Summary
Denne protokol beskriver en procedure for at udtrække og berige phosphopeptides fra prostata cancer cellelinjer og væv til en analyse af phosphoproteome via massespektrometri-baseret proteomics.
Abstract
Fosfoproteomanalyse indebærer en storstilet undersøgelse af fosforyleres proteiner. Protein fosforylering er et kritisk skridt i mange signaltransduktionsveje og er stramt reguleret af kinaser og fosfataser. Derfor kan karakteriserer phosphoproteome give indsigt i at identificere nye mål og biomarkører for oncologic terapi. Massespektrometri giver en måde at globalt detektere og kvantificere tusindvis af unikke fosforylering begivenheder. Phosphopeptides er dog meget mindre rigelige end ikke-phosphopeptides, hvilket gør biokemiske analyser mere udfordrende. For at overvinde denne begrænsning, er metoder til at berige phosphopeptides før massespektrometri analyse påkrævet. Vi beskriver en metode til at udtrække og fordøje proteiner fra væv til at give peptider, efterfulgt af en berigelse for phosphotyrosine (pY) og phosphoserine/Threonin (pST) peptider ved hjælp af en antistof-baseret og/eller titandioxid (TiO2)-baseret berigelse metode. Efter forberedelse af prøver og massespektrometri, vi efterfølgende identificere og kvantificere phosphopeptides ved hjælp af liquid chromatography-massespektrometri og analyse software.
Introduction
En anslået 165.000 nye tilfælde og omkring 29.000 dødsfald vil ske i 2018 på grund af prostatakræft, der repræsenterer den mest almindelige kræftform og næststørste årsag til kræftrelaterede dødsfald hos mænd i USA1. Tidlige stadier af prostatakræft kan behandles med resektion eller strålebehandling behandling af orgel-begrænset sygdom, hvor den tiårige tilbagefald sats er mellem 20 og 40% for patienter, der undergår prostatektomi og mellem 30% og 50% for patienter, der modtager stråling terapi2. Fordi prostatakræft bygger på androgen signalering for vækst, er kirurgisk og kemisk kastration terapier også ansat i højrisiko patienter. Imidlertid opstår tilbagefald når kræften ikke længere reagerer på androgen berøvelse terapi, som det fremgår af biokemisk recidiv, hvor prostata-specifikt antigen i serum stiger igen. På dette tidspunkt i progression, er metastaser ofte opdaget så godt. Denne avancerede fase, kaldes metastatisk kastration-resistente prostata cancer, repræsenterer den dødbringende form af sygdommen hvor prognosen er gangen median overlevelse på mindre end to år3. Få behandlingsmuligheder er tilgængelige i sene sygdom, herunder andengenerations antiandrogener såsom enzalutamide og abiraterone samt taxane-baseret kemoterapi som docetaxel. Trods tilgængelige behandlinger, sygdommen ofte skrider frem. Opdagelse og udvikling af nye behandlingsmodaliteter er derfor nødvendigt at forbedre pleje af prostata cancerpatienter med fremskreden sygdom.
Massespektrometri (MS)-baserede tilgange giver en global analyse af proteomet gennem påvisning af hundreder til tusinder af peptid analysander4. Især kan opdagelsen proteomics, også kendt som data-afhængige erhvervelse (DDA), give identifikation og kvantitering af tusindvis af peptider4,5. MS-baseret opdagelse proteomics kan yderligere afgrænset i top-down proteomics, hvor intakt proteiner er karakteriseret, og bottom-up (også kendt som shotgun) proteomics, hvor peptider er analyseret til at karakterisere proteiner5. Således i shotgun proteomics tager en proteolyse trin sted i prøveforberedelse forud for MS-analyse til at kløve proteiner i peptider. I slutningen, er en databasesøgning udført for at kortlægge peptider tilbage til proteiner til identifikation. Label-gratis såvel som flere isotop mærkning [fx, stabile isotop mærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC)] kan anvendes metoder sammenlignes kvantitativt peptider mellem prøver6,7. Mens isotop mærkning teknikker er guldstandarden, etiket-gratis metoder har påvist lignende kvantificering nøjagtigheder8,9 og har sammenlignelige kompromiser mellem følsomhed og specificitet10. Label-fri kvantitering giver større dækning og tillader sammenligninger mellem mange flere prøver, mens etiketbaserede metoder er begrænset af omkostnings- og multiplexing kapacitet6,7,8.
Derudover kan shotgun MS bruges også til at afhøre posttranslationelle modifikationer (PTMs) som fosforylering11. På grund af den lavere støkiometriske karakter af phosphopeptides i forhold til samlede peptider, er flere metoder ansat til at berige for phosphopeptides, herunder antistof-baseret immunoprecipitation af phosphotyrosine (pY) peptider, titandioxid (TiO2 ), og immobiliseret metal affinitet kromatografi (IMAC)5,12. Fordi protein fosforylering er et vigtigt skridt i mange celle signalering veje, shotgun fosfoproteomanalyse gør det muligt for forskere at undersøge celle signalering ændringer i forskellige kræftformer, herunder brystkræft13, prostata14, renal15, og æggestokkene,16,17 til bedre at forstå kræft biologi og at identificere potentielle nye mål for terapi.
Denne etiket-fri shotgun phosphoproteomic metode blev bygget og raffineret baseret på tidligere arbejde af Graeber gruppe18,19,20. Denne protokol begynder ved at beskrive udvinding og fordøjelse af proteiner og fosfoproteiner fra væv i peptider. Vi så detaljeret berigelse af pY peptider ved hjælp af specifikke phosphotyrosine antistoffer og TiO2. Vi beskriver også berigelse af phosphoserine/Threonin (pST) peptider ved hjælp af stærke kationbytter (SCX) efterfulgt af TiO2. Denne protokol konkluderer med indsendelse af prøver til et MS anlæg og brug af MS analyse software til at identificere og kvantificere phosphopeptides og deres tilsvarende fosfoproteiner. Anvendelsen af denne protokol kan overskride prostatakræft i andre kræftformer og felter uden for onkologi.
Protocol
Eksperimenter ved hjælp af xenograft tumorer blev godkendt ved Rutgers University institutionelle Animal Care og brug udvalget som angivet frem under retningslinjerne for National Institutes of Health.
1. protein udvinding
- Forberede lysisbuffer (tabel 1). (Mængden afhænger antallet af prøver, der skal høstes.) Til i vitro celle prøver, gå videre til trin 1,2. For tumor væv, Fortsæt til trin 1.3.
-
Høst celler
- Indsamle cellerne i en 50 mL konisk slange og spin dem på 700 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten og holde pellet på is. Gentag dette trin for alle retter til at indsamle cellerne i en pellet. (Typisk omkring 5 næsten sammenflydende 15-cm retter af celler er nødvendige for 5 mg af protein, men dette kan være afhængige af cellelinie og skal bestemmes empirisk ved hver investigator.)
- Vask pellet med 30 mL af kølet fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og spin på 700 x g i 5 min. ved 4 ° C før sugning PBS. Der tilsættes 1,5 mL lysisbuffer pr. 5 mg protein bruges til celle pellet. Med pipette overfoeres op og ned et par gange. Spring til trin 1.4.
-
Høst væv
- Tumor og der tilsættes 2 mL iskold lysisbuffer for hver 100 mg af væv i en kultur reagensglas. (Typisk 50-150 mg af væv våd vægt er påkrævet.)
- Homogeniseres den lysate bruger en håndholdt eller benchtop homogeniseringsapparat (puls 2 x 15 s.) Rens homogeniseringsapparat inden den første prøve og mellem prøver ved hjælp af 10% blegemiddel, 70% ethanol og deioniseret vand efter hinanden.
- At reducere og alkylatbenzin, opvarme de homogeniserede prøver ved 95 ° C i 5 min. Derefter køle dem på is i 15 min. På isen, der sonikeres lysate 3 x (dvs., puls for 30 s med 60 s pauser mellem bælgfrugter). Prøven bør ikke være tyktflydende eller clumpy på dette punkt. Varme lysate ved 95 ° C i 5 min21.
- Den lysate i den samme sonikering rør ved hjælp af en swing spand rotor på 3.500 x g ved 15 ° C i 15 min. der centrifugeres indsamle supernatanten og kassér pellet.
- Bestemme proteinkoncentration ved at udføre en Bradford assay22. Om nødvendigt, fortyndes den lysate til 5 mg/mL med et lysisbuffer. Opbevar den ved-20 ° C.
Bemærk: Eksperimentet kan pause her. Fryse prøver på-80 ° C og fortsætte på et senere tidspunkt.
2. lysate fordøjelse
- Fortyndes prøven 12-fold ved hjælp af 100 mM Tris (pH = 8,5) til at reducere mængden af guanidinium. Fortynd alle prøver til den samme lydstyrke til at minimere virkningerne af ulige fordøjelsen. Gemme 12,5 µg af det nedbrudte lysate at bekræfte det på en Coomassie farvede gel23.
- 5 mg protein, tilføje 10 µg for Lysyl Endopeptidase (Lys-C) og der inkuberes ved stuetemperatur for 5-6 h. Juster pH til 8,0 af untitrated tilføjer 1 M Tris (pH ~ 11).
- Forberede 1 mg/mL L-1-tosylamido-2-phenylethyl chlormethyl keton (TPCK)-behandlet trypsin i 1 mM HCl (med 20 mM CaCl2). Tilføj trypsin i forholdet 1: 100 trypsin: protein og der inkuberes ved 37 ° C til 3 h.
- Tilføje den samme mængde frisk trypsin som i trin 2.3. Inkuber det ved 37 ° C natten over.
- Gemme 12,5 µg af det nedbrudte lysate at bekræfte den komplette fordøjelsen på en Coomassie farvede gel23.
3. omvendt fase udvinding
- Optage den lysate mængde. Filtrere prøven ved hjælp af en 15 mL 10 kDa cutoff filter. Centrifugeres prøve på 3.500 x g bruger swing spand rotoren (eller 3.500 x g i en fast vinkel rotor) ved 15 ° C, indtil retentatet volumen er mindre end 250 µL (dette tager ca. 45-60 min.). Indsamle gennemstrømnings- og kassér retentatet.
Bemærk: Eksperimentet kan pause her. Fryse prøver på-80 ° C og fortsætte på et senere tidspunkt. - For at forsure prøven, tilføje ca 20 µL af 5% trifluoreddikesyre (TFA) pr. mL af lysate. Bland dem godt og måle prøve pH ved hjælp af pH strips. Justere pH til 2.5 bruger 5% TFA.
- Tilslut den kortere ende af en C-18 kolonne til et vakuum manifold. Indstil vakuum mellem 17 og 34 kPa (eller efter producentens anvisninger). Ved hjælp af glas pipetter, våd kolonnen med 3 mL 100% acetonitril (ACN). Lad ikke kolonnen tørre.
- Bruge glas pipetter, Blandingen henstår kolonnen med 6 mL af 0,1% TFA anvendes som 2 x 3 mL. Indlæse syrnet prøven i kolonnen. Læg ikke mere end 3 mL ad gangen. Justere vakuum for at målrette ca 1 til 2 dråber pr. sekund.
- Ved hjælp af glas vaske pipetter, kolonnen med 9 mL af 0,1% TFA anvendt som 3 x 3 mL. Elueres kolonnen med 2 mL 40% ACN, 0,1% TFA. Indsamle to 2 mL fraktioner i glasrør kultur . Kassér kolonnen.
- Dække eluatet rør med parafilm og punch 3-5 huller på forsiden ved hjælp af en 20G nål. Fryse eluatet på tøris i mindst 30 min., indtil det er helt fast.
- Lyophilize fraktioner natten over. Kontroller, at prøverne er helt tør før du stopper lyophilizer i den følgende dag. Gemme rør i en 50 mL konisk slange med delikat klude ved-80 ° C.
Bemærk: Eksperimentet kan pause her.
4. Immunoprecipitation og berigelse af pY peptider24
- Resuspend den frysetørrede pulver med 0,5 mL iskold immunoprecipitation (IP) binding buffer i hver fraktion. Pool fraktioner ved at overføre 0,5 mL resuspension volumen fra den anden fraktion til den første brøkdel og gemme pipette tip. Energisk vortex (i stedet for pipettering op og ned) for at sikre prøven er fuldstændig opløst før du overfører det til en 3,6 mL skruelåg cryotube.
- Som i trin 4.1., skyl ingot rør med en anden 0,5 mL af IP binding buffer (tabel 1) i hver tube. Opløsningen overføres til 3,6 mL skruelåg røret ved hjælp af den samme pipette tip til at minimere tab af prøven. Gentag skyl 1 x mere, hvilket gør den endelige resuspension bind 2 mL (for 5 mg protein). Måle prøve pH for at sikre det er cirka 7,4. Hvis det er for surt, iterativt tilføje 10 µL 1 M Tris (untitrated, pH ~ 11). Hvis det er også grundlæggende, iterativt tilføje 10 µL fortyndet HCl (1:25 eller 1: 100).
-
Forvask pY perler (for 5 mg for at starte lysate)
- 25 µg 4 g 10 antistof og 12,5 µg 27B10.4 antistof er nødvendig pr. prøve. Efter at have brugt en p200 afpipetteres med en cut tip til at overføre antistofferne til separat microcentrifuge rør, vaske antistoffer med 450 µL af iskold IP binding buffer 2 x. Der centrifugeres dem ved 100 x g i 1 min. ved 4 ° C og aspirat ud supernatanten.
- Resuspend perler til en bestand koncentration på 0,5 mg/mL ved hjælp af IP binding buffer. (Gør ikke vortex perlerne.) Efter aliquoting den nødvendige gylle (50 µL af 4 g 10 antistof gylle og 25 µL 27B10.4 antistof gylle pr. sample) ind i et enkelt rør, spin ned bestand centrifugeglas på 200 x g i 1 min. ved 4 ° C. Vask sidevægge med supernatanten før returnere perlerne til opbevaring i køleskab.
- Tilføje pre vasket pY perler til den resuspenderede prøveopløsningen i skruelåg cryotubes. Inkuber dem ved 4 ° C på en ende over ende rotator natten over.
- Placer skruelåg cryotubes i et 50 mL centrifugeglas foret med en delikat tørre. Spin ned perler på 100 x g i 1 min. Gem supernatanten, som vil blive brugt til at berige for pST peptider. (Berigelse for pST begynder på trin 7 og kan udføres parallelt med pY peptid behandling).
- Resuspend perler med 300 µL af IP binding buffer. Overføre dem til en 2 mL microcentrifuge tube og dreje dem ned på 100 x g i 1 min. ved 4 ° C.
- Skyl inkubation tube 3 x med 200 µL af IP binding buffer. Overføre indholdet til den samme Microcentrifuge tube hver gang. Derefter dreje dem ned.
- Vask perler i microcentrifuge rør 3 x med 500 µL af IP binding buffer og dreje dem ned på 100 x g i 1 minut. Derefter vaske perlerne 4 x med 450 µL af 25 mM NH4HCO3, pH 7,5 og spin dem ned på 100 x g 1 min. Brug en frisk 25 mM NH4HCO3 løsning fra pulver hver gang.
- Der centrifugeres perler på 1.500 x g i 1 min. Brug en gel-loading tip til at fjerne supernatanten helt ved at dyppe spidsen af gel-loading spidsen lidt under perler overflade.
- Tilføj 4 x perle volumen 0,1% TFA til perlerne (dvs., tilsæt 300 µL af 0,1% TFA for 75 µg af pY perle gylle). Bland dem godt og Inkuber blandingen i en thermomixer ved 1000 rpm i 15 min. ved 37 ° C.
- Overføre ophvirvling til en 0,2 µm spin filteret. Hurtigt spin ned eluering røret og overføre residualvolumen til samme spin filteret ved hjælp af en P10 pipette. Spin ned spin filteret på 850 x g i 1 min. Overfør eluering til et lavt protein-bindende microcentrifuge rør. Vakuum koncentrere eluatet til tørhed natten over ved 40 ° C og med en varme tid af 300 min.
Bemærk: Eksperimentet kan pause her. Fryse prøver på-80 ° C og fortsætte på et senere tidspunkt.
5. titandioxid berigelse25 af pY peptider
- Resuspend den tørrede ned phosphopeptides i 200 µL af 50% ACN, 0,1% TFA. Vortex og centrifugeres dem på 10.000 x g i 30 s. Gentag denne 1 x for at resuspend dem godt.
- Forberede TiO2 perler i tips, der har en kapacitet på 200 µL prøver.
- Forsigtigt Tryk på den lille tip-side af tip til at flytte materiale herpå. Skyl spidsen ved at tilføje 200 µL af 100% ACN, efterfulgt af invertere spidsen og klippede den lille ende til at flytte væske mod fælles landbrugspolitik.
- Ved hjælp af et barberblad skæres i små spidsen af toppen og Placer det over en lav protein-bindende tube. (Undgå at bruge polystyren rør som TiO2 vil klæbe til siderne af røret.) Fjern hætten og Indsæt en mikropipette for at styrte ud den resterende ACN. Gentag vask med 200 µL af 100% ACN. TiO2 perler er nu placeret i lavt protein-bindende røret til følgende trin.
- Forudsætning TiO2 med 500 µL af 100% ACN 2 x. Med pipette overfoeres det at blande perler med opløsningsmiddel. Der centrifugeres dem ved 100 x g i 1 min.
- Betingelse TiO2 med 500 µL af 0,2 M natrium fosfat buffer (pH ~ 7) 2 x. Vask perler med 300 µL af ækvilibrering buffer 3 x. Fordi TiO2 er meget tætte, udligner perlerne hurtigt.
- Tilføj 400 µL af 50% ACN, 0,1% TFA ind i lavt protein-bindende rør, efterfulgt af tilføje 84 µL af mælkesyre. Overføre den resuspenderede phosphopeptides ind i lavt protein-bindende rør og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur ved hjælp af en ende over ende rotator.
- Der centrifugeres perler på 100 x g i 1 min. at pille dem. Vaske dem med 300 µL af ækvilibrering buffer (tabel 1) 2 x og dreje dem ned på 100 x g i 1 minut.
- Skyl perler med 300 µL skylning buffer 2 x. Overføre dem til en 0,2 µm spin filteret. Spin dem ved 1.500 x g i 1 min.
- Overføre filterenhed til en ren 1,5 mL lavt protein-bindende tube. Elueres indhold 2 x med 200 µL af 0,9% NH3 i H2O. foranstaltning pH med pH-strips, som bør være mellem 10 og 11. Vakuum koncentrere eluatet til tørhed natten til at fordampe ammoniak.
6. afsaltning pY peptider til MS Analyses
- Rekonstruere phosphopeptides med 15 µL af 0,1% TFA vortexing og centrifugering dem på 10.000 x g for 30 s til resuspend dem. Gentag denne 1 x for at resuspend dem godt. Ikke pipetteres op og ned.
- Ren prøven ved hjælp af en C-18 spids med en bindende kapacitet på 5 µg og følg producentens protokol.
- Helt tørre eluering volumen af vakuum koncentration. Det tager 1-2 h. Resuspend den tørrede phosphopeptides i 12,5 µL af massespektrometri løsning (Se tabel 1) (eller som anbefalet af forskerens MS proteomics core facilitet). Vortex og kortvarigt spin løsningen ned på 10.000 x g for 30 s. Gentag dette 2 x til resuspend dem godt. Prøverne er klar til forelæggelse for et massespektrometri facilitet (trin 11).
Bemærk: Følgende trin nedenfor er relateret til pST peptid berigelse kun.
7. omvendt fase udvinding af pST peptider
- Måle peptid koncentrationen af supernatanten erhvervet fra trin 4.6 ved at udføre en peptid assay. En tilstrækkelig mængde for pST massespektrometri er 2,5 mg.
- Justere pH til 3,5 med 5% TFA.
- Tilslut den kortere ende af en C-18 kolonne til et vakuum manifold. Indstil vakuum mellem 17 og 34 kPa (eller efter producentens anvisninger). Våd kolonnen med 3 mL 100% ACN. Lad ikke kolonnen tørre.
- Blandingen henstår kolonnen med 6 mL af 0,1% TFA anvendes som 2 x 3 mL. Indlæse syrnet prøven i kolonnen. Læg ikke mere end 3 mL ad gangen. Justere vakuum for at målrette omkring 1-2 dråber pr. sekund.
- Kolonnen udvaskes med 9 mL af 0,1% TFA anvendt som 3 x 3 mL. Elueres kolonnen med 2 mL 40% ACN, 0,1% TFA. Indsamle to 2 mL fraktioner i glasrør kultur. Kassér kolonnen.
- Dække eluatet rør med parafilm og punch 3-5 huller på forsiden ved hjælp af en 20G nål. Fryse eluatet på tøris i mindst 30 min., indtil det er helt fast.
- Lyophilize de udvalgte fraktioner natten over. Kontroller, at prøverne er helt tør før du stopper lyophilizer i den følgende dag. Gemme rør i en 50 mL konisk slange med delikat klude ved-80 ° C.
Bemærk: Eksperimentet kan pause her.
8. stærk kationbytter (SCX) af pST peptider
- Resuspend de frysetørrede peptider i 2 mL Buffer A (tabel 1). Pool brøker for hver prøve. (Løsningen vil være overskyet).
- Forberede den vakuum manifold. Tilslut et SCX-kolonne til en 3 mL sprøjte med stemplet fjernet. Indstil vakuum mellem 17 og 34 kPa (eller efter producentens anvisninger).
- Betingelse for kolonnen SCX med 4 mL af ACN, efterfulgt af 4 mL Buffer A.
- Læg 2 mL af prøven fra trin 8,1 og Eluatet opsamles straks. Indlæse 3 mL af A:B (80.9:19.1) buffer og Eluatet opsamles. Pool eluater af hver prøve og alikvot dem til 2 mL lavt protein-bindende rør.
- Vakuum koncentrere alle prøver indtil ca 30% af mængden tilbage. (Dette trin tager ca 2-4 h.) Samle delprøver i 1 lav protein-bindende rør til hver prøve.
- Tilslut den kortere ende af en C-18 kolonne til et vakuum manifold. Indstil vakuum mellem 17 og 34 kPa (eller efter producentens anvisninger). Våd kolonnen med 3 mL 100% ACN 2 x. Lave ikke lade kolonnen tør.
- Blandingen henstår kolonnen med 3 mL af 0,1% TFA 2 x. Læg prøven i kolonnen. Læg ikke mere end 3 mL ad gangen. Justere vakuum for at målrette omkring 1-2 dråber pr. sekund.
- Kolonnen udvaskes med 3 mL af 0,1% TFA 2 x. Elueres kolonnen med 4 mL 50% ACN, 0,1% TFA.
9. titandioxid berigelse af pST peptider
-
Forberede TiO2 perler i tips, der har en kapacitet på 200 µL prøver
- Forsigtigt Tryk på den lille tip side af tip til at flytte perlerne herpå. Fjern hætten og hæld perlerne i en polypropylen 15 mL konisk slange.
- Skyl spidsen ved at tilføje 200 µL af 100% ACN, invertere spidsen et par gange og klippede den lille ende til at flytte væske mod fælles landbrugspolitik. Ved hjælp af et barberblad skæres i små spidsen af toppen og Placer det over polypropylen 15 mL konisk tube. Fjern hætten og Indsæt en mikropipette for at styrte ud den resterende ACN. Gentag vask med 200 µL af 100% ACN. TiO2 perler er nu placeret i 15 mL konisk slange i følgende trin.
- Forudsætning TiO2 med 500 µL af 100% ACN 2 x. Med pipette overfoeres det at blande perler med opløsningsmiddel. Der centrifugeres dem ved 100 x g i 1 min.
- Betingelse TiO2 med 500 µL af 0,2 M natrium fosfat buffer (pH ~ 7) to gange. Vask perler med 300 µL af ækvilibrering buffer 3 x.
- Overføre den eluted phosphopeptides ind i polypropylen 15 mL konisk rør. Tilføje 560 µL af mælkesyre og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur ved hjælp af en ende over ende rotator.
- Der centrifugeres blandingen ved 100 x g i 1 min til pellet perlerne. Vaske dem med 300 µL af ækvilibrering buffer (tabel 1) 3 x. Spin dem ned på 100 x g i 1 minut.
- Skyl perler med 300 µL skylning buffer 2 x. Overføre dem til en 0,2 µm spin filteret. Spin dem ned på 1.500 x g i 1 minut.
- Overføre filterenhed til en ren 1,5 mL lavt protein-bindende tube. Elueres indhold 2 x med 200 µL af 0,9% NH3 i H2O. Lad løsningen, der sidder på phosphopeptides for 2 min før eluerer dem. Måle pH-værdien, der skal være mellem 10 og 11.
- Vakuum koncentrere eluatet til tørhed natten til at fordampe ammoniak.
10. afsaltning pST peptider for MS analyser
- Forsigtigt Tryk på den lille tip-side af tip til at flytte materiale herpå. Skyl spidsen ved at tilføje 200 µL af 100% ACN, efterfulgt af invertere spidsen og klippede den lille ende til at flytte væske mod fælles landbrugspolitik.
- Ved hjælp af et barberblad skæres i små spidsen af toppen og Placer det over en polypropylen 15 mL konisk tube. Fjern hætten og Indsæt en mikropipette for at styrte ud den resterende ACN. Gentag vask med 200 µL af 100% ACN. TiO2 perler er nu placeret i polypropylen 15 mL konisk slange i følgende trin.
- Ren prøven ved hjælp af en C-18 spids med en bindende kapacitet på 100 µg. (Følg fabrikantens instruktioner.)
- Helt tørre eluering volumen af vakuum koncentration. Det tager 1-2 h.
- Resuspend den tørrede phosphopeptides i 12,5 µL af massespektrometri løsning (eller som anbefalet af forskerens MS proteomics core facilitet). Vortex og centrifugeres dem på 10.000 x g for 30 s. Gentag 2 x til resuspend dem godt. (Ikke pipetteres op og ned.)
11. massespektrometri analyse
- Indsende prøver til MS proteomics core facilitet til at udføre liquid chromatography-tandem MS (LC-MS/MS) ved hjælp af de anbefalede indstillinger. Eksempelindstillinger er som følger (Se tabel 2 for Resumé):
- Indlæse 5 µL af prøver på en fælde kolonne (2 cm lang x 75 µm diameter) og vaske dem med 0,1% TFA i 5 min. med en gennemstrømningshastighed på 5 µL/min.
- Bringe fælde i overensstemmelse med en nano analytiske kolonne (20 cm x 75 µm) med en gennemstrømningshastighed på 300 nL/min.
- De segmenterede lineære farveforløb (en procentdel af 0,16% myresyre, 80% ACN i 0,2% myresyre) er forskellige mellem pY og pST prøver:
- PY prøverne, elueres dem ved hjælp af en graduering af 4-15% i 5 min, 15-50% i 40 min og 50-90% på 5 min.
- For pST prøver, elueres dem ved hjælp af en graduering af 4-15% i 30 min, 15-25% i 40 min, 25-50% på 44 min og 50-90% i 11 min.
- Erhverve MS data i data-afhængige erhvervelse mode med en cyklisk serie af en fuld scanning med en opløsning på 120.000 efterfulgt af MS/MS (HCD, relative kollisionen energi på 27%) af de 20 mest intense ioner og en dynamisk udstødelse varighed af 20 s.
- Efter MS køre afslutningen, skal du importere MS raw-filer til en MS analyse softwareprogram til at identificere og kvantificere phosphopeptides. (MaxQuant software8,26,27 blev brugt i dette eksperiment. Medmindre angivet i tabel 3, blev standardindstillingerne brugt.)
Representative Results
Denne protokol beskriver i detaljer en metode for protein udvinding og fordøjelsen efterfulgt af phosphopeptide berigelse og efterfølgende MS analyse (figur 1). Sammensætningen af alle de buffere og løsninger, der anvendes i denne protokol er angivet i tabel 1. Den sekventielle brug af Lys-C og trypsin giver en effektiv fordøjelse. En Coomassie farvede gel af præ-fordøjet lysate bekræfter tilstedeværelsen af proteiner, mens farvning af post fordøjet lysate bekræfter den komplette fordøjelsen (figur 2A). For en komplet fordøjelsen, skal ingen bånd vises over 15 kDa, undtagen den 30 kDa og 23,3 kDa bands for Lys-C og trypsin, henholdsvis. Tilføjelse af Lys-C også reducerer antallet af ubesvarede splittelser (figur 2B). Fordi pY peptider udgør kun 2% af phosphoproteome28, er immunoprecipitation af pY peptider ved hjælp af en pY-specifikke antistof det første trin i pY peptid berigelse. Den resulterende supernatanten bliver input for pST peptid berigelse. PY immunoprecipitation adskiller effektivt pY peptider fra pST peptider hvor gennemsnitligt 85% af phosphopeptides identificeres fra pY forberedelse er pY (figur 3A) og over 99% af phosphopeptides identificeres fra pST forberedelse er pST (figur 3B). Titandioxid er brugt til at berige for phosphopeptides i begge præparater. Den forventede procent af peptider i MS-klar forberedelse, det er fosforyleret er mellem 30-50% (figur 4A). Variation i phosphopeptide berigelse procentdel kan være større i pY forberedelse som følge af at mange færre pY peptider end pST peptider. Med hensyn til phosphopeptide art har størstedelen af phosphopeptides opdaget en enkelt eller dobbelt phosphoryl gruppe (figur 4B).
Efter udførelse af massespektrometri, er MS raw-filer indlæst i en MS analyse software. De parameterindstillinger, der anvendes i forsøget er angivet i tabel 3 , men vil variere fra software til software og kan variere fra version til version. De parametre, der ikke er angivet blev efterladt som standard, herunder en FDR cutoff på 1% for peptid-spektrum matchende (PSM) med et minimum Andromeda score på 40 til identifikation af modificerede peptider27. Indstille en lokalisering sandsynlighed cutoff større end 0,75 bortfiltrerer ca 5% af pY peptider og 15% og 34% af pS og pT peptider, henholdsvis (figur 5A). Efter anvender disse filtre, er det forventede antal phosphopeptide identifikationer for enden af MS analyse ca 300 pY peptider (for 5 mg af den begyndende protein) og omkring 7.500 pS peptider og 640 pT peptider (til 2,5 mg af den begyndende peptid beløb) fra de respektive berigelse præparater (figur 5B). Antallet af gentagelser og variabilitet i phosphopeptide signal intensitet bestemmer passende kraftoverførsel til statistiske sammenligninger. I fire separate eksperimenter med grupper, der indeholder enten biologiske dubletter eller tre blev procent koefficienterne variationskoefficienten (% CV) for detekterede phosphopeptides beregnet. Distributioner lavere variation (fx, pST grupper 1-5 i figur 5 c) viser, at prøven indsamling, udarbejdelse og massespektrometri løber var konsekvent. På den anden side distributioner højere variation (fx, pST gruppe 6 i figur 5 c) angiver mere støjende data, som ville kræve større fold-ændringer at påvise betydelige forskelle i downstream differential analyser.
Figur 1: arbejdsprocesdiagram. Proteiner fra prøver er udvundet og fordøjet. Peptider er udvundet af faste fase ekstraktion (SPE) og phosphotyrosine (pY) peptider er immunoprecipitated. Samtidig er phosphoserine/Threonin (pST) peptider beriget fra supernatanten i pY immunoprecipitation trin. Stærk kationbytter (SCX) udføres på supernatanten at fjerne meget ladet peptider for at reducere ion undertrykkelse12. Begge præparater gennemgå phosphopeptide berigelse via titandioxid (TiO2). Efter prøve oprydning, er liquid chromatography-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) udført for at måle phosphopeptide overfloden. De rå data er derefter indlæses i en MS analyse software til at identificere phosphopeptides. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vurdering af fordøjelsen. (A) tre prøver med 12,5 µg for lysate før fordøjelse, Lys-C fordøjelse, og efter trypsin fordøjelsen er vist. En Coomassie gel-pletten test viser en ren fordøjelsen efter sekventielle brug af Lys-C og trypsin. Molekylær vægt (MW) størrelse markører er i kilodaltons (kDa). (B) A reduktion i ubesvarede splittelser er observeret efter Lys-C blev tilføjet til protokollen. Procentdelen af phosphopeptides uden ubesvarede splittelser steg fra 48% til 64% og 60% til 84% i gennemsnit for pY og pST berigelse præparater, henholdsvis. Graferne opsummere oplysninger indhentet fra to eksperimenter udført uden Lys-C og fem forsøg udført med Lys-C. Fejllinjer er standardafvigelser repræsenterer 38 pY og 38 pST prøver fra 2 separate eksperimenter (uden Lys-C) og 62 pY og 60 pST prøver fra 5 separate eksperimenter (med Lys-C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: berigelse af pY og pST phosphopeptides. Disse paneler viser procentdelen af pSTY phosphopeptides fra enten (A) pY eller (B) pST berigelse præparater. PY berigelse af pY immunoprecipitation og titandioxid resulterede i 85% phosphopeptides bliver for pY peptider, mens kun 0,1% af phosphopeptides i pST berigelse er pY. Disse værdier blev trukket fra undersøge Phospho (STY)Sites.txt fil af en repræsentativ eksperiment efter frafiltrere forureninger, reverse sekvenser og phosphopeptides med lokalisering sandsynligheder mindre end 0,75. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Phosphopeptide berigelse med titandioxid. (A) procentdelen af registrerede phosphopeptides (i forhold til samlede peptider) fra prøver i fire særskilte forsøg er vist. (B) dette panel viser den gennemsnitlige sammensætning af mono-, dobbelt- og multi-fosforyleret peptider i fire separate eksperimenter. Fejllinjer i panelet A er standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: forventet phosphoresidue identifikationer. (A) dette panel viser fosforylering lokalisering sandsynlighederne for id'er fra pY berigelse (venstre) og pST berigelse (til højre). Den gennemsnitlige procentdel af id'er, der opfylder > 0,75 sandsynlighed cutoff er 93%, 75% og 52% for pY, pS og pT, henholdsvis. (B) gennemsnitlige antal id'er med en > 0,75 lokalisering sandsynlighed er 300 for pY, 7.500 for pS og 640 for pT. (C) dette panel viser violin parceller af den procent variationskoefficient (% CV) af phosphopeptides. En evaluering af % CV var kun udføres hvis en signal intensitet værdi blev fundet i hver biologiske replikat eller tredobbelt gruppe. Data blev taget fra fire separate eksperimenter. Fejllinjer i paneler A og B er standardafvigelser fra 34 pY og 34 pST prøver fra 4 separate eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer | Volumen | Sammensætning | |
| 6 M guanidinium chlorid lysisbuffer | 50 mL | 6 M guanidinium chlorid, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine, 40 mM chloracetamid, 2 mM natrium orthovanadate, 2,5 mM natrium pyrofosfat, 1 mM β-glycerophosphate, 500 mg n-octyl-glycosid, ultra-rene vand til volumen | |
| 100 mM natrium pyrofosfat | 50 mL | 2,23 g natrium pyrofosfat decahydrate, ultra rent vand til volumen | |
| 1M β-glycerophosphate | 50 mL | 15.31 g β-glycerophosphate, ultra rent vand til volumen | |
| 5% trifluoreddikesyre | 20 mL | Tilsættes 1 mL 100% trifluoreddikesyre i 19 mL ultra rent vand | |
| 0,1% trifluoreddikesyre | 250 mL | Tilsættes 5 mL 5% trifluoreddikesyre til 245 mL ultra-rene vand | |
| pY eluering buffer | 250 mL | 0,1% trifluoroacetic syre, 40% acetonitril, ultra rent vand til volumen | |
| pST eluering buffer | 250 mL | 0,1% trifluoroacetic syre, 50% acetonitril, ultra rent vand til volumen | |
| IP binding buffer | 200 mL | 50 mM tris pH 7,4, 50 mM natriumchlorid, ultra rent vand til volumen | |
| 25 mM ammoniumbicarbonat, pH 7,5 | 10 mL | 19,7 mg opløses i 10 mL sterilt ultra-rene vand, pH 7,5 med 1 N saltsyre (~ 10-15 µL/10 ml opløsning), gøre friske | |
| 1M fosfat-buffer pH 7 | 1.000 mL | 423 mL 1 M natriumfosfat dihydrogen, 577 mL 1 M natriumfosfat brint | |
| Ækvilibrering buffer | 14 mL | 6.3 mL acetonitril, 280 µL 5% trifluoreddikesyre, 1740 µL mælkesyre, 5.68 mL ultra rent vand | |
| Skylning buffer | 20 mL | 9 mL acetonitril, 400 µL 5% trifluoreddikesyre, 10,6 mL ultra rent vand | |
| Massespektrometri løsning | 10 mL | 500 µL acetonitril, 200 µL 5% trifluoreddikesyre, 9,3 mL ultra rent vand | |
| Buffer A | 250 mL | 5 mM monokaliumphosphat fosfat (pH 2,65), 30% acetonitril, 5 mM kaliumchlorid, ultra-rent vand til volumen | |
| Buffer B | 250 mL | 5 mM monokaliumphosphat fosfat (pH 2,65), 30% acetonitril, 350 mM kaliumchlorid, ultra rent vand til volumen | |
| 0,9% ammoniumhydroxid | 10 mL | 300 μL 29.42% ammoniumhydroxid, 9,7 mL ultra rent vand | |
Tabel 1: buffere og løsninger. Denne tabel viser sammensætningen af buffere og løsninger, der anvendes i denne protokol.
| LC-MS/MS indstillinger | ||
| Parameter | pY indstilling | pST indstilling |
| Prøve indlæsning (µL) | 5 | |
| Lastning strømningshastighed (µL/min) | 5 | |
| Gradient strømningshastighed (nL/min) | 300 | |
| Lineær gradient (procentdel 0,16% myresyre, 80% ACN i 0,2% myresyre) | 4 - 15% for 5 min | 4 - 15% til 30 min |
| 15 - 50% i 40 min | 15 - 25% til 40 min | |
| 50 - 90% for 5 min | 25 - 50% for 44 min | |
| 50 - 90% for 11 min | ||
| Fuld scanningsopløsning | 120.000 | |
| Antallet af mest intense ioner valgt | 20 | |
| Relative kollisionen energi (%) (HCD) | 27 | |
| Dynamisk udstødelse (s) | 20 | |
Tabel 2: LC-MS indstillinger. Dette er et eksempel på LC-MS indstillinger i en typisk shotgun phosphoproteomic eksperiment. Prøverne blev indlæst på et trap kolonne. Fælden var bragt på linje med en analytisk kolonne. Disse indstillinger er optimeret til ved hjælp af LC-MS system, der er anført i tabel af materialer og reagenser. Disse indstillinger skal være justeret for andre LC-MS-systemer.
| MaxQuant Parameter indstillinger | ||
| Indstilling | Handling | |
| Gruppe-specifikke parametre | ||
| Type | Type | Vælg Standard |
| Mangfoldighed | Sat til 1 | |
| Fordøjelsen tilstand | Enzym | Vælg Trypsin/P |
| Max. ubesvarede splittelser | Sæt til 2 | |
| Ændringer | Variabel ændringer | Tilføje Phospho (stald) |
| Label-fri kvantificering | Label-fri kvantificering | Vælg LFQ |
| LFQ min. forholdet count | Sat til 1 | |
| Hurtig LFQ | Check ud | |
| Diverse | Re kvantificere | Check ud |
| Globale parametre | ||
| Sekvenser | FASTA filer | Vælg fasta filen downloades fra UniProt |
| Faste ændringer | Tilføj Carbamidomethyl (C) | |
| Adv. identifikation | Match mellem kørsler | Check ud |
| Match tidsvindue | Indstillet til 5 min | |
| Justering tidsvindue | Sat til 20 min | |
| Matche uidentificerede funktioner | Check ud | |
| Protein kvantificering | Min. forholdet count | Sat til 1 |
| Mappen lokaliteter | Ændre i overensstemmelse hermed | |
Tabel 3: MS analyse softwareindstillinger. I MaxQuant, var de gruppe-specifikke og globale parametre i denne tabel valgt eller justeret. Alle andre parametre forblev på standard. Disse eksperimenter blev udført ved hjælp af version 1.5.3.30. Parametrene, der kan variere fra version til version og fra software til software.
Discussion
Før du bruger denne protokol til at berige for phosphopeptides, er en omhyggelig overvejelse af de eksperimentelle design kritisk. Ved hjælp af biologiske replikater er en mere omkostningseffektiv anvendelse af massespektrometri ressourcer end tekniske replikater. Antallet af gentagelser, der er nødvendige for vil delvis afhænge af variabiliteten i data. En nylig undersøgelse viste, at mens stigende antal flergangsbestemmelser ud over tre kun marginalt øger antallet af identifikationer, antallet af betydelige identifikationer mellem grupper stiger med mere replikater10.
På grund af den lavere overflod af fosfoproteiner i cellen er tilstrækkeligt protein udgangsbeløbene nødvendig for at opnå en global phosphoproteome fra prostatakræft prøver i registreringstilstand. I disse eksperimenter, blev 5 mg protein brugt. Cirka fem næsten sammenflydende 15-cm retter af celler giver nok protein som input til denne protokol, selv om dette vil være cell line-afhængige. Hvad angår tumor væv er det forventede udbytte af protein ca 6-8% af væv vægt. I indstillingen i vitro er en positive kontrolprøve overveje tilsætning af 1 mM vanadate i 30 min før høsten cellerne. Vanadate, en konkurrencedygtig protein phosphotyrosyl fosfatase inhibitor, vil bevare tyrosin fosforylering, hvilket øger antallet af pY peptid identifikationer29.
Ren fordøjelsen er et vigtigt skridt til at maksimere phosphopeptide identifikation. Ud over Coomassie pletten test, kan procent af ubesvarede splittelser i dataene, der bruges til at evaluere fordøjelsen effektivitet (figur 2). Kvalitetskontrol software er tilgængelig der analyserer ubesvarede splittelser og andre målinger til at vurdere MS data kvalitet30. Mens trypsin er de mest almindelige, alternative proteaser findes genereret5 til adresse dækning huller i proteomet hvor optimal tryptic peptider kan være31. Indstillingerne for MS analyse software ville derefter skal ændres i overensstemmelse hermed for at justere for ændringer i proteaser.
Protokollen beskæftiger immunoprecipitation (for pY berigelse) og titandioxid (TiO2) til at berige for phosphopeptides. Alternative tilgange til at berige for peptider omfatter immobiliseret metal affinitet kromatografi (IMAC), andre metaloxider til metaloxid affinitet kromatografi (MOAC) såsom aluminium hydroxid og polymer-baserede metal ion affinitet capture (PolyMAC) 5,12. Tidligere undersøgelser har vist, at forskellige berigelse metoder berige for forskellige populationer af phosphopeptides32. For eksempel, beriger IMAC mere multi-fosforyleret peptider mens MOAC helst beriger for mono-fosforyleret peptider33. Repræsentative resultater af denne protokol afspejler denne observation (figur 4B). En nylig publikation demonstreret at kombinere IMAC og MOAC ved hjælp af en hybrid materiale potentielt kunne give større dækning af phosphopeptide arter34. Således, denne protokol kan ændres for at udnytte andre berigelse metoder sideløbende at give mulighed for endnu mere omfattende phosphoproteomic analyser.
MaxQuant26 software suite bruges til at analysere MS data i denne protokol, men kommercielle applikationer35 er også tilgængelige for phosphopeptide identifikation og kvantificering. For phosphopeptide identifikation, er lokalisering sandsynligheden cutoff anvendt. Dette filter er udført for at markere for phosphopeptides med en høj tillid (dvs.større end 0,75) phosphoresidue identifikation10,28. Med andre ord er den summerede sandsynligheden for alle andre restprodukter, der potentielt kunne indeholde phospho-gruppen mindre end 0,25. Denne cutoff kunne hæves for at øge strengheden af phosphopeptide udvalget. Med hensyn til antallet af identifikationer er det forventede antal pY peptider i hundredvis, mens det forventede antal pST peptider er i de høje tusindvis. Disse værdier afspejler tidligere observerede phosphoproteome distribution hvor omkring 2%, 12% og 86% af phosphosites er pY, pT og pS, henholdsvis28.
Hvis de pY og pST berigelse skridt udføres sideløbende, kan prøve forberedelsestrin i protokollen være afsluttet i seks dage. Ved parring med den kraftfulde værktøj af MS, giver phosphopeptide berigelse protokoller som denne en global tilgang til forskere til at indsamle data til at analysere phosphoproteome i deres respektive forskningsfelter.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke medlemmerne af Drake lab for at give gode råd og input på manuskriptet. Vi takker også medlemmerne af biologisk masse massespektrometri facilitet af Robert Wood Johnson medicinskole og Rutgers, The State University of New Jersey, for rådgivning og udførelse af massespektrometri på vores prøver. Larry C. Cheng understøttes af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under award nummer T32 GM008339. Thomas G. Graeber understøttes af NCI/NIH (SPORE i Prostata Cancer P50 CA092131; P01 CA168585) og en American Cancer Society forskning Scholar Award (RSG-12-257-01-TBE). Justin M. Drake er støttet af afdeling af forsvar Prostata Cancer Research Program W81XWH-15-1-0236, Prostata Cancer Foundation Young Investigator Award, New Jersey Health Foundation og en præcision medicin initiativ Pilot Award fra Rutgers Cancer Institute i New Jersey.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
| Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
| Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
| Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
| CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| 20G needle | BD | B305175 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
| Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
| Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
| Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
| 27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
| Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
| TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
| SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
| Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
| Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
| MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
| ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
| nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
| Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
| Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
| Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
| MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
| Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Paller, C. J., Antonarakis, E. S. Management of biochemically recurrent prostate cancer after local therapy: evolving standards of care and new directions. Clinical Advances in Hematology & Oncology. 11 (1), 14-23 (2013).
- Lowrance, W. T., Roth, B. J., Kirkby, E., Murad, M. H., Cookson, M. S. Castration-resistant prostate cancer: AUA guideline amendment 2015. The Journal of Urology. 195 (5), 1444-1452 (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nature Biotechnology. 28 (7), 710-721 (2010).
- Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R.
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
- Bantscheff, M., Lemeer, S., Savitski, M. M., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: critical review update from 2007 to the present. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (4), 939-965 (2012).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Rubbi, L., et al. Global phosphoproteomics reveals crosstalk between Bcr-Abl and negative feedback mechanisms controlling Src signaling. Science Signaling. 4 (166), ra18 (2011).
- Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045 (2018).
- Rush, J., et al. Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells. Nature Biotechnology. 23 (1), 94-101 (2005).
- Fila, J., Honys, D.
- Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
- Drake, J. M., et al. Phosphoproteome integration reveals patient-specific networks in prostate cancer. Cell. 166 (4), 1041-1054 (2016).
- Lue, H. W., et al. Metabolic reprogramming ensures cancer cell survival despite oncogenic signaling blockade. Genes & Development. 31 (20), 2067-2084 (2017).
- Francavilla, C., et al. Phosphoproteomics of primary cells reveals druggable kinase signatures in ovarian cancer. Cell Reports. 18 (13), 3242-3256 (2017).
- Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
- Skaggs, B. J., et al. Phosphorylation of the ATP-binding loop directs oncogenicity of drug-resistant BCR-ABL mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (51), 19466-19471 (2006).
- Zimman, A., et al. Activation of aortic endothelial cells by oxidized phospholipids: a phosphoproteomic analysis. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2812-2824 (2010).
- Zimman, A., Berliner, J. A., Graeber, T. G. Phosphoproteomic analysis of aortic endothelial cells activated by oxidized phospholipids. Methods in Molecular Biology. , 53-69 (2013).
- Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Meyer, T. S., Lamberts, B. L. Use of coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochimica el Biophysica Acta. 107 (1), 144-145 (1965).
- Bergstrom Lind, S., et al. Immunoaffinity enrichments followed by mass spectrometric detection for studying global protein tyrosine phosphorylation. Journal of Proteome Research. 7 (7), 2897-2910 (2008).
- Pinkse, M. W., Uitto, P. M., Hilhorst, M. J., Ooms, B., Heck, A. J. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Analytical Chemistry. 76 (14), 3935-3943 (2004).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Olsen, J. V., et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 127 (3), 635-648 (2006).
- Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. The Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
- Bielow, C., Mastrobuoni, G., Kempa, S. Proteomics quality control: quality control software for MaxQuant results. Journal of Proteome Research. 15 (3), 777-787 (2016).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Mueller, M., Domon, B., Aebersold, R. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nature Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
- Leitner, A., Sturm, M., Lindner, W. Tools for analyzing the phosphoproteome and other phosphorylated biomolecules: a review. Analytica Chimica Acta. 703 (1), 19-30 (2011).
- Yang, D. S., et al. Design and synthesis of an immobilized metal affinity chromatography and metal oxide affinity chromatography hybrid material for improved phosphopeptide enrichment. Journal of Chromatography A. 1505, 56-62 (2017).
- Al Shweiki, M. R., et al. Assessment of label-free quantification in discovery proteomics and impact of technological factors and natural variability of protein abundance. Journal of Proteome Research. 16 (4), 1410-1424 (2017).
