Summary
Biz hazırlık ve N- glukanlardir turp (Raphanus sativus) farklı çeşitlerin üzerinden analizi için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Onlar cross-reactive, Anti kışkırtan bağışıklık yanıtı potansiyel bir kaynak olarak son yıllarda büyük ilgi, bitkilerin karbonhidrat moieties aldık. Buna ek olarak, karbonhidrat yapıları da bitki metabolizmasında kritik bir rol oynamaktadır. Burada, hazırlama ve N- glukanlardir turp (Raphanus sativus) farklı çeşitlerin üzerinden bir N- glycanase özel bitki kaynaklı karbonhidrat yapılarının sürülmesi kullanarak analiz için basit ve hızlı bir yöntem mevcut. Bunu başarmak için ham trichloroacetic asit precipitates turp homogenates, PNGase H+ile tedavi ve 2-aminobenzamide floresan etiket olarak kullanarak etiketli. Etiketli N- glycan örnekleri daha sonra ultra performans sıvı kromatografi (UPLC) ayırma ve matris yardımlı Lazer Desorpsiyon iyonlaşma-uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi detaylı yapısal için süreyi tarafından analiz edildi değerlendirme ve N- glycan turp elde edilen yapıların göreli abundancies ölçmek için. Bu protokolü de N- glukanlardir diğer çeşitli bitki tür analizi için kullanılabilir ve daha fazla araştırma yapılması işlev ve N- glukanlardir insan sağlığı üzerindeki etkileri için yararlı olabilir.
Introduction
Önceki araştırma N- glukanlardir Alerjik yanıt-e doğru1,2 kışkırtmak immünolojik cross-reactions potansiyel bir kaynak vurgulanmış bulunmaktadır olarak N- glukanlardir tesislerinde son yıllarda artış dikkat çekiyor . N- glukanlardir bitki glikoproteinlerin üzerinde katalitik aktivitesi3,4, thermostability ve katlama5,6 veya hücre altı yerelleştirme etkileyebilir daha önce kanıtlanmıştır ve salgı7. Glycan yapıları ile ilgili işlevleri ilişkilendirmek için N- glukanlardir ilk glikoproteinlerin kimyasal veya enzimatik yayımlanması gerekir. N- ve O- glukanlardir serbest bırakmak için klasik kimyasal yöntem β-hangi azaltma borhidrür alditol8verim ile alkali örnek tedavi eşlik eder, ortadan kaldırılmasıdır. Ancak, bu yordamı bir fluorophore ile etiketleme önler ve yaşam üniteleri önemli çürüme azaltmak glycan yapısı sonundan itibaren neden olur. Kimyasal deglycosylation amonyum hidroksit/karbonat tedavisine göre de yaygın olarak kullanılan alternatif yöntem9' dur. Bu kimyasal ürün yöntemlerin hiçbiri sağlam proteinler, aynı kitle aralıkta etiketlenmemiş glycan havuzları peptid parçaları müdahale olmadan kitle spektrometrik analizi sağlayan alçaltır. Ancak, bu yöntemlerin bir dezavantajı artan bozulma α1, 3-fucosylated N- glukanlardir, ortak bir karbonhidrat yapısı bitkiler10içinde bulunan oranıdır. Alternatif olarak, peptid kullanarak tekrar tekrar enzimatik yayın yöntemleri:N- glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) de yaygın olarak uygulanan. Rekombinant PNGase F (dan Flavobacterium meningosepticum) en yaygın seçim ve N- glukanlardir, taşıyan bir çekirdek α1, 3 fucose11,12yapıları dışında her türlü yayın izin verir. Bu nedenle, PNGase A (badem tohumları izole) genellikle bitki N- glukanlardir13analizi için kullanılır. Ancak, bu enzim deglycosylates sadece proteolytically elde edilen glycopeptides ve deglycosylate yerel glikoproteinlerin14' e değiştiremiyor. Bu nedenle, bir çok adımlı örnek testleri daha geniş glukanlardir, özellikle de düşük bereket15kaybolmasına neden analiz daha önce gereklidir. Yöntem genel amacı basit ve sağlam bir şekilde etiketleme floresans ve N- glycan sürümü için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışı sunmaktır. PNGase H+, geçtiğimiz günlerde Terriglobus çevresi keşfedilmiştir ve recombinantly E. coliifade edilebilir, N- glukanlardir doğrudan doğruya--dan içinde asidik protein iskele hidrolize temel mantığı olduğunu koşullar16. PNGase H+ üzerinde alternatif yöntemler kullanarak bir anahtar tepki arabellekleri17,18değiştirmeden floresan etiketleme tepkiler aynı tepki tüp içinde gerçekleştirilebilir bir avantajdır. Bu yöntem basit hazırlık koşulları ve yüksek düşük-bereket oligosakkaritler kurtarılması N- glukanlardir analizinde değerli bir araç olun. Bu iletişim kuralı, N- glukanlardir çeşitli bitki türleri üzerinden analizi için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. örnek koleksiyonu
- Taze turp (Raphanus sativus L.) farklı çeşitlerin satın.
2. izolasyon-in Protein turp
- 10 dakika için bir mutfak blender ile yaklaşık 100 gr taze turp lunaparkçı.
- Bulamaç 50 mL santrifüj tüpü ve santrifüj 14.000 × g çözünmez malzeme çıkarmak 20 dk için 4 ° C'de de aktarın.
- Süpernatant dikkatli bir şekilde yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarmak ve 2 M trichloroacetic asit (TCA) çözüm eşit bir hacmi ekleyin.
Not: TCA ekleme çözünür (glyco) proteinler çökelti. - 14.000 × g 30 dk için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant pelleted (glyco) proteinler kaldırın.
- 14.000 × g çözünür oligosakkaritler ve polisakkaritler kaldırmak 5 min için 4 ° C'de, Pelet 20 mL deiyonize su ve santrifüj ile yıkayın.
- 2.5 arasındaki adımları yineleyin. dört kez.
- Granül 1 ml deiyonize su ve taze 1,5 mL santrifüj tüpü transfer yeniden askıya alma.
3. N- glukanlardir hazırlanması
- Mix 50 µL protein çözüm adım 2.7. (5 g taze turp eşit) 0.2 mU rekombinant PNGase h+ 10 mM asetik asit ile.
- Reaksiyon karışımı için 12 h 37 ° C'de kuluçkaya. Kuluçka sonra santrifüj kapasitesi 14.000 × g ekstra protein ve enzim kaldırmak 5 min için de.
- Süpernatant temiz 1.5 mL santrifüj tüpü aktarın.
4. N- glukanlardir arınma
- N- glukanlardir zenginleştirmek ve N- glycan için fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) etiketleme Aracısı selectivity artan tepki karışımından tuzları ve diğer kirleri çıkarmak için katı fazlı ayıklama (SPE) sütun hazırlamak derivatization.
- 3 mL deiyonize su sütun yıkamak için ekleyin.
- Trifluoroacetic asit (TFA, % 0,1 v/v) etkin içeren % 80 Asetonitril çözüm 3 mL SPE-sütun ekleyin.
- 3 mL deiyonize su SPE-sütun equilibrate ekleyin.
- Örnek adım 3.3 sütuna aktarmak ve akışı aracılığıyla atın.
- 1.5 mL deiyonize su sütun yıkayın ve akışı üzerinden atmak için ekleyin.
- Yayımlanan N- glukanlardir 1.5 mL %0,1 içeren sulu % 20 Asetonitril çözüm kullanarak sütundan elute TFA (v/v) 2 mL santrifüj tüpü içine.
- Çözücü, oda sıcaklığında santrifüj buharlaşma çıkarın. Örnek tamamen kuru olana buharlaşır.
5. floresan Derivatization, N- glukanlardir
- 1 mL dimetil sülfoksit/asetik asit solüsyonu (7:3, v/v) 35 mM 2-AB ve 0.1 M sodyum cyanoborohydride oluşan 2-AB çözeltisi hazırlamak.
- 2-AB çözüm kurutulmuş örnekleri (adım 4.5.) 5 µL altı farklı turp türetilmiş ekleyin. Girdap her örnek kadar tamamen dağıldı.
- 65 ° C'de 2 h için karışım kuluçkaya
- 5 min için örnek soğumaya aşağı oda sıcaklığına ve 5 µL deiyonize su ve Asetonitril 40 µL ekleyin. 14.000 x g 3 dk de tüpler santrifüj kapasitesi.
- 48 µL süpernatant 300 µL yüksek-kurtarma HPLC şişe aktarın. Derivatized N- glycan örnekleri-20 ° c ilâ bir ay için saklayın.
6. HILIC UPLC N- glukanlardir profil oluşturma
- Bir online floresan detectorset 330 nm/420 nm, uyarma/emisyon dalga boylarında, sırasıyla bağlı standart bir UPLC sistem kullanarak örnekleri analiz.
- Hidrofobik etkileşim sıvı kromatografi (HILIC) kullanın-60 ° c analizi için bir sütun ısıda UPLC glycan sütun.
- Çözelti A hisse senedi çözüm (1 M amonyum Formiat çözüm, pH 4.5) 50 mL sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LCMS) 950 mL ile sulandrarak hazırlamak-sınıf su. Hisse senedi çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın:
- Formik asit 43 mL LCMS-grade H2o 700 mL için eklemek
- PH 4.5 için dropwise buna ek olarak sulu amonyak çözüm (% 25 w/w) tarafından ayarlayın.
- Çözücü bir ölçüm silindir aktarmak ve 1000 mL 3 aya kadar LCMS-grade H2o mağaza 4-6 ° c ile doldurun.
- LCMS-grade Asetonitril solvent B. kullanın
- N- glukanlardir ile aşağıdaki degrade elüsyon ayırın:
- Çözücü B % 95'i solvent A. küme akış hızı 0.5 mL/dk 0 ile 44,5 min için ekleyerek başlayın.
- 6 dk 0 dk yavaş yavaş çözücü B doğrusal degrade to78% oranını azaltmak.
- 44,5 dk 6 dk yavaş yavaş çözücü B %55.9 doğrusal gradyan ile oranını azaltmak.
- 44,5 min 46,5 dk dan hızla çözücü B %0 %55.9 doğrusal gradyan ile oranını azaltmak ve %0 2 min için tutun ve çamaşır sütun başlatın. 0.25 mL/dk akış oranını 44.5 üzerinden 55 dk. için azaltmak.
- Çözücü B %95 50,5 dk 48,5 dk dan artırarak daha fazla sütun yıkama ve %95 4,5 dakika tutun.
- Sütun % 95 çözücü B 0.5 mL/dk başlangıç koşulları 50,5 57 dk dan yeniden equilibrate.
- Örnek 45 µL UPLC sistemi içine enjekte.
- 15 ila 40 dk arasında saklama süreleri ile N- glukanlardir UPLC tarafından elute.
- 2 mL santrifüj tüpleri kullanarak her gözlenen UPLC tepe kısmını toplamak ve örnekler santrifüj buharlaşma tarafından kuru.
- 2-AB dextran standart (2−20 glikoz birimleri) bitki -N- glycan profil oluşturma kalibre ve onların elüsyon kez standart glikoz birimlerine atamak için etiketli yaklaşık 1 pmol enjekte.
7. MALDI-TOF MS Analizi
- Adım 5 6,8 µL LCMS, örneklerinden çözülür-sınıf su. Mix 1 µL örnek çözümü ve 6-aza-2-thiothymine (ATT) çözüm (% %0,3 70 v/v sulu Asetonitril içinde w/v) ve pipet MALDI-TOF örnek taşıyıcı üzerine karışımı 1 µL.
- Başlat düğmesine basarak pozitif iyon modunda bir MALDI-TOF Kütle Spektrometre enstrüman kullanarak örnekleri analiz.
- Kitle spectra eşlik eden MALDI-TOF-Bayan analiz yazılımı kullanarak analiz.
- Bir açık kaynak glycan yorumu yazılım19kullanarak spectra yorumlamak. 2-AB [M + Na]+, etiketleme, arama parametrelerini belirlemek ve 2.0 Da doğruluk parametresini ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 açıklanan protokol yalıtım proteinlerin (glyco-) turp, N- glukanlardir hazırlanması, UPLC analiz ve bu bileşenleri MALDI-TOF-Bayan analizi de dahil olmak üzere, şematik bir dökümünü gösterir. Şekil 2 derivatized N- glukanlardir analiz turp çeşitlerin temsilcisi UPLC chromatograms gösterir. Şekil 3 2AB-derivatized N- glycan yapıları MALDI-TOF-Kütle spektrometresi kullanılarak elde edilen sonuçları gösterir. Şekil 4 N- glukanlardir gelen her turp çeşidinde nicel kompozisyonu gösterir.
Resim 1 : N- glukanlardir turp glikoproteinlerin serbest bırakmak için açıklanan analiz yönteminin şematik genel bakış. Yöntem (glyco-) proteinler ve N- glukanlardir, UPLC profil oluşturma ve MALDI-TOF-MS analizleri hazırlanması içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : N 2-AB etiketli - glycan profilleri N - glukanlardir. N- glukanlardir kırmızı turp, yeşil turp, gegeol turp, daikon, kiraz turp ve karpuz turp izole edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Spektrometrik Analizi kitle N - glycan örnekleri HILIC-UPLC tarafından izole. N- glukanlardir her spektrogram içinde aynı tepe tarafından toplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Nicel bileşimi N - glukanlardir--dan her turp çeşidinde. Daireler ve hilal boyutları turp glikoproteinlerin 2AB etiketli N- glukanlardir göreli bolluğu temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada sundu iletişim kuralı turp çeşitli çeşitlerin N- glycan profilleri karşılaştırmasını sağlar. Varolan iletişim kurallarına göre bu yöntemin önemli bir avantaj enzimatik serbest bırakmak-in N- glukanlardir ve derivatization reaksiyon 2-AB ile arasında hiçbir arabellek değişiklikleri gerekli olmasıdır. N- glukanlardir tuzları kaldırmak için başarısızlık olarak SPE sütun kullanarak arıtma, bu yordamın en önemli adımdır veya diğer kirleri tepki karışımı floresan derivatization verimliliği olumsuz yönde etkileyebilir. Yöntem olarak burada sunulan yalnızca farklı N -glukanlardir göreli zenginliği değerlendirilmesi verir; Mutlak miktar adım 2.1 (örneğin maltopentose) dahili bir standart eklenmesi gerekir.
Alternatif olarak, burada kullanılan derivatization Ajan (2-AB) 2-aminopyridine (2-AP) veya diğer derivatization ajanlar kullanılarak kolayca değiştirilebilir. Elde edilen N- glycan türevleri adım 5.3 boyutu dışlama Kromatografi tarafından (sn), güçlü aynı zamanda ayrılabilen veya zayıf anyon Döviz Kromatografi (SAX veya balmumu) veya ters fazlı HPLC Yöntem (büyük olasılıkla her ne kadar düşük çözünürlük ile). N- glukanlardir, yapılarının daha da doğrulamak için sıralı exoglycosidase tedaviler 5.3 adımdan sonra N- glukanlardir daha fazla bilgi ile yapısını tanımlamak için kullanılabilir. Son olarak, adım 6,8 örneklerinden çözümlenmesi MALDI-TOF-Bayannkullanarak daha fazla-parçalanma yöntemleri temel. N- glukanlardir turp veya diğer bitki türü işlev ve sağlık etkilerini araştıran bizim Protokolü'nün olası gelecekteki uygulamalar içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser kısmen Çin doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (sayı 31471703, A0201300537 ve 31671854 J.V. ve ll, G.Y. için sayı 31470435 izni grant) ve 100 yabancı yeteneklerini planı (grant sayıya JSB2014012 J.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
- Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
- Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
- Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
- Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
- Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
- Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
- Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
- Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
- Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
- Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
- Fan, J. -Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
- Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
- Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
- Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
- Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
- Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
- Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
- Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).
