本协议描述了从前列腺癌细胞系或组织中提取和丰富磷酸肽持的过程,通过质谱法蛋白质组学分析 phosphoproteome。
Phosphoproteomics 涉及对磷酸化蛋白的大规模研究。蛋白质磷酸化是许多信号转导通路的关键步骤, 是由激酶和磷酸严密调节的。因此, phosphoproteome 的特征可以为肿瘤治疗的新靶点和生物标志物的识别提供见解。质谱为全球检测和量化数以千计的独特磷酸化事件提供了一种方法。然而, 磷酸肽持的丰富程度远远低于非磷酸肽持, 使得生物化学分析更具挑战性。为了克服这种局限性, 需要在质谱分析之前丰富磷酸肽持的方法。我们描述了从组织中提取和消化蛋白质的过程, 然后用抗体基和/或二氧化钛 (2) 为基础, 对酪氨酸和 phosphoserine/苏氨酸 (pST) 肽进行浓缩。浓缩法。用液相色谱-质谱和分析软件对磷酸肽持进行了样品制备和质谱鉴定。
估计有16.5万例新病例和约2.9万人死亡将于2018年发生, 原因是前列腺癌, 这是1美国男性癌症相关死亡的最常见癌症和第二个主要原因。早期前列腺癌可通过切除或放疗治疗器官受限疾病, 其中十年复发率为20% 和40% 的病人谁接受前列腺切除术, 30% 和50% 之间的病人谁接受辐射治疗2。由于前列腺癌依赖雄激素信号促进生长, 手术和化学阉割疗法也被用于高危患者。然而, 复发发生时, 癌症不再对雄激素剥夺治疗的反应证明由生物化学复发, 其中前列腺特异抗原的血清再次上升。在这一进展中, 转移也经常被检测到。这一先进的阶段, 称为转移性去势抗前列腺癌, 代表的致命形式的疾病, 其中的预后是平均生存时间少于两年3。晚期疾病中很少有治疗选择, 包括第二代 antiandrogens, 如 enzalutamide 和阿比特龙, 以及以紫杉为主的化疗, 如多西紫杉醇。尽管有可用的治疗方法, 这种疾病经常会进展。因此, 新的治疗方式的发现和发展对改善前列腺癌晚期患者的护理是必要的。
以质谱 (MS) 为基础的方法通过检测成百上千的多肽分析4, 提供了对蛋白质组的全球解析。特别是, 发现蛋白质组学, 也称为数据依赖获取 (DDA), 可以产生的鉴定和定量的数以千计的肽4,5。基于 MS 的发现蛋白质组学可以进一步界定为自上而下的蛋白质组学, 其中完整的蛋白质特征, 并自下而上 (也称为猎枪) 蛋白质组学, 其中肽分析的特点蛋白质5。因此, 在猎枪蛋白质组学中, 在 MS 分析前的样品制备过程中, 蛋白质的降解步骤是将蛋白分解成多肽。最后, 进行数据库搜索, 将多肽重新映射到蛋白质以进行识别。无标签以及几种同位素标记 [例如, 细胞培养 (SILAC) 中氨基酸的稳定同位素标记] 方法可用于定量比较6、7样品之间的肽。虽然同位素标记技术是黄金标准, 无标签的方法已经证明了类似的量化准确度8,9 , 并有可比的权衡灵敏度和特异性10。无标签定量提供了更多的覆盖率和允许比较更多的样本, 而基于标签的方法受成本和复用容量6、7、8的限制。
此外, 猎枪 MS 也可以用来审问后翻译修改 (PTMs), 如磷酸化11。由于磷酸肽持的化学计量学性质与总肽相比, 采用多种方法丰富磷酸肽持, 包括免疫沉淀抗体为基础的酪氨酸肽、二氧化钛 (2) 和固定化金属亲和层析 (IMAC)5,12。由于蛋白质磷酸化是许多细胞信号通路的关键步骤, 猎枪 phosphoproteomics 允许研究人员研究不同癌症的细胞信号变化, 包括乳房13、前列腺14、肾脏15、和卵巢,16,17 , 以更好地了解癌症生物学和确定潜在的新的治疗目标。
这个无标签猎枪 phosphoproteomic 方法是建立和完善的基础上的工作由 Graeber 组18,19,20。该协议首先描述了蛋白质和磷酸从组织到多肽的提取和消化。然后, 我们详细地利用特异的酪氨酸抗体和2。我们还描述了 phosphoserine/苏氨酸 (pST) 肽使用强阳离子交换 (SCX) 的富集, 其次是2。该协议最后将样本提交到 ms 设备, 并使用 ms 分析软件来识别和量化磷酸肽持及其相应的磷酸。这个协议的应用可以扩展到前列腺癌以外的其他癌症和肿瘤以外的领域。
在使用此协议来丰富磷酸肽持之前, 仔细考虑实验设计是至关重要的。使用生物复制比技术复制更符合成本效益地使用质谱资源。必要的复制数将部分取决于数据的可变性。最近的一项研究表明, 虽然增加三以外的复制数量只会略微增加身份证明的数量, 但各组之间的显著标识数量则随着更多的复制10而增加。
由于细胞中磷酸的丰度较低, 在发现模式下, 从前列腺癌样品中获得一个全球 phosphoproteome 需要足够的起始蛋白质量。在这些实验中, 使用了5毫克的蛋白质。大约五个接近汇合的 15 cm 细胞提供足够的蛋白质作为输入到这个协议, 虽然这将是细胞线依赖性。至于肿瘤组织, 蛋白质的预期产量约为组织重量的 6-8%。在体外设置中, 要考虑的阳性对照样品是在收获细胞前加1毫米钒酸盐30分钟。钒酸是一种具有竞争性的蛋白质 phosphotyrosyl 磷酸酶抑制剂, 它将保持酪氨酸磷酸化, 从而增加了肽鉴定的数量29。
清洁消化是最大限度磷酸识别的关键步骤。除了考马斯染色试验, 数据中遗漏的分裂的百分比可以用来评估消化效率 (图 2)。质量控制软件可用来分析遗漏的分裂和其他指标, 以评估 MS 数据质量30。虽然胰蛋白酶是最常见的, 可供选择的蛋白酶5 , 以解决覆盖范围的差距, 在蛋白质组的最佳胰蛋白酶肽不能生成31。然后需要对 MS 分析软件的设置进行相应的修改, 以调整蛋白酶的变化。
该协议采用免疫沉淀 (为无菌富集) 以及二氧化钛 (2), 以丰富磷酸肽持。丰富的多肽的替代方法包括固定化金属亲和层析 (IMAC), 其他金属氧化物的金属氧化物亲和层析 (MOAC), 如氢氧化铝, 和聚合物为基础的金属离子亲和捕获 (PolyMAC)5,12。以往的研究表明, 不同的浓缩方法丰富的不同人群的磷酸肽持32。例如, IMAC 丰富了更多的多磷酸化肽, 而 MOAC 优选地丰富单磷酸化肽33。本议定书的代表性结果反映了这一看法 (图 4B)。最近的一份出版物表明, 结合 IMAC 和 MOAC 使用混合材料可能会提供更多的覆盖磷酸物种34。因此, 可以对该议定书进行修改, 以便同时利用其他浓缩方法, 以便进行更全面的 phosphoproteomic 分析。
MaxQuant26软件套件用于分析此协议中的 MS 数据, 但商业应用35也可用于磷酸识别和量化。对于磷酸识别, 应用定位概率截止。在 phosphoresidue 标识10、28中, 执行此筛选以选择磷酸肽持 (即大于 0.75) 的高可信度。换言之, 可能包含磷组的所有其他残留物的总概率小于0.25。这可以提高磷酸选择的严格性。在鉴定数量方面, 预期的多肽的数量在成百上千, 而预期的 pST 多肽的数量则在高数以千计。这些值反映了先前观察到的 phosphoproteome 分布, 其中约2%、12% 和86% 的 phosphosites 分别为.
如果并行执行了该方法和 pST 浓缩步骤, 则协议中的样本准备步骤可以在六天内完成。通过与 MS 的强大工具配对, 磷酸浓缩协议为科学家收集数据以分析其各自研究领域中的 phosphoproteome 提供了一种全球性的方法。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢德雷克实验室的成员提供的意见和输入的手稿。我们还感谢罗伯特伍德约翰逊医学院和新泽西州立大学罗格斯分校生物质谱设施的成员提供建议, 并在我们的样品上进行质谱分析。拉里 c. 程由国立卫生研究院国家医学科学院 (T32 GM008339 奖) 资助。托马斯 g. Graeber 得到了 P50 (前列腺癌 CA092131 孢子) 的支持。P01 CA168585) 和美国癌症协会研究学者奖 (RSG-12-257-01-TBE)。贾斯汀 m. 德雷克由国防部前列腺癌研究计划 W81XWH-15-1-0236、前列腺癌基金会青年调查员奖、新泽西州健康基金会和罗格斯大学的精准医学倡议试点奖支持。新泽西州癌症研究所。
Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
20G needle | BD | B305175 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |