Summary
Vi har utvecklat ett enkelt och mångsidigt system för att mata hårda fästingar på laboratoriet kaniner. Våra icke-mödosamma protokollet använder lättillgängligt material och kan justeras beroende på kraven i olika experimentella inställningarna. Metoden tillåter bekväm övervakning eller provtagning av fästingar under hela utfodring.
Abstract
Användning av levande djur i tick forskning är avgörande för en mängd olika experimentella syften inklusive underhåll av hårda fästingen kolonier i laboratoriet. I fästingar, alla utvecklingsstadier (förutom ägg) blodsugande och förvärva en blod-måltid när bifogas deras ryggradsdjur värdar är avgörande för det framgångsrika slutförandet av deras livscykel. Här visar vi en enkel metod som använder enkelt öppningsbar kapslar för utfodring av hårda fästingar på kaniner. Fördelarna med den föreslagna metoden är dess enkelhet, kort varaktighet och viktigast mångsidig anpassning till behoven hos specifika experimentella krav. Metoden möjliggör användning av flera kamrar (olika storlekar) på samma djur, som tillåter utfodring av flera stadier och olika experimentella grupper samtidigt minska kravet på övergripande djur. Icke-irriterande och lättillgängligt material används minimerar obehag för djuren, som kan enkelt återvinnas från ett experiment och erbjuds för antagandet eller återanvändas om etiska protokollet tillåter det.
Introduction
Hårda fästingar (Ixodidae) är väl kända som långsam matning leddjur och kan fästas på en värd för flera dagar eller veckor, beroende på art och utvecklingsmässiga stage1. Dessa obligatoriska blodsugande leddjur är vektorer av en mängd olika smittämnen, till exempel bakterier, protozoer och virus, och således utgör en betydande risk för människor och djurs hälsa1. När studera tick biologi eller utvärdera nya kontrollmetoder, inrättandet av en effektiv fästing matningssystem är avgörande för att effektivt designa experiment och uppnå mål för studien. Nyligen, flera konstgjorda tick utfodringssystem (undvika användning av levande djur) har varit utvecklade2,3,4 och de bör användas när det är möjligt. Emellertid, dessa system har inte kunnat helt ersätta fästingen livnär sig på levande djur, och de är inte passande substitut för många fysiologiska tillstånd krävs för vetenskapliga studier. Därför i vissa fall är användning av experimentella djur värdar avgörande för att garantera relevansen av experimentella resultat.
Laboratoriet nya Zeeland kaniner har visat sig vara de mest lämpliga och tillgängliga värdarna för flera ixodid fästing arter5,6,7,8,9. Två vanliga strategier av fästingen livnär sig på kaniner har använts ofta: a) utfodring på kaninöron täckt med bomull tyg eller strumpor6,7, och b) utfodring i bomull väskor9, nylon flaskor10 eller neopren Chambers11 limmas på kaninens rygg. Utfodring på kaninens öron är inte ett elegant system, eftersom fästingar (särskilt den tidiga stadier, larver och nymfer) kan krypa och bifoga djupt i hörselgången, som är obehagligt för djuret och gör övervakningen av tick utfodring och/eller återvinning av svullna fästingar är svårt. Detta system är också begränsad till endast två tick grupper på öronen helt omfattas av strumpor som skyddas av elisabetanska krage, som representerar en betydande obehag för djuret. Andra system9,10,11 är definitivt mer avancerade och väl lämpade för hårda fästingen kolonin underhåll. De är dock begränsade i antalet experimentella grupper placeras på kanin samt i utfodring kamrarna modifierbara storlekar/former. Dessutom kräver dessa protokoll ofta haltandet bakre kanin benen för att undvika repor och användningen av elisabetanska krage att förhindra grooming.
Häri föreslår vi en enkel, icke-mödosamma och mycket effektiv metod för att mata flera grupper av hårda fästingar i slutna avdelningar limmade till kaninen tillbaka omfattas av en jacka, vilket eliminerar behovet av elisabetanska krage eller haltandet under experimentet. Speciellt, använder vårt system elastiska kapslar från en etylen-vinyl acetat (EVA) skumskiva omfattas av mygga mesh och limmade till rakade kaninen tillbaka med snabbt stelnar (3 min) icke-irriterande latex lim. Denna teknik möjliggör fastsättning av flera kapslar av önskad storlek eller form, och några veckor efter experimentet kaninerna är helt återställd. Systemet lämpar sig främst för etapperna som nymphal och vuxen hårda fästingen, men med en liten modifiering kan det användas för larver utfodring samt. EVA skum-baserade metoder för hårda fästingen utfodring kan anpassas till andra typer av vertebrate värdar, till exempel får (som visas som ett av alternativen i denna uppsats).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: I denna studie, bibehölls kaniner i standard burar med mat och vatten erbjuds ad libitum vid den franska byrån för mat, miljö och hälsa & säkerhet (ANSES) ackrediterade djur faciliteter i Maisons-Alfort, Frankrike. Djur har övervakats två gånger dagligen av två erfarna tekniker för onormala hudreaktioner, hälsoproblem eller komplikationer. Experimentell rummet säkrades genom inramning interiören i dörröppningen med dubbelhäftande tejp för att undvika oavsiktlig flykten av fästingar. Metoden fungerar bäst om två personer arbetar som ett team, men det är möjligt att slutföra singel hand av en erfaren person. Även om de flesta kaniner är fogliga och lugn, uppstå tecken på stress under manipulation. För att säkerställa att en kanin inte skadar sig av kämpar, manuell fasthållning kan åstadkommas genom att försiktigt hålla av kragen i nacken i ena handen medan den andra handen stöder det hind kvartalen. De sex månaden gammal, Rambouillet kvinnliga fåren hölls vid centret för biomedicinsk forskning (CRBM) Faciliteter på den nationella veterinära skola av Alfort (kombinerade), där vatten och mat var medföljande ad lib, och det var kontrolleras två gånger dagligen.
Obs: Vårt laboratorium har fått tillåtelse att använda kaniner och fåren för tick utfodring av etikkommitté för djur experiment ComEth Anses/kombinerade/UPEC, tillåta nummer 01741.01 och 11/10/16-5B, respektive. Eftersom vi använde bara patogenfria fästingar i våra experiment, erbjöds alla kaniner används i denna studie antas via föreningen vit kanin, Paris, Frankrike.
1. beredning av kapslar
- Skär den önskade storleken på kapseln från EVA skum arket (figur 1A). Runt den yttre hörnor (figur 1B) av kapseln att minimera oavsiktlig lossnar när limning det till kanin huden.
Obs: Frame tjockleken av kapseln bör vara ca 8 mm. Använd en 5 mm tjock cellplast för larver, nymfer och liten fästing vuxen arter såsom Ixodes. En 1 cm tjocklek skum är lämplig för stor storlek vuxna fästingar som Amblyomma sp., Hyalomma sp., etc. kapseln varierar baserat på de experimentella krav. Till exempel för 20 Ixodes vuxna par, 200 nymfer eller 1000 larver använder vi en inre kapsel storlek 5 x 5 cm2, 6 x 7 cm2 eller 7 x 9 cm2, respektive. - Skär den 8 mm breda remsor av självhäftande krok tejpa (se Tabell av material) och hålla dem till beredda EVA skum ram (figur 1C).
- Skär de samma storlek remsorna från självhäftande slinga tape (se Tabell av material) och binda dem till krok sidorna kopplade till EVA-skum ram (figur 1D).
- Skär lämplig storlek av fina mygga mesh (maskstorlek mindre än 50 µm) storleken på ramen EVA skum och hålla det till självhäftande slingan (figur 1E och 1F). Skär överhäng vid behov.
Obs: Denna typ av kapsel kan användas till foder nymfer och vuxna svårt fästing arter, medan ett annat tätning system av kapslar behövs för larval feeding (kompletterande Figur1) att förhindra oavsiktlig flykten av larverna via den fästa krok-och-loop sida.
2. beredning av kaninen innan tickande Infestation
- Raka området i kanin baksidan och sidorna för att användas med clippers (figur 2A).
- Tillämpa icke-irriterande latex lim på hela ytan av beredda kapseln och vänta 1 minut (figur 2B).
- Limma kapseln genom att trycka på huden (speciellt vid hörnen) med fingrarna i ca 3 minuter (figur 2 c och 2D).
Obs: När limning mer än en kapsel, se till att hålla minst 5 mm mellanrum mellan dem (figur 2E och 2F). Vi undvika brukar regionen i ryggraden, men det kan användas om det behövs. - Lyft kapslarna för att visuellt kontrollera deras fastsättning på huden. Om icke-anslutna regioner finns, applicera limmet med en spatel och tryck på för ytterligare 3 minuter.
- Gäller skyddstejp bakre tassarna för kaninen att förhindra jacka skador (figur 2G).
Obs: Detta steg är valfritt och är främst att förhindra jacka skador, inte skador på fästing kapseln. - Sätta på kanin jackan genom att placera främre benen genom öppningarna och strama halsen, att göra säker på kanin andas återstår bekväma. Inte placera de bakre benen genom de elastiska kapslingarna i detta steg och lämna dragkedjan öppen (figur 2H).
3. tickande Infestation
- Placera fästingen i en Plastspruta (1 eller 5 mL beroende på antalet individer) med nål-slutet skär och pluggas med bomull (figur 1G). Om en liten mängd av fästingar är vara infekterad, använda pincett.
Obs: För tick kolonin underhåll ger svullna fästingen female(s) att lägga ägg med efterföljande kläckning inuti sprutan (5 eller 10 mL) omfattas av mygga mesh lindade med ett gummiband12 för att undvika mödosamt manipulation av larverna på gång de är tillämpas på mottagande (figur 1H). Dessutom helt svullna larver kan tillåtas molt i sprutan (kompletterande bild 1I; 5 eller 10 mL) för direkta angrepp av kaninen med nymfer. - Placera nålen djupt in i kapseln via öppna hörn och Inokulera fästingar genom att trycka sprutkolven. Långsamt vrida kolven mot kanin huden för att avlägsna återstående fästingar knutna till kolven och samtidigt dra det ut ur kapseln (figur 2jag).
Obs: Om några av individerna krypa ur kapseln, returnera dem med pincett. - Återförsluta krok-och-loop tejpen i närheten kapseln.
- Placera de bakre benen av kaninen i den bakre elastisk kapslingar av jacka och zip stängd.
Obs: Kontrollera att ett pekfinger kan passa mellan halsen på jackan och kaninen för komfort och för att undvika tugga på jackan. - Returnera kaninen till buren (figur 2J).
Obs: Tiden från angrepp till samling fylld fästingar variera mellan olika fästing arter och utvecklingsstadierna. Exempelvis för Ixodes scapularis och Ixodes ricinusär varaktigheten för utfodring för vuxna, nymfer och larverna 6 – 9, 3 – 4, 2 – 3 dagar, respektive. En lista över referenser för 29 olika hårda fästingen livscykler under laboratorieförhållanden kan hittas i Levin och Shumacher (2016)9.
4. insamling och övervakning av fästingar
- Ta kaninen från buren till bänken och packa upp jackan.
- Försiktigt hindra kaninen med händerna. Öppna kapseln genom att lossa kroken-och-loop tejpen (figur 2 K och 2 L) och samla fästingar genom borstning den svullna larver (kompletterande bild1) eller nymfer till en plast maträtt eller använda pincett för vuxna (figur 2L ). Om delvis utfodras (inte fylld) fästingar krävs, Använd en tick twister eller pincett för att lossa dem.
Obs: Om att upprätthålla tick kolonierna se anmärkning i steg 3.1. Upprätthålla svullna fästingar i lämpliga fuktiga och temperaturförhållanden enligt de särskilda fästing arterna. - Om det behövs, refasten krok-och-loop bandet Stäng kapseln.
5. återvinning av kanin
- Ta bort den mygga mesh helt från kapseln och lämna jackan på kanin (figur 2M).
- Vänta 3-4 veckor och försöka ta bort kapseln genom att försiktigt beskära ett av hörnen (figur 2N). Om kapseln är fortfarande ordentligt fastsatt, upprepa detta steg en vecka senare.
- Ta bort jackan och låt kaninen återhämta sig i buren.
När kapseln är avstängd, kontrollera huden på kaninen för onormala reaktioner. Även om det krävs normalt ingen behandling, kan en mjukgörande lotion användas vid irritation. - Om protokollet och experiment tillåta, kan återvunna kanin (figur 2O) återanvändas eller erbjuds för antagandet.
Obs: Kaniner har visat att förvärva tick motstånd en gång utsätts för upprepade kryssa infestationer13; Därför rekommenderas reinfestations inte såvida inte experimentet kräver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här föreslår vi för första gången en detaljerad steg-för steg metod för hårda fästingen utfodring i EVA skum kapslar som tillämpas på en rakad kaninens rygg, omfattas av en jacka (figur 1 och figur 2). Detta protokoll är lämplig för olika typer av experiment när olika tick grupper på samma värd krävs och kan också användas för massa uppfödning av hårda fästingar. Fästingen utfodring framgång i laboratoriet mestadels beroende av tick individerna lämplighet och lämplighet för kanin värden för de särskilda fästing arterna, snarare än tekniken själv. Vårt system med EVA-skum kapslar limmade till kaninen tillbaka har visat sig vara framgångsrika när utfodring olika utvecklingsstadierna i olika hårda fästing arter (tabell 1) och kan även anpassas för andra typer av laboratoriet värdar, till exempel () får (Se figur 3).
De främsta fördelarna med denna metod är enkelheten, lättillgängligt material (Tabell av material) och, viktigast av allt, en bekväm Öppna-Stäng systemet möjliggör enkel övervakning av fästingar under utfodring. Denna mångsidiga metod erbjuder dessutom möjlighet till en mängd olika experimentella inställningar baserat på modifierbara antal, form och sammansättning av kapslarna på värden (figur 2D-F), att möta utmaningarna i den särskild undersökning. Användningen av de mycket effektiva, snabbtorkande och icke-irriterande latex lim säkerställer att kapseln är ordentligt limmade i tre minuter och sitter kvar i minst tre veckor. Detta förfarande möjliggör också fullständig återhämtning av kaninen värdar efter experimenten (figur 2O).
Figur 1 : Beredning av EVA skum kapseln och fästingar. (A, B) Skär kapseln från EVA skum. (C) Placera remsor av självhäftande krok tejp till kapseln. (D) bindande loop sida remsorna och peeling tejpen från fästen. (E, F) Sticker den mygga mesh till tejp. (G) exempel på vuxna hårda fästingar inuti sprutan (5 mL) med skurna nål-slutet omfattas av bomull. (H) exempel på nybakade kläckningen larver inuti sprutan med skurna nål-slutet omfattas av mygga mesh hålls på plats av ett gummiband. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Limning kapseln till kaninen, tickande infestation/återhämta och kapsel borttagning. (A) rakad kaninens rygg. (B) tillämpning av limmet beredda EVA skum kapseln. (C, D) Fastsättning av olika storlek kapslar till kaninen. (E, F) Dorsala syn på en kanin som visar två eller flera kammare fäst på baksidan, respektive. (G), tejpen är placerad runt bakre fötterna. (H), jackan tillämpas start från frambenen och hals, och den bakre delen lämnas öppen. Öppettider i hörnet av kapseln visas också. (jag) att placera fästingarna att kapseln via öppna hörnet sprutan. (J), jackan är zippade helt och kaninen flyttas till buren. (K) övervakning fästingar under deras utfodring genom att öppna kapseln. (L) samla fylld fästingar med hjälp av tången. (M) tomma kapseln efter fästing borttagning. (N) avlossning av kapseln (efter 3 – 4 veckor) från kaninen. (O) helt återställd kanin vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : EVA foam system anpassat till fåren. (A) fastsättning av skum kapslarna till en rakade och rengjorda området i den laterala sidan av fåren tillbaka. (B) efter infestation, bifogade kapslarna är täckta med ett bandage (ortopediska stockinette), i stället för en jacka. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fästing arter | Antal smittade fästingar/antal svullna fästingar (%) | ||
| Larverna | Nymfer | Kvinnor | |
| Ixodes ricinus | - | 692/557 (80.49%) | 670/592 (88.35%) |
| Ixodes scapularis | - | - | 40/34 (85%) |
| Dermacentor reticulatus | 3 550/3255 (91,7%) | 900/803 (89.22%) | 323/305 (94,42%) |
| Rhipicephalus appendiculatus | 3.300/2822 (85.52%) | 490/421 (85.91%) | 370/362 (97.83%) |
| Rhipicephalus pulchelus | - | 1 920/1831 (95,36%) | 282/257 (91,13%) |
| Amblyomma variegatum | 332/225 (67.77%) | 404/308 (76.24%) | 207/146 (70.53%) |
| Amblyomma americanum | - | 140/134 (95.71%) | 31/27 (87,1%) |
| Hyalomma excavatum | 1000 * | 510 * (58,8%) | 380/313 (82.36%) |
Tabell 1: Mjölkstockning andelen olika utvecklingsstadier av hårda fästing arter livnär sig på kaniner släpper EVA-skum kapslar. * Tack vare snabb ömsat processen för H. excavatum omogna stadier, var svullna larverna (inga data anges) kvar för att molt till nymfer som därefter svullna i samma kapsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det viktigaste steget i hela protokollet är att limma kapseln ordentligt till rakade huden. Av denna anledning är konstant tryck i minst 3 minuter kritisk, särskilt i hörnen. När ympning fästingar i kapseln, är det viktigt att tillämpa dem djupt in i motsatt hörn från den öppna till undvika tick fly under försegling. När du planerar experiment, se till att alla kapslar omfattas av jackan att undvika skador genom tuggning eller repor. Kontrollera att hals regionen av jackan är hårt nog för att förhindra att tugga men tillräckligt löst att kaninen fortfarande är bekvämt.
En av de främsta fördelarna med den beskrivna tekniken är dess enkelhet och att ändringar i fråga om storlek och antal kapslarna kan användas. Under våra experiment observerades inte avlossning av kapslar från huden. Dock kan enstaka jackan (men inte kapseln) av kaninen skadas.
Hos kaniner har vi observerat att i kapseln, helt svullna-fristående fästingar (främst omogna stadier såsom larver och nymfer) ut snabbare på grund av temperaturen på kaninen. Av denna anledning föreslår vi för att uppskatta den utfodring varar särskilt fästing arter och scenen, att planera svullna kryssa samling omedelbart efter deras lösgörande. Även om vårt system har testats för utfodring av olika hårda fästing arter (tabell 1), är kaninen inte en naturlig värd för alla hårda fästing arter14. Denna begränsning kan övervinnas genom att anpassa detta system till andra djur värdar som är lämplig för en särskilt hård fästing arter. Här rapporterade vi användning av EVA skum systemet anpassas till fåren att mata alla utvecklingsstadierna i I. ricinus (figur 3). I detta fall behöver fåren rakad och tvättad med bomull som impregnerats med 70% etanol att eliminera oljan som är närvarande vid ytan av huden. Samma förfarande som det som beskrivs för kaniner var följde därefter, men istället för en jacka, användes ett bomull bandage runt baksidan som visas i figur 3.
När man utvecklar detta system, uppmärksamhet vi särskild att minimera mängden material som används och steg av förfarandet. Jämfört med andra metoder, använder vi inte narkos, kanin kragar, öra strumpor eller förlamar de bakre benen5,6,7,8,9,10. Dessutom detta protokoll är inte mödosam och ingen intensiv träning krävs för att bli bekant med denna teknik. EVA-skum baserat fästingen matningssystem som beskrivs i denna studie förväntas användas för en mängd olika experiment när man studerar tick biologi, värd-vektor-patogen interaktioner, eller utvärderande olika kontrollåtgärder som akaricider eller vacciner. Vår framtida inriktning kommer att vara anpassa EVA skum kapseln matningssystem till musmodell att mata omogna stadier av hårda fästingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner tekniskt bistånd av Evelyne Le Naour, franska nationella institutet för jordbruks forskning (INRA), Alain Bernier (INRA) och Océane Le Bidel (ANSES). Consuelo Almazán stöddes av ett stipendium från Laboratory of Excellence, integrativ biologi av framväxande infektionssjukdomar (LabEx IBEID), Pasteurinstitutet. ANSES köpte kaniner och får. En del av detta arbete finansierades av National Institutes of Health grant RO1AI090062 Y. Park. Dr Jeffrey L. Blair är erkänt för att granska manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand Rabbits (2.5-3.5 kg) | Charles River | Strain Code 571 | |
| Rambouillet sheep | Local provider-tick free farm | Female 6 months old | |
| EVA foam 5 mm thick | Cosplay Shop | EVA-PE451kg (950mm x 450mm) | 10 mm PE45 kg foam from the Cosplay Shop may be used for the large adult tick species |
| Foam Sheet 9" X 12" 6 mm-White | Amazon | FOAMSHT6-20 | 6 mm-EVA foam ca be ordered via Amazon as an alternative to the foam from Cosplay Shop |
| Full length rabbit jackets | Harvard Apparatus, Inc. | 620077- medium, 6270078 - large | |
| Non-toxic latex glue | Tear mender | Fabric & Leather Adhesive | |
| Tubular cotton orthopedic stockinette | BSN Medical | 9076 (12-15 cm wide) | |
| Mosquito mesh | Loisirs Creatifs | Very fine filter nylon mesh fabric | Any mosquito mesh, or curtain material with the mesh size less than 50 μm is suitable. |
| Leukoplast | BSN medical S.A.S | LF 72361-02 | |
| Adhesive hook-and-loop tape | AIEX store | AIEX 39.37 Feet/12m Hook and Loop Self Adhesive Tape Roll, 20 mm width, white colour | Fullfiled by Amazon |
| Fast drying glue | Fixtout | Superglue |
References
- Sonenshine, D. E., Roe, M. Ticks, People and Animals. Biology of Ticks, Vol I. , Oxford University Press. (2014).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Bonnet, S., Jouglin, M., Malandrin, L., Becker, C., Agoulon, A., L'hostis, M., Chauvin, A. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus.ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
- Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
- Khols, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain Wood Tick, Dermacentor andersoni Stiles. Culture methods for invertebrate animals. , Dover Pubs. New York. (1937).
- Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum Neumann (Acari: Ixodidae) [Coelhos (Oryctolagus cuniculus) como hospedeiros experimentais de Amblyomma dubitatum Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
- Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbits. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
- Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. , Science Publishers Inc. Enfield. (1999).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Bouchard, K. R., et al. Maintenance and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. , Elsevier. San Diego. (2005).
- Jones, L. D., Davies, C. R., Steele, G. M., Nutall, P. A. The rearing and maintenance of ixodid and argasid ticks in the laboratory. Animal Technology. 39, 99-106 (1988).
- Slovák, M., Labuda, M., Marley, S. E. Mass laboratory rearing of Dermacentor reticulatus ticks (Acarina, Ixodidae). Biologia, Bratislava. 57 (2), 261-266 (2002).
- Rechav, Y., Dauth, J. Development of resistance in rabbits to immature stages of the Ixodid tick Rhipicephalus appendiculatus. Medical and Veterinary Entomology. 1, 177-183 (1987).
- Zacarias do Amaral, M. A., Azevedo Prata, M. C., Daemon, E., Furlong, J. Biological parameters of cattle ticks fed on rabbits. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 21 (1), 22-27 (2012).
