Summary
Her, er en enkel, effektiv, og omkostningseffektiv metode til sgRNA kloning skitseret.
Abstract
Den skitserede protokol beskriver strømlinet metoder til effektiv og omkostningseffektiv produktion af Cas9-associerede guide RNA'er. To alternative strategier for guide RNA (gRNA) kloning er skitseret, baseret på brugen af Type IIS begrænsning enzymet BsmBI i kombination med en række kompatible vektorer. Uden for adgang til Sanger Sekventeringen services til at validere de genererede vektorer, er ingen speciel udstyr eller reagenser påkrævet bortset fra dem, der er standard til moderne molekylærbiologiske laboratorier. Den skitserede metode er primært beregnet til kloning én enkelt gRNA eller en parret gRNA-udtrykker vektor ad gangen. Denne procedure skalerer ikke godt for generation af biblioteker, der indeholder tusindvis af gRNAs. Til disse formål anbefales alternative kilder af oligonukleotid syntese som oligo-chip syntese. Endelig, mens denne protokol fokuserer på et sæt af pattedyr vektorer, den generelle strategi er plast og finder anvendelse på enhver organisme, hvis passende gRNA vektor er tilgængelige.
Introduction
CRISPR-forbundet protein 9 (Cas9) er et RNA-styrede endonuklease, som er rettet mod en ønskede genomisk mål når kompleksbundet med et passende udformet lille guide RNA (gRNA)1,2. gRNAs omfatter en 20-nucleotidsekvensen (protospacer), som supplerer genomisk target sekvens. Ved siden af genomisk målet er sekvens en 3' protospacer-associerede motiv (PAM), som er nødvendig for Cas9 bindende. I tilfælde af Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9), dette har sekvens NGG. Ved bindende DNA mål, kløver Cas9 begge dele af DNA, dermed stimulere reparations-mekanismer, der kan udnyttes til at ændre locus af interesse. Aktivering af den fejlbehæftede ikke-homologe at deltage i slutning (NHEJ) vej kan forårsage afbrydelse af et target gen. Alternativt, reparationer foretaget via en homolog rekombination kan stimulere den målrettede integration af en ønskede DNA sekvens hvis en donor skabelon tilbydes6. Nukleasen-døde Cas9 (dCas9) varianter kan også være genereret3 af muterer restkoncentrationer i Cas9, der er væsentlige for endonucleolytic aktivitet. dCas9 forbliver ansvarlige for DNA bindende men klippe ikke sit bundne mål. Ved fusing forskellige effektor domæner til dCas9 og lede det i nærheden af et gen transcriptional startsted, kan dCas9 bruges til selektiv gen induktion eller delvis genhæmning4,5.
Mens utrolig kraftfuld, kræver evnen til at bruge Cas9 til at målrette en genomisk sekvens af interesse, at en bruger først genererer en unik til target kvadratnetsreference gRNA. En række metoder til at opbygge gRNA udtryk vektorer har tidligere været beskrevet, mange af varierende effektivitet og koste6,7,8. Enkeltstående PCR-amplikoner kan anvendes som gRNAs til hurtig screening, går fra oligonukleotid levering til Transfektion inden for flere timer; Det kræver dog Ultramer (over 100 bp) oligo syntese, hvilket er dyrt9. Det er også muligt at købe gBlocks, der er mere omkostningseffektive end Ultramers. Som Cas9 er hurtigt blevet en integreret del af den moderne Molekylærbiologi toolkit, ville en enkel, billig og meget effektiv metode til gRNA kloning være en velsignelse for feltet. Metoden beskrevet her har været ansat i vores gruppe og samarbejdende laboratorier for de sidste mange år til at generere mere end 2.000 unikke gRNAs4.
Den skitserede metode fokuserer på teknikker til kloning af lentiviral kompatibel vektorer der indeholder en enkelt gRNA eller højst to gRNAs. I generation af plasmider, der indeholder mere end to gRNAs, eller at klone et bibliotek med gRNAs, anbefales alternative tilgange9,10,11,12.
Protocol
Bemærk: Følgende protokol beskriver, hvordan du udføre gRNA design ved hjælp af online værktøjer (trin 1,1-1,4), som er fælles for alle metoder til gRNA plasmid konstruktion detaljeret i dette håndskrift. Når de ønskede gRNAs er identificeret, beskrives trin for at bestille de nødvendige oligonukleotider sammen med flere forskellige metoder til at indføre oligonukleotider udtryk vektorer (fx, pSB700). Præsenteret er 2 metoder til kloning enkelt guide-udtrykker vektorer baseret på enten ligatur i en predigested udtryk vektor (trin 2-7.3) eller Golden Gate kloning (trin 8-8.4). Yderligere skitseret er en strategi for kloning parrede guide-udtrykker vektorer ved hjælp af polymerase kædereaktion (PCR) efterfulgt af Golden Gate kloning (trin 11-16). Endelig, fælles metoder for udførelse af en E. coli kemisk omdannelse (trin 9-9.6) og et udtryk vektor sekvens validering (trin 10 til 10.2.3) er også beskrevet.
- Design gRNA oligonukleotider ved hjælp af online værktøjer som følger.
- Design gRNAs ved hjælp af online værktøjer som sgRNA målscorer 2,0 online værktøj (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 eller alternativer såsom brede sgRNA designværktøj (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgrna-design)14 og flere andre15.
- Bruge gen navn, symbol eller rå DNA target sekvenser til at generere potentielle gRNA sekvenser.
Bemærk: En regnearksfil (.csv/.xls) med alle de potentielle gRNAs mod genet eller den angivne sekvens er lavet. Kvaliteten af den potentielle gRNAs vil blive rapporteret som Score hvis sgRNA målscorer 2,0 online værktøj bruges, eller % målet effektivitet hvis værktøjet bred sgRNA design bliver brugt. Begge foranstaltninger afledes på baseret på på target skære aktivitet. - Overveje Off-target aktivitet i gRNA udvalg, når ranking af gRNAs.
Bemærk: Optimale guider er dem med den største på target effektivitet og den mindste mål aktivitet. For aktivering (CRISPRa), er gRNAs designet til at målrette regionen fra 1-200 bp opstrøms transcriptional start websted (TSS)4,15. Til hæmning (CRISPRi), gRNAs er designet til at målrette regionen fra 50 bp opstrøms af TSS indtil 300 bp nedstrøms TSS5. Hvis du vil deaktivere et gen ved hjælp af Cas9 skæring, er gRNAs designet til at målrette de første 10-50% af kodning sekvensen nedstrøms for den igangsættende codon (som gRNAs rettet mod 3'-enden af genet har vist sig at være mindre effektiv)13. - Sikre ingen interne BsmBI websteder er til stede, hvis oligonukleotider bliver brugt til Golden Gate kloning, da dette vil resultere i de udglødet oligonukleotider at blive fordøjet13.
- Vælg genomisk target sekvenser og fjerne 3' NGG PAM (forlader kun protospacer sekvens) for enkelt gRNA oligonukleotid sekvensen ændring (f.eks.start sekvens: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).
Bemærk: Hvis du bruger et regneark, fjerner følgende formel 3' NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), hvor A2 er cellen, der indeholder mål sekvens og PAM.- Føj CACCG til 5'-enden af oligo.
Bemærk: Efter ligatur til pSB700 rygrad, denne sekvens vil bestå af 3' slutningen af U6 initiativtageren kørsel transskription af gRNA. "CACC" sekvens sikrer, at oligo er kompatibel med udhæng for BsmBI-fordøjet pSB700 vektor. "G" er et krav i Polymerase III initiativtagere og sikrer effektiv indledning af transskription af gRNA. Brug følgende formel i et regneark til at udføre denne opgave: =CONCATENATE("CACCG",(B2)), hvor B2 er cellen indeholder protospacer sekvens [f.eks.tilføjelse af 5' CACCG sekvens til protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (dette «««er den endelige fremad oligo, der er bestilt)]. - Oprette en omvendt supplement (rc) af protospacer sekvens.
Bemærk: For eksempel den omvendte supplement af de førnævnte protospacer er TGGATGAGGGAGAGCACGCG. - Føj AAAC til 5'-enden af den rc protospacer. Føj en ekstra C til 3'-enden af den rc protospacer (omvendt oligo).
Bemærk: "AAAC" sekvens sikrer, at oligo er kompatible til kloning til BsmBI-fordøjet pSB700 vektor. Den ekstra "C" på 3' enden er nødvendig for at anneal sekvens til den igangsættende "G" tilføjet til den fremskudte oligo. Brug følgende formel i et regneark til at udføre denne opgave =CONCATENATE("AAAC",(C2),"C"), hvor C2 er cellen, der indeholder den omvendte supplement sekvens [fxAAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (dette er den endelige omvendt oligo, der er bestilte)].
- Føj CACCG til 5'-enden af oligo.
- Bestil oligonukleotider, uden yderligere ændringer på oligonukleotider.
- Bestil den minimale mængde af oligo kræves, som kun meget små mængder er nødvendige for kloning reaktioner.
- Fortynd frysetørrede primere til en endelig koncentration på 100 μM i 1 x TE buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,5 med 1 mM EDTA).
- Alikvot 1:1 frem og bak oligonukleotider (f.eks, 10 μL hver) i PCR strip-cap rør.
Bemærk: Dette vil give mulighed for hurtig kloning af mange gRNAs ad gangen ved hjælp af en multikanalpipette.- Vortex og spin ned oligo blandinger (100 x g for 15 s). Inkuber reaktion ved stuetemperatur i 5 min før du konfigurerer ligation.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at opvarme og derefter køle oligo blandinger for at lette deres udglødning. Det er værd at bemærke, at 3-4 par gRNA oligonukleotider kan samles og udglødet i en enkelt reaktion (fx, mix 3 μL af fremad og 3 μL tilbageføre oligonukleotider sammen fra op til 4 gRNA oligo par, hvilket giver en samlet maengde paa 24 μL). Mængden af oligonukleotider anvendes til den udglødning kan tilpasses for at imødekomme en brugers behov.
Bemærk: Trin 6-7,3 beskriver predigestion af pSB700. En alternativ metode, under trin 8, som beskriver en trinvis BsmBI begrænsning ligatur.
- Vortex og spin ned oligo blandinger (100 x g for 15 s). Inkuber reaktion ved stuetemperatur i 5 min før du konfigurerer ligation.
- Fordøje 1-5 μg af den valgte pSB700 guide udtryk vektor med BsmBI (0,5 μl pr. 1 μg) i 1 time på 55 ° C15. Gennemføre fordøjelsen af pSB700 gRNA udtryk vektor i en samlet maengde paa 40 μl (tabel 1).
- Køre fordøjelsen produkter på 1,5% (wt/vol) lav-smeltende agarosegel.
- Skåret ud fordøjet vektor rygraden bandet, hvilket svarer til et fragment af ~ 9 kb i størrelse og placere gel skive i en 1,5 mL microcentrifuge røret (figur 1).
- Bruge en kommerciel gel rensning kit til at udtrække DNA fra agarosegel ifølge producentens anvisninger.
- Elueres DNA ind i 10-15 μL TE buffer (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM Tris, pH 8,0) at opnå en koncentreret eluat.
- Ligate udglødet gRNA oligonukleotider fra trin 4 i BsmBI-fordøjet pSB700 guide udtryk vektor i en 20 μL reaktion (tabel 2) for kloning af gRNA oligonukleotider i præ-fordøjet pSB700 udtryk vektor.
- Første tilføje vand, buffer, og DNA, så vortex blandingen og tilføje enzym, vortex 1 sidste gang efter tilsætning af enzymet og spin-ned løsningen (100 x g for 15 s). Inkuber reaktioner ved rumtemperatur natten over.
- Omfatte en no-Indsæt negative kontrol reaktion, der har en BsmBI-fordøjet vektor alene, uden en udglødet gRNA oligo indsætte. 1 μl vand kan bruges i stedet for gRNA oligonukleotider 1 μL for ingen Indsæt negative kontrol.
- Fortsæt til transformation (trin 9).
Bemærk: Trin 8 er en alternativ metode til predigestion af pSB700 som beskrevet i trin 6-7,3.
- Hældes pSB700 vektor ved hjælp af Golden Gate kloning for trinvis BsmBI begrænsning ligatur gRNA oligonukleotider (beskrevet i trin 1-5.1).
- Samle den master mix (1 x) — Hvis flere gRNAs er ved at blive klonet, forberede master mix uden Indsæt oligonukleotider tilføjet (tabel 3). Alikvot master mix i PCR rør og bruge en multikanalpipette til at tilføje gRNA oligonukleotider fra trin 4.2. Omfatte en no-Indsæt kontrol bruge 1 μL af vand.
- Ved at medtage BsmBI enzym og T4 DNA ligase inden for den samme reaktion, samtidige begrænsning fordøjelse og ligatur er opnået (dvs., Golden Gate kloning). Brug følgende Simple Gate protokol til at fordøje vektoren og ligate skær i 1 reaktion: holde reaktionen ved 37 ° C i 2 timer ved 50 ° C i 10 min. ved 65 ° C i 15 min. ved 80 ° C i 15 min, og endelig , hold det ved 4 ° C.
- Af note, efterprøve at oligonukleotider ikke indeholder BsmBI sites før du bruger denne metode. Hvis de gRNAs, der er ved at blive klonet indeholder BsmBI begrænsning websteder, vil de blive fordøjet ved tilsætning af BsmBI. Dette vil forhindre brugeren i at opnå nogen transformants.
- Efter den første enkle Gate reaktion, tilføje en ekstra 0,5 μl af BsmBI enzym til hver reaktion og læg dem tilbage på 55 ° C i 1 time. Efter fordøjelsen, holde reaktionen ved 4 ° C eller fryse det indtil klar til at omdanne. Denne anden runde af begrænsning enzym inkubering fjerner alle ufordøjet eller religated vildtype pSB700 vektor rygraden fra reaktionsmiljøet saa kun vektorer, der har modtaget oligo skær forblive intakt og vil give transformants.
- Fortsæt til transformation (trin 9).
- Omdanne 0,5 μl af en reaktionsblanding til 8 μL af kompetente E. coli [fxNEB DH5a (1-3 x 109 cfu/µg pUC19 DNA) eller NEB stabil 1 - 3 x 109 cfu/µg pUC19 DNA). For lentiviral plasmider, vil NEB stabil celler give mere konsekvent plasmid udbytter.
- Fjern E. coli fra opbevaring ved-80 ° C og tø det i isbad i 5-10 min.
- Tilføje 0,5 μl af mastermix til 8 μL af kompetente E. coli og holde blandingen på is i 30 min.
- Heat shock blanding på 42 ° C til 45 s.
- Hvile det på køl i 2 min.
- Genskab kultur på en orbitalryster i 250 μL af SOC medier i 1 time ved 37 ° C i NEB DH5a og ved 30 ° C til NEB stalde.
- Plade 80 μl af kultur på en passende antibiotikaresistens Lysogeny bouillon (LB) plade og inkuberes natten over ved 37 ° C i NEB DH5a og ved 30 ° C til NEB stalde [fxpSB700 er belagt på LB med ampicillin (100 μg/mL) plader] (figur 3).
- Validere sekvensen af gRNA udtryk plasmid: kontrollere rækkefølgen af hver koloni af Sanger sekventering med primer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' hvilke primtal på U6 initiativtageren opstrøms af gRNA oligo indsætte.
- Vælge 2-3 kolonier pr. reaktion for sekventering (tabel 4).
Bemærk: Flere sekventering udbydere nu tilbyde tjenester, der kan udføre Sanger sekventering direkte fra bakteriel kolonier, hvilket reducerer tid og omkostninger ved at fjerne behovet for at rense plasmider før sekvensering. Alternativt, et plasmid isolering kit kan bruges til at gendanne plasmid DNA fra de enkelte bakteriel kloner. Renset plasmider kan derefter sendes til sekvensering. Hvis en poolet ligatur reaktion er udført, skal du bruge tabel 4 som en guide for antallet af kolonier, der skal vælges og indsendt til sekvensering. - Efter sekvens bekræftelse, isolere gRNA udtryk plasmider.
- Bruge en steril pipette tip til podes den ønskede koloni i 5 mL kultur af LB medium indeholdende 100 μg/mL ampicillin for pSB700 udtryk vektorer.
- Vokse celler i en roterende inkubator ved 100 rpm ved 37 ° C natten over (30 ° C, hvis NEB stalde bliver brugt).
- Isolere plasmid DNA fra kulturer ved hjælp af en plasmid prep kit, efter producentens protokol.
Bemærk: Mens ovenstående metoder giver brugerne mulighed at oprette enkelt gRNA-holdige vektorer, denne protokol vil indrømme brugernes hen til oprette vektorer, der indeholder 2 gRNAs, hver drevet af deres egen RNA polymerase III promotor.
- Vælge 2-3 kolonier pr. reaktion for sekventering (tabel 4).
- Om parret gRNA design, bruge filen fra sgRNA designværktøjer skitseret ovenfor (trin 1.1-1.4) og vælg 2 guides af interesse.
- For en aktivering eller undertrykkelse, vælge par af guider, der er mindst 30 nt fra hinanden.
- Vælg guider, der er målrettet 2 forskellige exons i genet for gRNAs bruges til at skære.
- Vejledningen nedenfor, udpege de første gRNA i matrixen gRNA-A og den anden gRNA i array gRNA-B, til at oprette en parvis gRNA oligonukleotid sekvensen ændring.
Bemærk: Oligo bruges til at oprette gRNA-A vil blive kaldt fA, og den omvendte oligo bruges til at indføre gRNA-B vil blive omtalt som rB. Metoden kloning nedenfor tilføjer automatisk en igangsættende G 5' slutningen af hver af gRNAs.- Oprette passende fA oligo som følger.
Bemærk: De 20 nukleotider bestående af gRNA målretning sekvens for gRNA-A vil udgøre den første fA sekvens, som de følgende skridt vil bygge (f.eks.protospacer - aggggctacaccactcattg).- Føj TTTTCGTCTCTCACCG til 5'-enden af fA (f.eks.af sekvens TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg).
- Føj GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA til 3'-enden af fA (f.eks.af sekvens TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Dette er den endelige version af fA oligo, der vil blive bestilt.
- Opret de nødvendige rB oligo som følger.
Bemærk: De 20 nukleotider bestående af gRNA målretning sekvensen for gRNA-B vil udgøre den første rB sekvens, som de følgende skridt vil bygge (f.eks.af den første sekvens gtcccctccaccccacagtg).- Tage den omvendte supplement af rB = (revcom) rB (fx, cactgtggggtggaggggac).
- Føj TTTTCGTCTCTAAAC til 5'-enden af (revcom) rB (fx., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac).
- Føj CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG til 3'-enden af (revcom) rB (f.eks.TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Dette er den endelige version af rB oligo, der vil blive bestilt.
Bemærk: følgende formler kan bruges med fælles regneark software automatisk redigere oligo sekvenser: = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTCACCG",(A2), "GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA"), hvor A2 er den celle, der indeholder fA sekvens, og = Concatenate("TTTTCGTCTCTAAAC",(B2),"CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG"), hvor B2 er den celle, der indeholder (revcom) rB sekvens.
- Oprette passende fA oligo som følger.
- Bestil oligonukleotider fra en syntese leverandør af valg. Ingen yderligere ændringer er nødvendige.
- Brug de forberedte plasmid DNA til at udføre PCR med både fA og rB primere. Dette vil lægge både fremad og de omvendte gRNAs til PCR fragment genereret fra denne plasmid og vil tillade hver skal udtrykkes fra sin egen promoter (U6 og 7SK projektledere — forskellige projektledere er brugt i dette design for at forhindre virale rekombination).
- Brug Phusion GC særlige PCR-protokol til at oprette de nødvendige fragment: holde blandingen på 98 ° C i 1 min. (1 cyklus), på 98 ° C i 15 s på 53 ° C i 15 s, ved 65 ° C i 2 min. og ved 72 ° C i 4 min (30 cykler) , og derefter holde det ved 4 ° C (tabel 5).
- Køre PCR produkt på en 1%-agarosegel og kontrollere, at 1 band er set på ~ 490 bp (figur 2).
- Skære og udtrække denne PCR produkt ved hjælp af en gel udvinding sæt af valg. Elueres DNA i 15 μL TE buffer (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM Tris, pH 8,0) eller destilleret vand.
- Mål koncentrationen af den udpakkede produkt sammen med, at af vektoren, pSB700 med et spektrofotometer til DNA molariteten beregne. Normalisere både PCR produkt og vektor til en koncentration af 40 femtomoles/μL.
Bemærk: Flere hjemmesider er klar til at hjælpe med at beregne molariteten af en given DNA løsning baseret på længden af DNA og dets koncentration i opløsning (f.eks.Promega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). Regnemaskinen bruger formlen:
Her, er N længden af nucleotidsekvensen.
- Oprette en samtidige begrænsning fordøjelse og ligatur reaktion ved hjælp af den protokol, der er skitseret i trin 8-8,4 for at klone PCR fragment i en pSB700 vektor.
- I stedet for at tilføje 1 μL af primer løsning til reaktionen, tilføje 1 μL af 40 fmole/μL af PCR-produktet. Derudover bruge 1 μL pSB700 vektor i en koncentration på 40 fmole/μL.
Bemærk: Samme molære forhold føre til konsistente resultater, selv selv i tilfælde, hvor nøjagtige nøgletal ikke er anvendes kolonier kan opnås.
- I stedet for at tilføje 1 μL af primer løsning til reaktionen, tilføje 1 μL af 40 fmole/μL af PCR-produktet. Derudover bruge 1 μL pSB700 vektor i en koncentration på 40 fmole/μL.
- Efter at have afsluttet Golden Gate reaktion processen (trin 8-8.4), fortsætte på transformation og sekvens verifikation (trin 9 - 10.2.3).
Representative Results
De metoder, der er skitseret i denne protokol er oprettelsen af enten enkelt eller parret gRNA udtryk vektorer. Enkelt gRNA udtrykker vektorer kan være lavet af enten predigesting vektor rygraden (figur 1) efterfulgt af ligating det i en række korte oligonukleotider eller ved hjælp af Golden Gate kloning for at samtidig fordøje vektor rygraden og ligate det i en række korte oligonukleotider i en enkelt reaktion. Også er en metode til fremstilling af vektorer, der indeholder 2 gRNAs, hver drevet af sin egen uafhængige promotor, ved kloning en brugerdefineret PCR fragment (figur 2).
En vellykket kloning for nogen af de skitserede protokoller vil resultere i fremkomsten af betydeligt flere kolonier for transformationer med passende Indsæt DNA end på ingen Indsæt kontrol plade (figur 3).
Figur 1: fordøjelsen af en pSB700 gRNA udtryk vektor. 1% agarosegel bruges. Lane 1: uncut pSB700. Lane 2: pSB700 cut med BsmBI.
Figur 2: parret gRNA PCR. 1% agarosegel bruges. Lane 1: en parret guide PCR fragment af ~ 490 bp.
Figur 3: vellykket kloning og transformation af en gRNA plasmid. Panelet til venstre viser en LB og ampicillin plade med held omdannes kolonier. Højre panel viser en no-Indsæt kontrol plade viser ingen kolonier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| pSB700 guide udtryk vektor | 1-5 μg |
| NEB Buffer 3.1 | 4 ΜL |
| BsmBI | 1 ΜL |
| Destilleret vand | op til 40 μl |
| Samlede volumen | 40 ΜL |
Tabel 1: Begrænsning fordøjelsen af en pSB700 gRNA udtryk vektor med BsmBI.
| Udglødet gRNA oligos (enten enkelt eller samlet reaktion) | 1 ΜL |
| BsmBI-fordøjet pSB700 guide udtryk vektor | 1 μL (~ 100-250 ng) |
| 10 x T4 DNA Ligase reaktion Buffer | 2 μl (1 x endelige koncentration) |
| T4 DNA Ligase | 1 μL (120 enheder) |
| Destilleret vand | 15 ΜL |
| Samlede volumen | 20 μl |
Tabel 2: En ligatur reaktion gRNA oligonukleotider til en predigested pSB700 gRNA udtryk vektor.
| Reagens | Volumen (1 x) |
| H2O | 6 ΜL |
| T4 Ligase | 0,5 ΜL |
| ATP | 1 ΜL |
| BsmBI | 0,5 ΜL |
| NEB Buffer 3.1 | 1 ΜL |
| Vektor (fx, pSB700) (40 fmol) | 1 μlL |
| Indsæt - frem og bak oligos eller PCR fragment af dobbelt guide (40fmol) | 1 μL (0,5 μL frem og 0,5 μL omvendt) |
Tabel 3: En trinvis BsmBI begrænsning og gRNA ligatur reaktion mix.
| For 1 guide | sekvens 3 kolonier |
| 2 guider | sekvens 5-10 kolonier |
| 3 guider | sekvens 10-15 kolonier |
| For 4 guides | sekvens 15-20 kolonier |
Tabel 4: Anbefalede antallet af kolonier til sekvensen for poolede gRNA kloning reaktioner.
| PCR komponent | 50 µL reaktion |
| 10 µM fremad Primer | 2,5 ΜL |
| 10 µM omvendt Primer | 2,5 ΜL |
| 5 x Phusion HF eller GC Buffer | 10 ΜL |
| 10 mM dNTP'er | 1 ΜL |
| DNA-Template | 100 ng |
| Phusion DNA Polymerase | 0,5 ΜL |
| Nukleasen-frit vand | Op til 50 µL |
Tabel 5: En parret gRNA PCR blanding.
Discussion
En række af tid - og omkostningsbesparende ændringer er foretaget gRNA udtryk vektor konstruktion. En enkelt-trins begrænsning og ligatur protokol er skitseret samt en metode til parret gRNA udtryk vektor byggeri. Parret gRNA udtryk er opnået gennem en PCR-amplifikation ved hjælp af oligonukleotider indeholdende både en forward gRNA target sekvens (n20) og den omvendte supplement af et andet mål (n20). Dette indfører derefter en sekundær RNA Pol III promotor (7SK) samt en sgRNA hale i konventionelt udtrykker enkelt gRNA udtryk plasmider.
En omhyggelig oligonukleotid design sikrer en vellykket PCR for parret gRNA byggeri samt en klæbrig-ende ligatur. Efter trinvis begrænsning og ligatur reaktion, tilføjelse af yderligere BsmBI vil sikre alle umodificeret udtryk vektorer i reaktionen er skåret. Dette vil reducere baggrund ved omdannelsen. Ved hjælp af NEB-stabil kompetente E. coli og en vækst på 30 ° C vil øge udbyttet af en vellykket transformation.
De fordele, denne teknik har over fælles praksis omfatter en forenkling af processen med oligonukleotid udglødning, en enkelt-trins begrænsning af gRNA udtryk vektor og ligatur af oligonukleotider og evnen til at udnytte konventionelle enkelt gRNA udtryk vektorer for udtryk for parret guider. Mens protokollen beskrevet her fokuserer på et sæt af pattedyr vektorer, den generelle strategi er plast og gælder for enhver organisme, forudsat at passende gRNA vektor er tilgængelige. Samlet set sparer protokollen beskrevet tid og omkostninger.
Dog skal det bemærkes, at den skitserede procedure for at købe enkelte oligonukleotider ikke skalerer godt for generation af biblioteker, der indeholder tusindvis af gRNAs. Til disse formål anbefales alternative kilder af oligonukleotid syntese som oligo chip syntese.
Det er gavnligt at medtage ingen Indsæt kontrolelement Når kloning gRNAs. Denne reaktion kan være nemt indstille parallelt med reaktioner af interesse og kan bruges til at bestemme, om en ufuldstændig fordøjelse af den begyndende vektor har bidraget til kolonierne observeret i slutningen af proceduren. Desuden, hvis en af de ovenstående kloning protokoller har mislykkedes på grund af et utilstrækkeligt fordøjet vektor rygraden eller dårlig ligatur effektivitet, vi foreslå at prøve alternativ kloning metode vi har skitseret.
Når du bruger Golden Gate kloning for at fordøje vektoren og ligate i de lille oligonukleotider inden for en enkelt reaktion samtidig, er det vigtigt at kontrollere, at den gRNA, der er ved at blive klonet i vektoren ikke har et BsmBI websted inde i det, da dette vil føre til t han gRNA skæres og fravær af kolonier ved transformation.
GRNA kloning strategi vi har skitseret giver mulighed for en hurtig og omkostningseffektiv generation af gRNAs på ~ 10 US dollars pr. guide, med hovedparten af udgifterne kommer fra oligonukleotid syntese og sekvens verifikation. Mens den skitserede metode er designet til at tillade brugere at generere gRNAs til brug med SpCas9, protokollen let kan tilpasses til brug med Cas9 orthologues eller andre RNA-styrede endonucleases såsom Cpf1 eller C2C2, med mindre ændringer til vector rygraden og den oligonukleotid overhæng sekvenser16,17.
Den protokol, der er skitseret ovenfor vil give sekvens-verificerede gRNA udtryk plasmider i 3 d (begyndende med korrekt designet oligonukleotider), hvilket er væsentligt hurtigere end nuværende metoder. Dette omfatter gRNA design 1 h (trin 1-2.3), fortynding og alikvot af oligonukleotider af 10 min (trin 3-5.1), fordøjelse og rensning af pSB700 gRNA udtryk vektor af 2 h (skridt 6-6.4), kloning af gRNA oligonukleotider i en predi omatisk pSB700 gRNA udtryk vektor natten over ved stuetemperatur (trin 7-7.3), trinvis BsmBI begrænsning ligatur af 3 timer og 40 min (trin 8-8.4), omdannelse af 16 h (trin 9-9.6) og validering af rækkefølgen af gRNA udtryk plasmid af 24 timer (med varighed afhængig af sanger sekventering tilgængelighed og hastighed efter indgivelse af den bakterielle koloni; trin 10). Parret gRNA design og sekvens ændring tager 1t (trin 11-13). Den parrede gRNA PCR tager 3,5 h (trin 14-14.4). Kloning af PCR fragment i en pSB700 vektor tager 3 timer og 40 min (trin 15-16).
De mest sandsynlige problemer, der kan blive konfronteret med denne protokol vedrører ineffektivitet i Golden Gate forsamling og transformation. Omfatte ingen Indsæt kontrolelement under Golden Gate forsamlingen til at visualisere effektiviteten af forsamlingen. Under omdannelsen, vil puc19 positive kontrol giver en transformation effektivitet kontrol. NEB-stabil E. coli bør anvendes til lentiviral kompatibel plasmider og ofte kræver op til > 16 h ved 30 ° C til at give synlige kolonier.
Disclosures
George M. Church har egenkapital i Editas og Caribou Biosciences, som har til formål at kommercialisere CRISPR-Cas9 genom-redigering teknologi (for en fuld offentliggørelse liste, se venligst http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html).
Acknowledgments
Sathiji Nageshwaran er støttet af Friedreichs ataksi Research Alliance (07340305 - 01) og nationale ataksi Foundation stipendier (7355538-01). Alejandro Chavez blev finansieret af National Cancer Institute tildeling 5T32CA009216-34 og Burroughs Wellcome fond karriere Award for medicinske forskere. George M. Church er understøttet af den amerikanske National Institutes of Health (NIH) National Human Genome Research Institute grant RM1 HG008525 og Wyss Institut for biologisk inspirerede Engineering. James J. Collins anerkender støtte fra Defense trussel reduktion Agency grant HDTRA1-14-1-0006 og Paul G. Allen grænser gruppe. Alejandro Chavez udviklet metoden dual-guide kloning. Sathiji Nageshwaran, Alejandro Chavez og Nan Cher Yeo skrev manuskriptet med input fra alle forfattere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
| Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
| Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
| UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
| pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
| Lysogeny broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) | |||
| pSN007 plasmid | Addgene | 102440 |
References
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J., Charpentier, E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., Sanjana, N., Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 299-311 (2015).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Gilbert, L., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Yang, L., Yang, J., Byrne, S., Pan, J., Church, G. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. , 31.1.1-31.1.17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., Gersbach, C. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4 (1), (2014).
- Chari, R., Yeo, N., Chavez, A., Church, G. sgRNA Scorer 2.0: A Species-Independent Model To Predict CRISPR/Cas9 Activity. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 902-904 (2017).
- Doench, J., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2014).
- The CRISPR Software Matchmaker: A New Tool for Choosing the Best CRISPR Software for Your Needs. , Available from: http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs (2015).
- Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate Cloning. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. , Humana Press. New York, NY. 119-131 (2013).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).
