Summary
Nós descrevemos um método simples e rápido para a preparação e análise de N- os glicanos de diferentes cultivares de rabanete (Raphanus sativus).
Abstract
Nos últimos anos, as metades de hidrato de carbono de plantas têm recebido atenção considerável, como eles são uma fonte potencial de cross-reactive, alergia, provocando reacções imunológicas. Além disso, estruturas de carboidratos também desempenham um papel fundamental no metabolismo da planta. Aqui, apresentamos um método simples e rápido para preparar e analisar N- os glicanos de diferentes cultivares de rabanete (Raphanus sativus) usando um N- glycanase específico para o lançamento de estruturas de carboidratos de origem vegetal. Para conseguir isso, cru ácido tricloroacético precipitados de rabanete homogenates foram tratados com PNGase H+e rotulados usando 2-aminobenzamide como uma etiqueta fluorescente. N- glicano amostras etiquetadas foram analisadas posteriormente pela separação de ultra desempenho cromatografia líquida (UPLC) e laser assistida por matriz dessorção ionização tempo de voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa para uma detalhada estrutural avaliação e a quantificação relativas abundancies das estruturas rabanete-derivados N- glicano. Este protocolo também pode ser usado para a análise de N- os glicanos de várias outras espécies de plantas e pode ser útil para posterior investigação da função e efeitos da N- os glicanos na saúde humana.
Introduction
Os N- glicanos em plantas têm chamado a atenção crescente nos últimos anos, como pesquisas anteriores destacou os N- glicanos como uma fonte potencial de reacções imunológicas que podem provocar respostas alérgicas1,2 . Foi demonstrado anteriormente que os N- glicanos em glicoproteínas de planta pode afetar a atividade catalítica de3,4, estabilidade térmica e dobramento5,6 ou Localização subcellular e secreção7. A fim de correlacionar as estruturas glicano com suas respectivas funções, os N- glicanos deve ser lançados de glicoproteínas ou quimicamente ou enzimaticamente. O método químico clássico para liberar N- e O- os glicanos é β-eliminação, em que o tratamento alcalino amostra é acompanhado por redução com borohidreto para produzir um alditol8. No entanto, este procedimento impede a rotulagem com um fluoróforo e causa deterioração significativa de unidades de monossacarídeo do redutor final da estrutura de glicano. Deglycosylation química, com base no tratamento de hidróxido de amônio/carbonato é também um método alternativo comumente usado9. Nenhum desses métodos de liberação química degrada proteínas intactas, que permite a análise de espectrometria de massa de glicano sem rótulo piscinas sem a interferência de fragmentos de peptídeo na mesma faixa de massa. No entanto, um inconveniente desses métodos é a taxa de aumento da degradação de α1, 3-fucosilado N- os glicanos, uma estrutura comum de carboidrato encontrado em plantas,10. Como alternativa, os métodos de liberação enzimática usando peptídeo:N- glycanases (PNGases, CE 3.5.1.52) são também amplamente aplicados. Recombinante PNGase F (de Flavobacterium meningosepticum) é a escolha mais comum e permite a libertação de todos os tipos de N- os glicanos, exceto as estruturas portadoras de um núcleo α1, fucose 311,12. Portanto, A PNGase (isoladas de sementes amêndoas) geralmente é usada para a análise da planta Nos glicanos -13. No entanto, esta enzima deglycosylates apenas proteoliticamente-derivado glicopeptídeos e é incapaz de deglycosylate nativo glicoproteínas14. Portanto, um exame de amostra de várias etapas é necessário antes de mais análise, que provoca a perda extensa dos glicanos, especialmente aqueles de baixa abundância15. O objetivo geral do método é apresentar um fluxo de trabalho otimizado para N- glicano liberação e rotulagem de forma simples e robusta de fluorescência. A lógica subjacente é que o PNGase H+, que recentemente foi descoberto em Terriglobus roseus e pode ser expressa de recombinantes em e. coli, pode hidrolisar os N- glicanos diretamente do andaime proteína em ácido condições de16. A principal vantagem de usar PNGase H+ sobre métodos alternativos é que reações de rotulagem fluorescentes podem ser executadas em tubo de reação mesmo sem alterar a reação amortecedores17,18. As condições de preparação simples e alta recuperação de oligossacarídeos de baixo-abundância fazem esse método uma ferramenta valiosa na análise do N- os glicanos. Este protocolo é apropriado para a análise de N- os glicanos de várias espécies de plantas.
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Protocol
1. coleta de amostra
- Compra de diferentes cultivares de fresco rabanete (Raphanus sativus L.).
2. isolamento da proteína de rabanete
- Homogeneizar a cerca de 100 g de rabanete fresco com um misturador de cozinha para 10 min.
- Transferi o chorume para um tubo de centrífuga de 50 mL e centrifugação a 14.000 × g a 4 ° C por 20 min remover o material insolúvel.
- Transferir o sobrenadante cuidadosamente para um novo tubo de centrifugação de 50 mL e adicionar um volume igual de solução de ácido tricloroacético (TCA) de 2m.
Nota: Adicionar TCA irá precipitar proteínas solúveis (glicogénio). - Centrifugar a 14.000 × g a 4 ° C por 30 min e retirar o sobrenadante as proteínas peletizadas (glicogénio).
- Lave a pelota com 20 mL de água desionizada e centrifugação a 14.000 × g a 4 ° C por 5 min remover polissacarídeos e oligossacarídeos solúveis.
- Repita a etapa 2.5. quatro vezes.
- Re-suspenda as pelotas em 1 mL de água desionizada e transferir para um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
3. preparação da N- os glicanos
- Mix 50 µ l da solução da proteína da etapa 2.7. (igual a 5 g de rabanete fresco) com 0,2 mU de recombinantes PNGase H+ no ácido acético de 10 mM.
- Incube a mistura a 37 ° C por 12 h. Após a incubação, centrifugar a 14.000 × g por 5 min remover a proteína extra e a enzima.
- Transferi o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
4. purificação de N- os glicanos
- Preparar a coluna de extração de fase sólida (SPE) para enriquecer os N- glicanos e remover os sais e outras impurezas da mistura da reação, aumentando a seletividade do fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) rotulagem agente para N- glicano derivatização.
- Adicione 3 mL de água desionizada para lavar a coluna.
- Adicione 3 mL de solução de acetonitrila 80% contendo ácido trifluoroacético (TFA, 0,1% v/v) para o ativo a SPE-coluna.
- Adicione 3 mL de água desionizada para equilibrar a coluna da SPE.
- Transferir a amostra da etapa 3.3 na coluna e descartar o escoamento.
- Adicione 1,5 mL de água desionizada para lavar a coluna e descartar o escoamento.
- Eluir os lançado N- os glicanos da coluna usando 1,5 mL de solução aquosa de 20% acetonitrila, contendo 0,1% TFA (v/v) em um tubo de centrífuga de 2 mL.
- Remova o solvente por evaporação centrífuga à temperatura ambiente. Evapore até que a amostra esteja completamente seca.
5. fluorescência derivatização de N- os glicanos
- Prepare-se 1 mL de solução 2-AB, consistindo de 35 mM 2-AB e 0,1 M cyanoborohydride de sódio em solução de ácido acético/sulfóxido de dimetilo (7:3, v/v).
- Adicione 5 µ l de solução 2-AB, para as amostras secas (etapa 4.5.) derivada de seis diferentes rabanetes. Vórtice de cada amostra até completamente dissolvida.
- Incubar a mistura durante 2 h a 65 ° C.
- Deixe a amostra esfriar até à temperatura por 5 min e adicione 5 µ l de água deionizada e 40 µ l de acetonitrilo. Centrifuga os tubos a 14.000 x g, durante 3 min.
- Transferi 48 µ l do sobrenadante para um tubo HPLC de alta recuperação de µ l 300. Armazene as pyrazole N- glicano amostras a-20 º C por até um mês.
6. UPLC-uma caracterização das N- os glicanos
- Analise as amostras usando um sistema UPLC padrão conectado a um detectorset de fluorescência on-line em comprimentos de onda de excitação/emissão de 330 nm/420 nm, respectivamente.
- Use uma cromatografia líquida de interação hidrofóbica (uma)-coluna de glicano UPLC à temperatura de 60 ° C, para a análise de coluna.
- Preparar o solvente A diluir 50 mL da solução (solução de formiato de amônio 1 M, pH 4,5) com 950 mL de líquido cromatografia / espectrometria de massa (LCMS)-grau de água. Prepare a solução-mãe da seguinte maneira:
- Adicionar 43 mL de ácido fórmico a 700 mL de LCMS-classe H2O.
- Ajuste o pH para 4,5 por adição gota a gota de solução aquosa de amoníaco (25% w/w).
- Transferir o solvente para uma proveta graduada e encher a 1000 mL com LCMS-classe H2O. loja a 4-6 ° C por até 3 meses.
- Usar o LCMS-grau acetonitrilo como solvente B.
- Separe os N- glicanos com a seguinte gradiente eluição:
- Comece adicionando 95% do solvente B em solvente r. conjunto a taxa de fluxo em 0,5 mL/min de 0 para min 44,5.
- De min 0 a 6 min, gradualmente diminua a proporção do solvente B com um % to78 gradiente linear.
- De 6 min a min 44,5, gradualmente diminua a proporção do solvente B com um gradiente linear para 55,9%.
- De 44,5 min a min 46,5, rapidamente diminuir a proporção do solvente B com um gradiente linear de 55,9% para 0% e segurar a 0% por 2 min e iniciar a lavagem da coluna. Reduza a taxa de fluxo para 0,25 mL/min de 44,5 a 55 min.
- Lavar a coluna ainda mais aumentando o solvente B a 95% de 48,5 min a min 50,5 e segurar a 95% para 4,5 min.
- Re-equilibrar a coluna para as condições de partida de 95% solvente B em 0,5 mL/min de 50,5 para 57 min.
- Injecte 45 µ l da amostra no sistema UPLC.
- Eluir os N- os glicanos por UPLC com tempos de retenção entre 15 e 40 min.
- Recolher a cada fração de pico UPLC observada usando tubos de centrífuga de 2ml e secar as amostras por evaporação centrífuga.
- Injete aproximadamente 1 pmol de 2-AB rotulado dextrano padrão (2−20 unidades de glicose) para calibrar a planta -N- glicano perfis e atribuir seus tempos de eluição em unidades de glicose padronizada.
7. MALDI-TOF MS Analysis
- Dissolver as amostras da etapa 6,8 em 5 µ l de LCMS-grau de água. Misturar 1 µ l da solução da amostra e 1 µ l de solução (ATT) (0,3% p/v em acetonitrila aquosa 70% v/v) 6-aza-2-thiothymine e a pipeta a mistura sobre o transportador de amostra de MALDI-TOF.
- Analise as amostras usando um instrumento de espectrômetro de massa MALDI-TOF em íon positivo modo pressionando o botão Iniciar .
- Analise os espectros de massa usando o software de análise que acompanha MALDI-TOF-MS.
- Interprete os espectros usando uma fonte aberta glicano interpretação software19. Definir os parâmetros de pesquisa para 2-AB etiquetando, [Na + M]+e definir o parâmetro de precisão Da 2.0.
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Representative Results
A Figura 1 mostra uma visão esquemática do protocolo descrito, incluindo o isolamento de proteínas (Glico-) de rabanete, a preparação de N- os glicanos, a análise UPLC e a análise de MALDI-TOF-MS desses componentes. A Figura 2 mostra representativas cromatogramas UPLC do pyrazole N- os glicanos dos cultivars rabanete analisados. A Figura 3 mostra os resultados obtidos das estruturas 2AB-derivatizado N- glicano usando espectrometria de massa MALDI-TOF. A Figura 4 mostra a composição quantitativa de N- os glicanos de cada cultivar de rabanete.
Figura 1 : Visão esquemática do método análise descrito para os N- glicanos lançados de glicoproteínas rabanete. O método inclui a preparação de proteínas (Glico-) e os N- glicanos, UPLC perfis e análise de MALDI-TOF-MS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : N -glicano perfis de 2-AB rotulado N - os glicanos. Os N- glicanos são isolados do rabanete vermelho, verde rabanete, nabo gegeol, daikon, rabanete cereja e rabanete melancia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Análise espectrométrica de massa N - glicano amostras isoladas por uma-UPLC. Os N- glicanos em cada espectrograma são coletados pelo pico do mesmo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Composição quantitativa de N - os glicanos de cada cultivar de rabanete. Os tamanhos dos círculos e crescentes representam a abundância relativa as 2AB-rotulado N- os glicanos de glicoproteínas de rabanete. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresentamos aqui o protocolo permite a comparação dos perfis de vários cultivares de rabanete - glicano N. Uma vantagem significativa do método comparado com protocolos existentes é que nenhuma alteração de tampão entre a liberação enzimática de N- os glicanos e a reação de derivatização com 2-AB é necessárias. O passo mais crítico deste procedimento é a purificação do N- os glicanos usando a coluna SPE, como falha para remover os sais ou outras impurezas na mistura de reação podem afetar negativamente a eficiência de derivatização de fluorescência. O método apresentado aqui apenas permite a avaliação da abundância relativa de diferentes N-os glicanos; quantificação absoluta requereria a adição de um padrão interno (como maltopentose) no passo 2.1.
Alternativamente, o agente de derivatização utilizado aqui (2-AB) pode ser facilmente modificado usando 2-aminopiridina (2-AP) ou outros agentes de derivatização. Os obtidos N- glicano derivados da etapa 5.3 podem também ser separados por cromatografia de exclusão (SEC), forte ou fraco ânion troca cromatografia (SAX ou cera), ou métodos HPLC de fase reversa (embora provavelmente com resolução inferior). Para além disso, verifique se as estruturas do N- os glicanos, tratamentos exoglycosidase sequencial podem ser usados após etapa 5.3 para caracterizar a estrutura das N- glicanos com mais detalhes. Finalmente, as amostras da etapa 6,8 poderiam ser analisadas mais usando MALDI-TOF-MSn-com base em métodos de fragmentação. Possíveis aplicações futuras do nosso protocolo incluem a investigar os efeitos de saúde e função de N- os glicanos de rabanete ou outras espécies de plantas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pela Fundação ciência Natural da China (conceder números 31471703, A0201300537 e 31671854, J.V. e ll, conceder número 31470435 para G.Y.) e o plano de talentos estrangeiros 100 (número de concessão JSB2014012 de J.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
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