 고 강력한 방식으로 라벨에 대 한 최적화 된 워크플로우를 제시 하는 방법의 전반적인 목표가입니다. 기본 근거 PNGase H+는 Terriglobus roseus 에서 최근에 발견 되었다 recombinantly 대장균에 표현 될 수 있다, N-glycans 산 성에서 단백질 비 계에서 직접은 수은 조건16. PNGase H+ 를 사용 하 여 대체 방법의 주요 장점은입니다 형광 라벨 반응 반응 버퍼17,18를 변경 하지 않고 동일한 반응 관에서 수행할 수 있습니다. 간단한 준비 조건 및 낮은 풍부 oligosaccharides의 높은 복구 확인이 방법은 유용한 도구 Nglycans의 분석에. 이 프로토콜은 다양 한 식물 종에서 N-glycans의 분석에 적합 합니다.
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Protocol
1. 샘플 컬렉션
- 신선한 무 (Raphanus sativus L.)의 다른 cultivars을 구입.
2입니다. 무에서 단백질의 격리
- 10 분 동안 부엌 믹서와 신선한 무의 약 100 g을 균질.
- 50 mL 원심 분리기 튜브 및 불용 성 물질을 제거 20 분 4 ° C에서 14000 × g 에서 원심 슬러리를 전송 합니다.
- 새로운 50 mL 원심 분리기 튜브에는 상쾌한을 신중 하 게 전송 하 고 2m trichloroacetic 산 (TCA) 솔루션의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
참고: TCA를 추가 수용 성 (glyco) 단백질 침전 됩니다. - 30 분 동안 4 ° C에서 14000 × g 에서 centrifuge 고 수송과 (glyco) 단백질에서는 상쾌한을 제거 합니다.
- 녹는 oligosaccharides 및 다 당 류를 제거 하 5 분 동안 4 ° C에서 14000 × g 에서 이온된 수와 원심 분리기의 20 mL와 펠 릿을 세척.
- 2.5 단계를 반복 합니다. 4 번입니다.
- 다시 1 ml의 이온을 제거 된 물과 신선한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
3. N-Glycans의 준비
- 2.7 단계에서 단백질 해결책의 믹스 50 µ L. (신선한 무의 5 g와 같음) 10 mM 아세트산에 재조합 PNGase H+ 의 0.2 뮤와 함께.
- 12 h 37 ° C에서 반응 혼합물을 품 어. 부 화 후 5 분 여분의 단백질 및 효소 제거 14000 × g 에서 원심.
- 신선한 1.5 mL 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송.
4. NGlycans의 정화
- Nglycans 풍부와 Nglycan에 대 한 fluorogenic 2 aminobenzamide (2-AB) 레이블 에이전트의 선택도 증가 하는 반응 혼합물에서 소금 및 기타 불순물을 제거 고체 상 추출 (SPE) 열을 준비 derivatization입니다.
- 씻어 열 이온된 물 3 mL를 추가 합니다.
- SPE-열 활성 trifluoroacetic 산 (TFA, 0.1 %v / v)을 포함 하는 80% 이기 솔루션의 3 mL를 추가 합니다.
- SPE-열 equilibrate 하 이온된 물 3 mL를 추가 합니다.
- 3.3 열에 단계에서 샘플을 전송 하 고 흐름을 통해 삭제.
- 이온된 물 흐름을 통해 삭제를 열을 씻어 1.5 mL를 추가 합니다.
- 0.1%를 포함 20% 이기 용액의 1.5 mL를 사용 하 여 열에서 출시 된 Nglycans elute TFA (v/v) 2 mL 원심 분리기 관으로.
- 상 온에서 원심 증발에 의해 용 매를 제거 합니다. 이 샘플은 완전히 건조 될 때까지 증발.
5. 형광 Derivatization NGlycans의
- 2 AB 솔루션, 디 메 틸 ⁚ / 아세트산 산 성 용액 (7:3, v/v)에 35 m m 2-AB와 0.1 M 나트륨 cyanoborohydride의 구성의 1 mL를 준비 합니다.
- 6 다른 무에서 파생 된 말린 샘플 (4.5 단계.) 2-AB 솔루션의 5 µ L를 추가 합니다. 와 동 각 샘플까지 완전히 해산.
- 2 h 65 ° c.에 대 한 혼합물을 품 어
- 5 분 동안 실내 온도 아래로 샘플 식 고 이온된 수의 5 µ L 및 이기의 40 µ L를 추가 합니다. 3 분 14000 x g에서 튜브 원심
- 300 µ L 높은 복구 HPLC 유리병에는 상쾌한에서 48 µ L를 전송. 최대 한 달 동안-20 ° C에서 derivatized N-glycan 샘플을 저장 합니다.
6. HILIC UPLC Nglycans의 프로 파일링
- 각각 330 nm/420 nm의 여기/방출 파장에서 형광 온라인 detectorset에 연결 된 표준 UPLC 시스템을 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.
- 소수 성 상호 작용 액체 크로마토그래피 (HILIC)를 사용 하 여-UPLC glycan 열 분석을 위한 60 ° C의 열 온도에.
- 950 mL의 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LCMS)와 재고 솔루션 (1m 암모늄 편대 솔루션, pH 4.5) 50 mL를 희석 하 여 준비 하는 용 매 A-등급 물. 준비 재고 솔루션을 다음과 같습니다.
- LCMS 급 H2o.의 700 mL에 포 름 산의 43 개 mL를 추가
- 4.5 pH 수성 암모니아 솔루션 (25 %w / w)의 dropwise 추가 조정.
- 측정 실린더 용 매를 전송 하 고 LCMS 급 H2o. 저장소 4-6 ° C에서 최대 3 개월까지 최대 1000 mL 채우기.
- 솔벤트 B. LCMS 급 이기 사용
- N-glycans 다음 그라데이션 차입 구분:
- 44.5 분을 0에서 세트로 용 A. 0.5 mL/min 유량 용 매 B의 95%를 추가 하 여 시작 합니다.
- 0 분-6 분에서 점차적으로 용 매 B 선형 그라데이션 to78%의 비율을 감소.
- 44.5 분 6 분에서 점차적으로 55.9%를 선형 그라데이션으로 용 매 B의 비율을 감소.
- 46.5 분 44.5 분에서 급속 하 게 용 매 B 0 %55.9 %에서 선형 그라데이션으로 비율을 감소 하 고 2 분 동안 0%에서 누른 열 세척을 시작. 55 분 44.5에서 0.25 mL/분 유량을 줄일 수 있습니다.
- 50.5 분 48.5 분에서 용 매 B 95% 증가 하 여 추가 열을 세척 하 고 4.5 분 95%에서 개최.
- 다시-57 분 50.5에서 95% 용 매 B 0.5 mL/min의 시작 조건에 열을 equilibrate.
- UPLC 시스템으로 샘플의 45 µ L를 주사.
- N-glycans UPLC 여 15 그리고 40 분 사이 보존 시간 elute
- 2 mL 원심 분리기 튜브를 사용 하 여 각 관찰된 UPLC 피크 분수를 수집 하 고 샘플 원심 증발에 의해 건조.
- 2 AB dextran 표준 (2−20 포도 당 단위) 식물-N-glycan 파일링, 보정 하 고 표준화 된 포도 당 단위로 그들의 차입 시간을 할당 하 라는의 약 1 pmol 주사.
7. MALDI TOF MS 분석
- LCMS의 단계 5에서 6.8 µ L에서 샘플을 분해-등급 물. 샘플 솔루션 및 6-아 자-2-thiothymine (ATT) 솔루션 (0.3 w/v %70 %v / v 수성 이기에), 그리고 피 펫 MALDI TOF 샘플 캐리어에 혼합물의 1 µ L의 믹스 1 µ L.
- 긍정적인 이온 모드 시작 버튼을 누르면 MALDI TOF 질량 분석기 악기를 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.
- 동반 MALDI TOF MS 분석 소프트웨어를 사용 하 여 질량 스펙트럼을 분석 합니다.
- 오픈 소스 glycan 해석 소프트웨어19를 사용 하 여 스펙트럼을 해석 합니다. 2-AB, [M + 나]+에 대 한 검색 매개 변수를 설정 하 고 2.0 다를 정확도 매개 변수를 설정 합니다.
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Representative Results
그림 1 (glyco-) 무, N-glycans의 준비, UPLC 분석 및 이러한 구성 요소의 MALDI TOF MS 분석에서 단백질의 격리를 포함 하 여 설명된 프로토콜의 구조 개요를 보여 줍니다. 그림 2 분석된 무 재배의 derivatized Nglycans의 대표 UPLC chromatograms를 보여 줍니다. 그림 3 2AB derivatized N-glycan 구조 MALDI TOF 질량 분석을 사용 하 여 얻은 결과 보여 줍니다. 그림 4 는 각 무 품종에서 N-glycans의 양적 구성.
그림 1 : N-glycans 무 glycoproteins에서 발표에 대 한 기술된 분석 방법의 개요 개요. 메서드 (glyco-) 단백질 및 N-glycans UPLC 프로 파일링, MALDI TOF MS 분석의 준비를 포함 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : N 2 ab 표시-glycan 프로필 N -glycans. Nglycans 빨간 무 그린 무, gegeol 무, 무, 앵 무, 수 박 무에서 격리 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 대량 spectrometric 분석 N -glycan 샘플 HILIC UPLC에 의해 분리. N-glycans 각 스펙트로그램에 같은 피크에 의해 수집 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 양적 구성 N -각 무 품종에서 glycans. 크기의 원형 및 조각 무 glycoproteins에서 2AB 표시 된 N-glycans의 관계 되는 풍부를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리가 여기 제시 하는 프로토콜 무의 다양 한 재배의 N-glycan 프로 파일의 비교를 허용 한다. 기존 프로토콜에 비해이 방법의 중요 한 장점은 Nglycans의 효소 출시와 2 AB와 derivatization 반응 사이의 버퍼 변경할 필요가 없습니다입니다. 이 절차의 가장 중요 한 단계는 N-glycans SPE 열을 사용 하 여 염 분을 제거 하는 실패의 정화 또는 반응 혼합물에 다른 불순물 형광 derivatization 효율성 저하 될 수 있습니다. 여기 다른 N-glycans;의 상대적인 나타났는데 평가 허가 제시 방법 절대 정량화 단계 2.1에서에서 (예: maltopentose)는 내부 표준의 추가 해야 합니다.
또는, derivatization 에이전트 여기 사용 (2-AB) 2-aminopyridine (2-AP) 또는 다른 derivatization 에이전트를 사용 하 여 쉽게 수정할 수 있습니다. 5.3 단계에서 얻은 N-glycan 파생 상품 또한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 강한에 의해 분리 될 수 있다 또는 약한 음이온 교환 크로마토그래피 (색소폰 또는 왁 스), 또는 역 상 HPLC 방법 (비록 가능성이 열 등 한 해상도). 추가로 N-glycans의 구조를 확인 순차적 exoglycosidase 치료 사용할 수 있습니다 단계 5.3 후 자세한 내용 Nglycans의 구조 특성. 마지막으로, 단계 6.8에서에서 샘플 분석 될 수 있었다 MALDI TOF MSn을 사용 하 여 추가-조각화 메서드를 기반으로. 우리의 프로토콜의 가능한 미래 애플리케이션으로 N-glycans 무 또는 다른 식물 종에서의 기능과 건강 효과 조사 하 고 있다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중국의 자연 과학 재단에 의해 부분적으로 지원 (부여 번호 31471703, A0201300537 및 31671854 J.V. 하 L.L., 번호 31470435 G.Y.에 부여), 그리고 100 외국 재능 계획 (보조금 번호 JSB2014012 J.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
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