Det här protokollet beskriver en procedur för att extrahera och berika phosphopeptides från prostata cancer cellinjer eller vävnader för en analys av den phosphoproteome via mass spectrometry-baserad proteomik.
Phosphoproteomics innebär storskaliga studier av fosforyleras proteiner. Protein fosforylering är ett viktigt steg i många cellsmedierade reaktioner och är hårt reglerad av kinaser och fosfataser. Därför kan karaktärisera phosphoproteome ge insikter i att identifiera nya mål och biomarkörer för onkologiska terapi. Masspektrometri ger ett sätt att globalt påvisa och kvantifiera tusentals unika fosforylering händelser. Phosphopeptides är dock mycket mindre rikliga än icke-phosphopeptides, att göra bioanalys mer utmanande. För att kringgå den här begränsningen krävs metoder för att berika phosphopeptides före masspektrometri analysen. Vi beskriver en procedur för att extrahera och smälta proteiner från vävnad att ge peptider, följt av en anrikning för phosphotyrosine (pY) och phosphoserine/treonin (pST) peptider med en antikropp-baserade eller titandioxid (TiO2)-baserat anrikning-metoden. Efter provberedning och masspektrometri, vi därefter identifiera och kvantifiera phosphopeptides med liquid chromatography-masspektrometri och analysprogram.
Uppskattningsvis 165 000 nya fall och cirka 29.000 dödsfall inträffar 2018 på grund av prostatacancer, som representerar de vanligaste cancerformen och näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i män i USA1. Tidiga stadier av prostatacancer är behandlingsbara med resektion eller strålning terapi av orgel-slutna sjukdom, där tio år Återfallsfrekvensen är mellan 20 och 40% för patienter som genomgår prostatektomi och mellan 30% och 50% för patienter som får strålning behandling2. Eftersom prostatacancer är beroende av androgen signalering för tillväxt, är kirurgisk och kemisk kastrering terapier också anställd för högriskpatienter. Dock inträffar återfall när cancern inte längre svarar på androgen deprivationsterapi vilket framgår av biokemiska återfall, där prostataspecifikt antigen i serum stiger igen. Vid denna tidpunkt i sjukdomsförloppet upptäcks metastaser ofta också. Detta framskridet stadium, kallas metastaserad kastrationsresistent prostatacancer, representerar den dödliga formen av sjukdomen där prognosen är taget medianöverlevnad på mindre än två år3. Få behandlingsalternativ finns i sent stadium sjukdomen, inklusive andra generationens antiandrogener som enzalutamid och abirateron, samt taxanbaserad kemoterapi som docetaxel. Trots tillgängliga behandlingar fortskrider sjukdomen ofta. Upptäckten och utvecklingen av nya behandlingsmetoder är därför nödvändigt att förbättra omhändertagandet av prostatacancerpatienter med avancerad sjukdom.
Masspektrometri (MS)-baserade metoder ge en global analys av proteomet genom påvisande av hundratals till tusentals peptid analyter4. I synnerhet kan upptäckten proteomik, även känd som data-beroende förvärv (DDA), ge identifiering och kvantifiering av tusentals peptider4,5. MS-baserad upptäckt proteomik kan avgränsas ytterligare in uppifrån proteomik, där intakta proteiner karakteriseras, och nedifrån och upp (även kallat shotgun) proteomik, där peptider analyseras för att karakterisera proteiner5. I shotgun proteomik, således sker en proteolys steg i provberedningen föregår MS analysen att klyva proteiner till peptider. I slutet utförs en databas sökning för att mappa peptiderna tillbaka till proteinerna för identifiering. Etikett-fria såväl som flera isotop-märkning [e.g., stabil isotop märkning av aminosyror i cellkultur (SILAC)] kan metoder användas att kvantitativt jämföra peptider mellan prover6,7. Medan isotopen märkning tekniker guldmyntfoten, etikett-fria metoder har visat liknande kvantifiering exaktheter8,9 och har jämförbar kompromisser mellan känslighet och specificitet10. Etikett-fri kvantitering ger större täckning och möjliggör jämförelser mellan många fler prover, medan etikettbaserade metoder begränsas av kostnaderna och multiplexering kapacitet6,7,8.
Dessutom kan hagelgevär MS också användas för att förhöra post-translationella modifieringar (PTMs) såsom fosforylering11. På grund av lägre stökiometrisk hur phosphopeptides jämfört med totala peptider, används flera metoder för att berika för phosphopeptides, inklusive antikroppsbaserade immunoprecipitation av phosphotyrosine (pY) peptider, titandioxid (TiO2 ), och orörlig metall affinitet kromatografi (IMAC)5,12. Eftersom protein fosforylering är ett viktigt steg i många cell signalering vägar, shotgun phosphoproteomics tillåter forskare att undersöka cell signalering förändringar i olika cancerformer, inklusive bröstcancer13, prostata14, nedsatt15, och cystor,16,17 att bättre förstå cancerbiologi och att identifiera potentiella nya mål för behandling.
Denna etikett-gratis shotgun phosphoproteomic var byggd och raffinerade baserat på tidigare arbete av Graeber grupp18,19,20. Detta protokoll börjar med att beskriva utvinning och nedbrytning av proteiner och phosphoproteins från vävnad i peptider. Vi sedan detalj anrikningen av pY peptider med specifika phosphotyrosine antikroppar och TiO2. Vi beskriver också anrikningen av phosphoserine/treonin (pST) peptider med stark ering exchange (SCX) följt av TiO2. Detta protokoll avslutas med inlämning av prover till en MS-anläggning och användning av MS analysprogramvara för att identifiera och kvantifiera phosphopeptides och deras motsvarande phosphoproteins. Tillämpningen av detta protokoll kan sträcka sig bortom prostatacancer i fälten utanför onkologi och andra cancerformer.
Innan du använder detta protokoll att berika för phosphopeptides, är ett noggrant övervägande av experimentell design kritiskt. Använda biologiska replikat är en mer kostnadseffektiv användning av masspektrometri resurser än tekniska replikat. Antalet replikat som behövs beror delvis på variationer i data. En nyligen genomförd studie visade att medan ökar antalet replikat utöver tre endast marginellt ökar antalet identifieringar, antalet betydande identifieringar mellan grupper ökar med mer replikerar10.
På grund av det lägsta överflödet av phosphoproteins i cellen är tillräckligt protein utgångsbelopp nödvändiga för att erhålla en global phosphoproteome från prostatacancer prover i identifieringsläge. I dessa experiment användes 5 mg protein. Cirka fem nästan konfluenta 15-cm rätter av celler ger tillräckligt med protein som tillförs detta protokoll, även om detta blir cell linje-beroende. När det gäller tumörvävnad är den förväntade avkastningen av protein omkring 6-8% av vävnad vikt. I in vitro- inställningen för är ett positivt kontrollprov överväga tillägg av 1 mM vanadate för 30 min före skörd cellerna. Vanadate, ett konkurrenskraftiga protein phosphotyrosyl fosfatas hämmare, bevarar den tyrosin fosforylering, vilket ökar antalet pY peptid identifieringar29.
Ren matsmältningen är ett viktigt steg för att maximera phosphopeptide identifiering. Förutom Coomassie fläcken testet, kan procent av missade Klyvningar i data användas för att utvärdera matsmältning effektivitet (figur 2). Finns kvalitetskontroll programvara som analyserar missade Klyvningar och andra mått för att bedöma MS data kvalitet30. Medan trypsin är de vanligaste, alternativa proteaser finns genererade5 att åtgärda täckning brister i proteomet där optimal tryptic peptider inte kan vara31. Inställningarna för den MS-analysprogrammet skulle då behöva ändras i enlighet därmed justera för förändringar i proteaser.
Protokollet sysselsätter immunoprecipitation (för pY anrikning) samt titandioxid (TiO2) att berika för phosphopeptides. Alternativa sätt att berika för peptider inkluderar immobiliserade metall affinitetskromatografi (IMAC), andra metalloxider för metalloxid affinitetskromatografi (MOAC) såsom aluminiumhydroxid och polymerbaserade metall Jon affinitet capture (PolyMAC) 5,12. Tidigare studier har visat att olika anrikningsmetoder berika för olika populationer av phosphopeptides32. Exempelvis berikar IMAC fler multi-fosforyleras peptider medan MOAC helst berikar för mono-fosforyleras peptider33. Representativa resultat i detta protokoll speglar denna observation (figur 4B). En ny publikation visat att kombinera IMAC och MOAC använder en hybridmaterial potentiellt skulle kunna ge större täckning av phosphopeptide arter34. Detta protokoll kan således ändras för att utnyttja andra anrikningsmetoder parallellt som möjliggör ännu mer omfattande phosphoproteomic analyser.
MaxQuant26 mjukvaran sviten används för att analysera MS data i detta protokoll, men det finns också kommersiella tillämpningar35 för phosphopeptide identifiering och kvantifiering. Phosphopeptide identifiering tillämpas en lokalisering sannolikhet cutoff. Detta filter utförs för att markera för phosphopeptides med en högt förtroende (dvs.större än 0,75) phosphoresidue identifiering10,28. Med andra ord, är summerade sannolikheten för alla andra rester som kan potentiellt innehålla phospho-gruppen mindre än 0,25. Detta cutoff kan höjas för att öka striktheten hos phosphopeptide valet. När det gäller antalet identifieringar är det förväntade antalet pY peptider i hundratals, medan det förväntade antalet pST peptider är hög tusentals. Dessa värden återspeglar tidigare observerade phosphoproteome distribution där ca 2%, 12% och 86% av phosphosites är pY, pT och pS, respektive28.
Om pY och pST anrikning stegen utförs parallellt, kan provberedningssteg i protokollet slutföras i sex dagar. Genom att para ihop med det kraftfulla verktyget för MS, ger phosphopeptide anrikning protokollen som denna en global strategi för forskare att samla in data för att analysera phosphoproteome inom sina respektive forskningsområden.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmar av Drake lab för att ge råd och input på manuskriptet. Vi tackar också ledamöterna i den biologiska Mass Spectrometry anläggning av Robert Wood Johnson Medical School och Rutgers, The State University of New Jersey, för rådgivning och utför masspektrometri på våra prover. Larry C. Cheng stöds av National Institute of General Medical Sciences av det nationella Institutes of Health award nummer T32 GM008339. Thomas G. Graeber stöds av NCI/NIH (SPORE i prostata Cancer P50 CA092131; P01 CA168585) och en American Cancer Society Research Scholar Award (RSG-12-257-01-TBE). Justin M. Drake stöds av den avdelning av försvar prostata Cancer Research Program W81XWH-15-1-0236, prostata Cancer Foundation Young Investigator Award, Stiftelsen New Jersey hälsa och en Precision Medicine initiativ Pilot Award från Rutgers Cancer Institute i New Jersey.
Ultra-Low Temperature Freezer | Panasonic | MDF-U76V | |
Freezer -20 °C | VWR | scpmf-2020 | |
Swing rotor bucket | ThermoFisher Scientific | 75004377 | |
Vacuum manifold | Restek | 26080 | |
Lyophilizer | Labconco | 7420020 | |
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
End-over-end rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | |
Razor blade | Fisher Scientific | 620177 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Glass culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-26 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
20G needle | BD | B305175 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
Screw cap cryotube | ThermoFisher Scientific | 379189 | |
Nunc 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific | 12-565-268 | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 02-707-181 | |
Millipore 0.2 µm spin filter | Millipore Sigma | UFC30GVNB | |
Low protein-binding Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431081 | |
anti-Phosphotyrosine, Agarose, Clone: 4G10 | Millipore Sigma | 16101 | |
27B10.4 antibody | Cytoskeleton | APY03-beads | |
Peptide assay kit | Thermo Scientific | 23275 | Step 7 |
TopTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Steps 5 and 9 |
SCX columns (PolySULFOETHYL A) | PolyLC Inc | SPESE1203 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
Trifluoracetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI-28904 | |
Acetonitrile (ACN) | Fisher Scientific | A21-1 | |
Lactic acid | Sigma-Aldrich | 69785-250ML | |
Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | BP510-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypsin, TPCK Treated | Worthington Biochemicals | LS003740 | |
Lysyl Endopeptidase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 125-05061 | |
MonoTip | PolyLC Inc | TT200TIO.96 | Step 10 |
ZipTip | MilliporeSigma | ZTC18S096 | Step 6 |
nanoEase, MZ peptide BEH C18, 130A, 1.7 μm, 75 μm x 20 cm | Waters | 186008794 | Step 11: analytical column |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Columns | ThermoFisher Scientific | 164535 | Step 11: trap column |
Ultimate 3000 RLSCnano System | Dionex | ULTIM3000RSLCNANO | Step 11 |
Q Exactive HF | ThermoFisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Step 11 |
MilliQ water | deionized water used to prepare all solutions and bufferes | ||
Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | sonicator |
Polytron System PT | Kinematica AG | PT 10-35 GT | homogenizer |