इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक प्रक्रिया को निकालने के लिए और प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइनों या ऊतकों से phosphopeptides को समृद्ध phosphoproteome के माध्यम से मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटियोमिक् के विश्लेषण के लिए ।
Phosphoproteomics phosphorylated प्रोटीन के बड़े पैमाने पर अध्ययन शामिल है । प्रोटीन फास्फारिलीकरण कई संकेत transduction रास्ते में एक महत्वपूर्ण कदम है और कसकर kinases और phosphatases द्वारा विनियमित है । इसलिए, निस्र्पक phosphoproteome उपंयास लक्ष्यों और oncologic चिकित्सा के लिए मार्क्स की पहचान करने में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । मास स्पेक्ट्रोमेट्री दुनिया भर में पता लगाने और अद्वितीय फास्फारिलीकरण घटनाओं के हजारों यों तो एक रास्ता प्रदान करता है । हालांकि, phosphopeptides गैर phosphopeptides की तुलना में बहुत कम प्रचुर मात्रा में हैं, जैव रासायनिक विश्लेषण अधिक चुनौतीपूर्ण बना । इस सीमा को दूर करने के लिए, phosphopeptides जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करने से पहले समृद्ध करने के लिए तरीकों की आवश्यकता है । हम एक प्रक्रिया का वर्णन निकालने और प्रोटीन को पचाने के लिए ऊतक से पेप्टाइड्स उपज, phosphotyrosine के लिए एक संवर्धन द्वारा पीछा किया (pY) और phosphoserine/threonine (pST) पेप्टाइड्स एक एंटीबॉडी-आधारित और/या टाइटेनियम डाइऑक्साइड (TiO2)-आधारित संवर्धन विधि । नमूना तैयारी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद, हम बाद में तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके phosphopeptides की पहचान और मात्राएं करते हैं ।
एक अनुमान के अनुसार १६५,००० नए मामलों और लगभग २९,००० मौतें प्रोस्टेट कैंसर के कारण २०१८ में हो जाएगा, सबसे आम कैंसर का प्रतिनिधित्व करने और संयुक्त राज्य अमेरिका में पुरुषों में कैंसर से संबंधित मौत के दूसरे प्रमुख कारण1। प्रोस्टेट कैंसर की प्रारंभिक अवस्था में अंग-सीमित रोग के लकीर या विकिरण चिकित्सा के साथ इलाज कर रहे हैं, जहां दस साल पुनरावृत्ति दर के बीच 20% और ४०% रोगियों जो prostatectomy से गुजरना के लिए और के बीच है 30% और ५०% जो विकिरण प्राप्त रोगियों के लिए थेरेपी2. क्योंकि प्रोस्टेट कैंसर के विकास के लिए संकेत एण्ड्रोजन पर निर्भर करता है, शल्य चिकित्सा और रासायनिक बधिया चिकित्सा भी उच्च जोखिम वाले रोगियों के लिए कार्यरत हैं । हालांकि, पतन तब होता है जब कैंसर अब एण्ड्रोजन अभाव चिकित्सा के रूप में जैव रासायनिक पुनरावृत्ति, जहां प्रोस्टेट-विशिष्ट प्रतिजन में सीरम उगता फिर से सबूत के रूप में प्रतिक्रिया करता है । प्रगति में इस बिंदु पर, मेटास्टेसिस अक्सर के रूप में अच्छी तरह से पता चला रहे हैं । इस उंनत चरण, मेटास्टेटिक बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर कहा जाता है, रोग के घातक रूप जहां पूर्वानुमान कम से दो साल3की एक औसत अस्तित्व समय है का प्रतिनिधित्व करता है । कुछ इलाज के विकल्प देर से चरण रोग में उपलब्ध हैं, जैसे enzalutamide और abiraterone के रूप में दूसरी पीढ़ी के antiandrogens, साथ ही साथ taxane आधारित कीमोथेरेपी docetaxel की तरह । उपलब्ध उपचार के बावजूद, रोग अक्सर प्रगति । इसलिए, खोज और उपंयास उपचार रूपरेखा के विकास के लिए उंनत रोग के साथ प्रोस्टेट कैंसर रोगियों की देखभाल में सुधार आवश्यक हैं ।
मास-स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) आधारित दृष्टिकोण proteome के एक वैश्विक विश्लेषण के माध्यम से सैकड़ों की खोज के माध्यम से उपलब्ध कराने के हजारों पेप्टाइड analytes4. विशेष रूप से, डिस्कवरी प्रोटियोमिक्, जिसे डेटा-निर्भर अर्जन (डीडीए) भी कहा जाता है,4,5के हजारों पेप्टाइड्स की पहचान और quantitation की प्राप्ति कर सकता है । एमएस-आधारित डिस्कवरी प्रोटियोमिक् आगे ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक्, जहां बरकरार प्रोटीन की विशेषता है में delineated जा सकता है, और नीचे (भी शॉटगन के रूप में जाना) प्रोटियोमिक्, जहां पेप्टाइड्स5प्रोटीन की विशेषताएं विश्लेषण कर रहे हैं । इस प्रकार, बन्दूक प्रोटियोमिक् में, एक प्रोटियोलिसिस कदम नमूना तैयार करने में एमएस विश्लेषण पूर्ववर्ती पेप्टाइड्स में प्रोटीन सट करने के लिए जगह लेता है । अंत में, एक डेटाबेस खोज पेप्टाइड्स पहचान के लिए प्रोटीन के लिए वापस मैप करने के लिए किया जाता है । लेबल-मुक्त और साथ ही कई आइसोटोप-लेबलिंग [जैसे, स्थिर आइसोटोप सेल संस्कृति (SILAC) में एमिनो एसिड द्वारा लेबलिंग] तरीकों मात्रा के लिए नमूने6,7के बीच पेप्टाइड की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जबकि आइसोटोप लेबलिंग तकनीक सोने के मानक हैं, लेबल मुक्त तरीकों समान ठहराव accuracies8,9 का प्रदर्शन किया है और संवेदनशीलता और विशिष्टता10के बीच तुलनीय tradeoffs है. लेबल-मुक्त quantitation अधिक से अधिक कवरेज प्रदान करता है और कई नमूनों के बीच तुलना की अनुमति देता है, जबकि लेबल आधारित पद्धतियां लागत और division क्षमता6,7,8तक सीमित होती हैं ।
इसके अलावा, शॉटगन एमएस भी इस तरह के फास्फारिलीकरण11के रूप में पोस्ट-शोधों संशोधनों (PTMs) से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कुल पेप्टाइड्स की तुलना में phosphopeptides के निचले stoichiometric प्रकृति के कारण, कई तरीकों phosphopeptides के लिए समृद्ध करने के लिए कार्यरत हैं, immunoprecipitation (phosphotyrosine) पेप्टाइड्स के एंटीबॉडी-आधारित pY सहित, टाइटेनियम डाइऑक्साइड (TiO2 ), और मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC)5,12. क्योंकि प्रोटीन फास्फारिलीकरण कई सेल संकेतन रास्ते में एक महत्वपूर्ण कदम है, शॉटगन phosphoproteomics शोधकर्ताओं ने13स्तन, प्रोस्टेट14, गुर्दे15सहित विभिन्न प्रकार के कैंसर में परिवर्तन संकेतन सेल की जांच करने के लिए अनुमति देता है, और डिंबग्रंथि,16,17 बेहतर कैंसर जीवविज्ञान को समझने के लिए और चिकित्सा के लिए संभावित नए लक्ष्य की पहचान करने के लिए ।
इस लेबल मुक्त शॉटगन phosphoproteomic विधि का निर्माण किया गया था और Graeber समूह18,19,20द्वारा पिछले काम के आधार पर परिष्कृत । इस प्रोटोकॉल निष्कर्षण और प्रोटीन और phosphoproteins पेप्टाइड्स में ऊतक से पाचन का वर्णन करने से शुरू होता है । हम तो विस्तार pY पेप्टाइड्स के संवर्धन विशिष्ट phosphotyrosine एंटीबॉडी और TiO2का उपयोग कर । हम भी phosphoserine/threonine (pST) के संवर्धन का वर्णन मजबूत कटियन एक्सचेंज (SCX) TiO2के बाद का उपयोग कर पेप्टाइड्स । इस प्रोटोकॉल एक एमएस सुविधा और एमएस विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए नमूनों की प्रस्तुति के साथ समाप्त करने की पहचान करने और phosphopeptides और उनके इसी phosphoproteins यों तो । इस प्रोटोकॉल के आवेदन अंय कैंसर और कैंसर विज्ञान के बाहर खेतों में प्रोस्टेट कैंसर से परे का विस्तार कर सकते हैं ।
phosphopeptides, प्रयोगात्मक डिजाइन के एक सावधान विचार के लिए समृद्ध करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले महत्वपूर्ण है । जैविक प्रतिकृति का उपयोग एक अधिक लागत प्रभावी बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री संसाधनों का उपयोग तकनीकी प्रतिकृति से है । प्रतिकृति की संख्या जो आवश्यक है डेटा की परिवर्तनशीलता पर भाग में निर्भर करेगा । हाल के एक अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि, जबकि तीन से परे दोहराने की संख्या में वृद्धि केवल मामूली पहचान की संख्या बढ़ जाती है, समूहों के बीच महत्वपूर्ण पहचान की संख्या बढ़ जाती है और10के साथ प्रतिकृति ।
सेल में phosphoproteins की कम बहुतायत के कारण, पर्याप्त प्रारंभिक प्रोटीन मात्रा डिस्कवरी मोड में प्रोस्टेट कैंसर के नमूनों से एक वैश्विक phosphoproteome प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । इन प्रयोगों में 5 मिलीग्राम प्रोटीन का इस्तेमाल किया गया । लगभग पांच कोशिकाओं के 15 सेमी व्यंजन करीब के रूप में इस प्रोटोकॉल में इनपुट के रूप में पर्याप्त प्रोटीन प्रदान करते हैं, हालांकि इस सेल लाइन पर निर्भर होगा । ट्यूमर ऊतक के लिए के रूप में, प्रोटीन की उंमीद उपज ऊतक वजन के बारे में 6-8% है । में इन विट्रो सेटिंग में, एक सकारात्मक नियंत्रण नमूना पर विचार करने के लिए 1 mM vanadate के अतिरिक्त 30 मिनट के लिए कोशिकाओं संचयन से पहले है । Vanadate, एक प्रतियोगी प्रोटीन phosphotyrosyl फॉस्फेट अवरोधक, tyrosine फास्फारिलीकरण की रक्षा करेगा, इस प्रकार pY पेप्टाइड की संख्या में वृद्धि29पहचान ।
स्वच्छ पाचन phosphopeptide पहचान को अधिकतम करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । Coomassie दाग परीक्षण के अलावा, डेटा में चूक दरारें का प्रतिशत पाचन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (चित्रा 2). गुणवत्ता नियंत्रण सॉफ्टवेयर उपलब्ध है कि छूटी दरारें और अंय मैट्रिक्स का विश्लेषण करने के लिए एमएस डाटा गुणवत्ता30का आकलन है । जबकि trypsin सबसे आम है, वैकल्पिक proteome जहां इष्टतम tryptic पेप्टाइड्स31उत्पंन नहीं किया जा सकता में कवरेज अंतराल पता करने के लिए5 उपलब्ध हैं । एमएस विश्लेषण सॉफ्टवेयर की सेटिंग्स तो जरूरत के अनुरूप संशोधित करने के लिए एक बार में परिवर्तन के लिए समायोजित किया जाएगा ।
प्रोटोकॉल immunoprecipitation रोजगार (pY संवर्धन के लिए) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से टाइटेनियम डाइऑक्साइड (TiO2) phosphopeptides के लिए समृद्ध करने के लिए । पेप्टाइड्स के लिए समृद्ध करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण शामिल मैटीरियल धातु संबध क्रोमैटोग्राफी (IMAC), धातु ऑक्साइड संबध क्रोमैटोग्राफी के लिए अन्य धातु आक्साइड (MOAC) जैसे एल्यूमिनियम हीड्राकसीड, और बहुलक आधारित धातु आयन संबंध कैप्चर (PolyMAC) 5,12. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि विभिंन संवर्धन तरीकों३२phosphopeptides के विभिंन आबादियों के लिए समृद्ध । उदाहरण के लिए, IMAC और अधिक बहु phosphorylated पेप्टाइड्स को समृद्ध करती है जबकि MOAC अधिमानतः मोनो phosphorylated पेप्टाइड्स३३के लिए समृद्ध । इस प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि परिणाम इस प्रेक्षण (figure4B) को प्रतिबिंबित करते हैं । हाल के एक प्रकाशन का प्रदर्शन किया है कि IMAC और MOAC एक संकर सामग्री का उपयोग संभावित phosphopeptide प्रजातियों३४की अधिक से अधिक कवरेज प्रदान कर सकता है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल को समानांतर में अंय संवर्धन तरीकों का उपयोग करने के लिए और भी अधिक व्यापक phosphoproteomic विश्लेषण के लिए अनुमति संशोधित किया जा सकता है ।
MaxQuant26 सॉफ्टवेयर सुइट के लिए इस प्रोटोकॉल में एमएस डेटा का विश्लेषण किया जाता है, लेकिन व्यावसायिक अनुप्रयोगों३५ phosphopeptide पहचान और ठहराव के लिए भी उपलब्ध हैं । phosphopeptide पहचान के लिए, स्थानीयकरण प्रायिकता कटऑफ लागू किया जाता है । यह फ़िल्टर phosphoresidue पहचान10,28में एक उच्च विश्वास (यानी, ०.७५ से अधिक) के साथ phosphopeptides के लिए चयन करने के लिए किया जाता है । दूसरे शब्दों में, phospho-समूह संभावित रूप से हो सकता है अंय सभी अवशेषों की अभिव्यक्त प्रायिकता ०.२५ से कम है । phosphopeptide चयन के stringency को बढ़ाने के लिए यह कटऑफ उठाया जा सकता था । पहचान की संख्या के संबंध में, pY पेप्टाइड्स की अपेक्षित संख्या सैकड़ों में है, जबकि पीएसटी पेप्टाइड्स की अपेक्षित संख्या उच्च हजारों में है । ये मान प्रतिबिंबित पहले phosphoproteome वितरण जहां के बारे में 2%, 12%, और phosphosites के ८६% pY, pT, और pS, क्रमशः28हैं ।
यदि pY और पीएसटी संवर्धन कदम समानांतर में प्रदर्शन कर रहे हैं, नमूना तैयारी प्रोटोकॉल में कदम छह दिनों में पूरा किया जा सकता है । एमएस के शक्तिशाली उपकरण के साथ बाँधना द्वारा, phosphopeptide संवर्धन प्रोटोकॉल जैसे यह वैज्ञानिकों के लिए एक वैश्विक दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए अपने संबंधित अनुसंधान क्षेत्रों में phosphoproteome विश्लेषण डेटा इकट्ठा ।
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि पर सलाह और इनपुट प्रदान करने के लिए ड्रेक लैब के सदस्यों को धन्यवाद । हम भी रॉबर्ट वुड जॉनसन मेडिकल स्कूल और Rutgers, ंयू जर्सी के राज्य विश्वविद्यालय के जैविक जन स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा के सदस्यों को सलाह प्रदान करने और हमारे नमूनों पर जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रदर्शन के लिए धंयवाद । लैरी सी चेंग पुरस्कार संख्या T32 GM008339 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य के संस्थान के जनरल मेडिकल साइंसेज के नेशनल इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित है । थॉमस जी Graeber NCI/NIH (प्रोस्टेट कैंसर P50 CA092131 में बीजाणु द्वारा समर्थित है; P01 CA168585) और एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी रिसर्च विद्वान पुरस्कार (RSG-12-257-01-TBE) । जस्टिन एम ड्रेक रक्षा प्रोस्टेट कैंसर अनुसंधान कार्यक्रम W81XWH-15-1-0236, प्रोस्टेट कैंसर फाउंडेशन यंग अंवेषक पुरस्कार, ंयू जर्सी स्वास्थ्य फाउंडेशन, और Rutgers से एक प्रेसिजन चिकित्सा पहल पायलट पुरस्कार के विभाग द्वारा समर्थित है ंयू जर्सी के कैंसर संस्थान ।
Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
20G needle | BD | B305175 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |