Denne protokol beskriver en procedure for at udtrække og berige phosphopeptides fra prostata cancer cellelinjer og væv til en analyse af phosphoproteome via massespektrometri-baseret proteomics.
Fosfoproteomanalyse indebærer en storstilet undersøgelse af fosforyleres proteiner. Protein fosforylering er et kritisk skridt i mange signaltransduktionsveje og er stramt reguleret af kinaser og fosfataser. Derfor kan karakteriserer phosphoproteome give indsigt i at identificere nye mål og biomarkører for oncologic terapi. Massespektrometri giver en måde at globalt detektere og kvantificere tusindvis af unikke fosforylering begivenheder. Phosphopeptides er dog meget mindre rigelige end ikke-phosphopeptides, hvilket gør biokemiske analyser mere udfordrende. For at overvinde denne begrænsning, er metoder til at berige phosphopeptides før massespektrometri analyse påkrævet. Vi beskriver en metode til at udtrække og fordøje proteiner fra væv til at give peptider, efterfulgt af en berigelse for phosphotyrosine (pY) og phosphoserine/Threonin (pST) peptider ved hjælp af en antistof-baseret og/eller titandioxid (TiO2)-baseret berigelse metode. Efter forberedelse af prøver og massespektrometri, vi efterfølgende identificere og kvantificere phosphopeptides ved hjælp af liquid chromatography-massespektrometri og analyse software.
En anslået 165.000 nye tilfælde og omkring 29.000 dødsfald vil ske i 2018 på grund af prostatakræft, der repræsenterer den mest almindelige kræftform og næststørste årsag til kræftrelaterede dødsfald hos mænd i USA1. Tidlige stadier af prostatakræft kan behandles med resektion eller strålebehandling behandling af orgel-begrænset sygdom, hvor den tiårige tilbagefald sats er mellem 20 og 40% for patienter, der undergår prostatektomi og mellem 30% og 50% for patienter, der modtager stråling terapi2. Fordi prostatakræft bygger på androgen signalering for vækst, er kirurgisk og kemisk kastration terapier også ansat i højrisiko patienter. Imidlertid opstår tilbagefald når kræften ikke længere reagerer på androgen berøvelse terapi, som det fremgår af biokemisk recidiv, hvor prostata-specifikt antigen i serum stiger igen. På dette tidspunkt i progression, er metastaser ofte opdaget så godt. Denne avancerede fase, kaldes metastatisk kastration-resistente prostata cancer, repræsenterer den dødbringende form af sygdommen hvor prognosen er gangen median overlevelse på mindre end to år3. Få behandlingsmuligheder er tilgængelige i sene sygdom, herunder andengenerations antiandrogener såsom enzalutamide og abiraterone samt taxane-baseret kemoterapi som docetaxel. Trods tilgængelige behandlinger, sygdommen ofte skrider frem. Opdagelse og udvikling af nye behandlingsmodaliteter er derfor nødvendigt at forbedre pleje af prostata cancerpatienter med fremskreden sygdom.
Massespektrometri (MS)-baserede tilgange giver en global analyse af proteomet gennem påvisning af hundreder til tusinder af peptid analysander4. Især kan opdagelsen proteomics, også kendt som data-afhængige erhvervelse (DDA), give identifikation og kvantitering af tusindvis af peptider4,5. MS-baseret opdagelse proteomics kan yderligere afgrænset i top-down proteomics, hvor intakt proteiner er karakteriseret, og bottom-up (også kendt som shotgun) proteomics, hvor peptider er analyseret til at karakterisere proteiner5. Således i shotgun proteomics tager en proteolyse trin sted i prøveforberedelse forud for MS-analyse til at kløve proteiner i peptider. I slutningen, er en databasesøgning udført for at kortlægge peptider tilbage til proteiner til identifikation. Label-gratis såvel som flere isotop mærkning [fx, stabile isotop mærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC)] kan anvendes metoder sammenlignes kvantitativt peptider mellem prøver6,7. Mens isotop mærkning teknikker er guldstandarden, etiket-gratis metoder har påvist lignende kvantificering nøjagtigheder8,9 og har sammenlignelige kompromiser mellem følsomhed og specificitet10. Label-fri kvantitering giver større dækning og tillader sammenligninger mellem mange flere prøver, mens etiketbaserede metoder er begrænset af omkostnings- og multiplexing kapacitet6,7,8.
Derudover kan shotgun MS bruges også til at afhøre posttranslationelle modifikationer (PTMs) som fosforylering11. På grund af den lavere støkiometriske karakter af phosphopeptides i forhold til samlede peptider, er flere metoder ansat til at berige for phosphopeptides, herunder antistof-baseret immunoprecipitation af phosphotyrosine (pY) peptider, titandioxid (TiO2 ), og immobiliseret metal affinitet kromatografi (IMAC)5,12. Fordi protein fosforylering er et vigtigt skridt i mange celle signalering veje, shotgun fosfoproteomanalyse gør det muligt for forskere at undersøge celle signalering ændringer i forskellige kræftformer, herunder brystkræft13, prostata14, renal15, og æggestokkene,16,17 til bedre at forstå kræft biologi og at identificere potentielle nye mål for terapi.
Denne etiket-fri shotgun phosphoproteomic metode blev bygget og raffineret baseret på tidligere arbejde af Graeber gruppe18,19,20. Denne protokol begynder ved at beskrive udvinding og fordøjelse af proteiner og fosfoproteiner fra væv i peptider. Vi så detaljeret berigelse af pY peptider ved hjælp af specifikke phosphotyrosine antistoffer og TiO2. Vi beskriver også berigelse af phosphoserine/Threonin (pST) peptider ved hjælp af stærke kationbytter (SCX) efterfulgt af TiO2. Denne protokol konkluderer med indsendelse af prøver til et MS anlæg og brug af MS analyse software til at identificere og kvantificere phosphopeptides og deres tilsvarende fosfoproteiner. Anvendelsen af denne protokol kan overskride prostatakræft i andre kræftformer og felter uden for onkologi.
Før du bruger denne protokol til at berige for phosphopeptides, er en omhyggelig overvejelse af de eksperimentelle design kritisk. Ved hjælp af biologiske replikater er en mere omkostningseffektiv anvendelse af massespektrometri ressourcer end tekniske replikater. Antallet af gentagelser, der er nødvendige for vil delvis afhænge af variabiliteten i data. En nylig undersøgelse viste, at mens stigende antal flergangsbestemmelser ud over tre kun marginalt øger antallet af identifikationer, antallet af betydelige identifikationer mellem grupper stiger med mere replikater10.
På grund af den lavere overflod af fosfoproteiner i cellen er tilstrækkeligt protein udgangsbeløbene nødvendig for at opnå en global phosphoproteome fra prostatakræft prøver i registreringstilstand. I disse eksperimenter, blev 5 mg protein brugt. Cirka fem næsten sammenflydende 15-cm retter af celler giver nok protein som input til denne protokol, selv om dette vil være cell line-afhængige. Hvad angår tumor væv er det forventede udbytte af protein ca 6-8% af væv vægt. I indstillingen i vitro er en positive kontrolprøve overveje tilsætning af 1 mM vanadate i 30 min før høsten cellerne. Vanadate, en konkurrencedygtig protein phosphotyrosyl fosfatase inhibitor, vil bevare tyrosin fosforylering, hvilket øger antallet af pY peptid identifikationer29.
Ren fordøjelsen er et vigtigt skridt til at maksimere phosphopeptide identifikation. Ud over Coomassie pletten test, kan procent af ubesvarede splittelser i dataene, der bruges til at evaluere fordøjelsen effektivitet (figur 2). Kvalitetskontrol software er tilgængelig der analyserer ubesvarede splittelser og andre målinger til at vurdere MS data kvalitet30. Mens trypsin er de mest almindelige, alternative proteaser findes genereret5 til adresse dækning huller i proteomet hvor optimal tryptic peptider kan være31. Indstillingerne for MS analyse software ville derefter skal ændres i overensstemmelse hermed for at justere for ændringer i proteaser.
Protokollen beskæftiger immunoprecipitation (for pY berigelse) og titandioxid (TiO2) til at berige for phosphopeptides. Alternative tilgange til at berige for peptider omfatter immobiliseret metal affinitet kromatografi (IMAC), andre metaloxider til metaloxid affinitet kromatografi (MOAC) såsom aluminium hydroxid og polymer-baserede metal ion affinitet capture (PolyMAC) 5,12. Tidligere undersøgelser har vist, at forskellige berigelse metoder berige for forskellige populationer af phosphopeptides32. For eksempel, beriger IMAC mere multi-fosforyleret peptider mens MOAC helst beriger for mono-fosforyleret peptider33. Repræsentative resultater af denne protokol afspejler denne observation (figur 4B). En nylig publikation demonstreret at kombinere IMAC og MOAC ved hjælp af en hybrid materiale potentielt kunne give større dækning af phosphopeptide arter34. Således, denne protokol kan ændres for at udnytte andre berigelse metoder sideløbende at give mulighed for endnu mere omfattende phosphoproteomic analyser.
MaxQuant26 software suite bruges til at analysere MS data i denne protokol, men kommercielle applikationer35 er også tilgængelige for phosphopeptide identifikation og kvantificering. For phosphopeptide identifikation, er lokalisering sandsynligheden cutoff anvendt. Dette filter er udført for at markere for phosphopeptides med en høj tillid (dvs.større end 0,75) phosphoresidue identifikation10,28. Med andre ord er den summerede sandsynligheden for alle andre restprodukter, der potentielt kunne indeholde phospho-gruppen mindre end 0,25. Denne cutoff kunne hæves for at øge strengheden af phosphopeptide udvalget. Med hensyn til antallet af identifikationer er det forventede antal pY peptider i hundredvis, mens det forventede antal pST peptider er i de høje tusindvis. Disse værdier afspejler tidligere observerede phosphoproteome distribution hvor omkring 2%, 12% og 86% af phosphosites er pY, pT og pS, henholdsvis28.
Hvis de pY og pST berigelse skridt udføres sideløbende, kan prøve forberedelsestrin i protokollen være afsluttet i seks dage. Ved parring med den kraftfulde værktøj af MS, giver phosphopeptide berigelse protokoller som denne en global tilgang til forskere til at indsamle data til at analysere phosphoproteome i deres respektive forskningsfelter.
The authors have nothing to disclose.
Vi takke medlemmerne af Drake lab for at give gode råd og input på manuskriptet. Vi takker også medlemmerne af biologisk masse massespektrometri facilitet af Robert Wood Johnson medicinskole og Rutgers, The State University of New Jersey, for rådgivning og udførelse af massespektrometri på vores prøver. Larry C. Cheng understøttes af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under award nummer T32 GM008339. Thomas G. Graeber understøttes af NCI/NIH (SPORE i Prostata Cancer P50 CA092131; P01 CA168585) og en American Cancer Society forskning Scholar Award (RSG-12-257-01-TBE). Justin M. Drake er støttet af afdeling af forsvar Prostata Cancer Research Program W81XWH-15-1-0236, Prostata Cancer Foundation Young Investigator Award, New Jersey Health Foundation og en præcision medicin initiativ Pilot Award fra Rutgers Cancer Institute i New Jersey.
Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
20G needle | BD | B305175 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |